HER2 IQFISH pharmDx - agilent.com · Principio della procedura ... Il materiale elencato qui di...

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HER2 IQFISH pharmDx Codice K5731

Quarta edizione

HER2 IQFISH pharmDx è un saggio di ibridazione in situ in fluorescenza diretta (FISH) per la determinazione quantitativa dell’amplificazione del gene HER2 in tessuti di carcinoma mammario fissati in formalina, inclusi in paraffina (FFPE) e campioni FFPE da pazienti con adenocarcinoma dello stomaco, inclusa la giunzione gastro-esofagea.

Il saggio intende essere di utilità unitamente all’HercepTest™ nella valutazione dei pazienti che possono trarre vantaggio dalla terapia con Herceptin™.

Il kit contiene i reagenti sufficienti per 20 test.

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Sommario Pagina Finalità d’uso ..................................................................................................................... 4 Cenni introduttivi - Mammella ........................................................................................... 5 Principio della procedura - Mammella ............................................................................... 5 Reagenti - Mammella ........................................................................................................ 5

Materiali forniti .............................................................................................................. 5 Materiale necessario ma non fornito ............................................................................ 7

Precauzioni - Mammella ................................................................................................... 7 Conservazione - Mammella ............................................................................................ 11 Specimen preparation (Allestimento tessuto) - Mammella.............................................. 11

Sezioni incluse in paraffina ......................................................................................... 11 ISTRUZIONI PER L’USO - Mammella ............................................................................ 12 A. Preparazione dei reagenti - Mammella ....................................................................... 12

A.1 Soluzione di pretrattamento ................................................................................. 12 A.2 Tampone di lavaggio di stringenza ...................................................................... 12 A.3 Tampone di lavaggio ............................................................................................ 12 A.4 Serie di etanolo .................................................................................................... 12 A.5 Soluzione pepsina ................................................................................................ 12

B. Procedura di colorazione - Mammella ........................................................................ 13 B.1 Note sulla procedura ............................................................................................ 13 B.2 Trattamento dei tessuti prima della colorazione .................................................. 13 B.3 Protocollo di colorazione ...................................................................................... 14

Controllo di qualità - Mammella ...................................................................................... 18 Interpretazione della colorazione - Mammella ................................................................ 18 Limitazioni - Mammella ................................................................................................... 20 Caratteristiche prestazionali - Mammella ........................................................................ 20

Sensibilità analitica ..................................................................................................... 20 Specificità analitica ..................................................................................................... 20 Studi di resistenza ...................................................................................................... 20 Ripetibilità ................................................................................................................... 22 Riproducibilità ............................................................................................................. 22 Utilità clinica ............................................................................................................... 22

Risoluzione dei problemi - Mammella ............................................................................. 26 Appendice 1 - Mammella ................................................................................................ 28 Appendice 2 - Mammella ................................................................................................ 30 Appendice 3 - Mammella ................................................................................................ 31 Cenni introduttivi - Gastrico ............................................................................................. 32 Principio della procedura - Gastrico ................................................................................ 32 Reagenti - Gastrico ......................................................................................................... 32

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Materiali forniti ............................................................................................................ 32 Materiale necessario ma non fornito .......................................................................... 34 Apparecchiatura per microscopia e accessori ............................................................ 34

Precauzioni - Gastrico ..................................................................................................... 35 Conservazione - Gastrico ............................................................................................... 37 Specimen preparation (Allestimento tessuto) - Gastrico ................................................. 38

Sezioni incluse in paraffina ......................................................................................... 38 ISTRUZIONI PER L’USO - Gastrico ............................................................................... 39 A. Preparazione dei reagenti - Gastrico .......................................................................... 39

A.1 Soluzione di pretrattamento ................................................................................. 39 A.2 Tampone di lavaggio di stringenza ...................................................................... 39 A.3 Tampone di lavaggio ............................................................................................ 39 A.4 Serie di etanolo .................................................................................................... 39 A.5 Soluzione pepsina ................................................................................................ 39

B. Procedura di colorazione - Gastrico ........................................................................... 40 B.1 Note sulla procedura ............................................................................................ 40 B.2 Trattamento dei tessuti prima della colorazione .................................................. 40 B.3 Protocollo di colorazione ...................................................................................... 41

Controllo di qualità - Gastrico .......................................................................................... 44 Interpretazione della colorazione - Gastrico ................................................................... 44 Limitazioni - Gastrico ...................................................................................................... 47 Caratteristiche prestazionali - Gastrico ........................................................................... 47

Sensibilità analitica ..................................................................................................... 49 Specificità analitica ..................................................................................................... 49 Studi di resistenza ...................................................................................................... 49 Ripetibilità ................................................................................................................... 51 Riproducibilità ............................................................................................................. 51 Utilità clinica ............................................................................................................... 51

Risoluzione dei problemi - Gastrico ................................................................................ 52 Appendice 4 - Gastrico ................................................................................................... 54 Appendice 5 - Gastrico ................................................................................................... 56 Appendice 6 - Gastrico ................................................................................................... 58 Appendice 7 - Gastrico ................................................................................................... 59 Bibliografia ...................................................................................................................... 60 Spiegazione dei simboli .................................................................................................. 62

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Finalità d’uso Per uso diagnostico in vitro. HER2 IQFISH pharmDx è un saggio di ibridazione in situ (FISH) a fluorescenza diretta, progettato per determinare quantitativamente l’amplificazione del gene HER2 in tessuti tumorali mammari fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) e campioni FFPE da pazienti con adenocarcinoma dello stomaco, inclusa la giunzione gastro-esofagea.

Il kit HER2 IQFISH pharmDx intende essere di utilità nella valutazione, unitamente all’HercepTest™, dei pazienti che possono trarre vantaggio dalla terapia con Herceptin™ (trastuzumab) (vedere il foglietto illustrativo dell’Herceptin™).

Per i pazienti con cancro mammario, i risultati di HER2 IQFISH pharmDx sono pensati come ausilio alle informazioni clinicopatologiche attualmente usate per stimare la prognosi in pazienti con cancro mammario linfonodo-posistivo allo stadio II. In questo documento, l’adenocarcinoma gastrico con giunzione gastroesofagea viene chiamato anche cancro gastrico. Per applicazione per cancro mammario, fare riferimento alle pagine 5-31. Per applicazione per cancro gastrico, fare riferimento alle pagine 32-59. Importante: si notino le differenze fra il tessuto di cancro alla mammella e il tessuto di cancro gastrico, specialmente all’interno delle sezioni di Interpretazione della colorazione.

Cancro mammario

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Cenni introduttivi - Mammella Il gene umano HER2 (noto anche come ERBB2 o NEU) è localizzato sul cromosoma 17 e codifica la proteina indicata come HER2 o p185HER2. La proteina HER2 è un recettore di transmembrana ad attività tirosin-chinasica con omologia per il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR o HER1) (1-2). Il gene HER2 è presente in 2 coppie in tutte le cellule diploidi normali. Una percentuale dei pazienti affetti da carcinoma mammario presenta una amplificazione del gene HER2, come parte del processo di trasformazione maligna e di avanzamento del tumore (3-8). L’amplificazione del gene HER2 porta generalmente all’iperespressione della proteina HER2 sulla superficie delle cellule tumorali (9).

L’amplificazione del gene HER2 e/o l’iperespressione della proteina corrispondente è stata dimostrata nel 25–30% dei carcinomi mammari. L’up-regulation è associata a scarsa prognosi, aumentato rischio di ricorrenza e diminuzione della sopravvivenza. Numerosi studi hanno dimostrato che lo stato dell’HER2 è correlato alla sensibilità o alla resistenza ad alcune terapie chemioterapiche (10).

La dimostrazione dell’elevata iperespressione della proteina HER2 o dell’amplificazione del gene HER2 è essenziale per intraprendere la terapia a base di Herceptin™, un anticorpo monoclonale anti-proteina HER2. Studi clinici hanno dimostrato che la terapia a base di Herceptin™ porta il maggiore beneficio ai pazienti il cui tumore presenta un’elevata iperespressione della proteina HER2 e/o amplificazione del gene HER2 (11).

Principio della procedura - Mammella HER2 IQFISH pharmDx contiene tutti i reagenti necessari per la completa esecuzione di una procedura FISH su campioni di sezioni tissutali fissate in formalina, incluse in paraffina.

Dopo la sparaffinatura e la reidratazione, i campioni sono riscaldati in soluzione di pretrattamento seguita da digestione proteolitica usando pepsina. Dopo le fasi di riscaldamento e pretrattamento protelitico, il kit impiega una miscela di sonde IQISH non tossica (12) pronta per l’uso, basata su una combinazione di tecnologia di PNA (acido peptidil nucleico) e di DNA. La miscela di sonde consiste di una soluzione di sonde di DNA marcate con Texas Red che coprono una regione di 218 kb, in cui è incluso il gene HER2 sul cromosoma 17, ed una miscela di sonde di PNA marcate con fluoresceina e dirette alla regione centromerica del cromosoma 17 (CEN-17). L’ibridazione specifica ai due siti bersaglio porta alla formazione di un segnale fluorescente rosso caratteristico in corrispondenza di ciascun locus del gene HER2 e ad un segnale fluorescente caratteristico in corrispondenza di ciascun centromero del cromosoma 17. Dopo un lavaggio di stringenza, i campioni sono montati con un mezzo di montaggio per fluorescenza contenente DAPI e coperti con vetrino coprioggetto. L’uso di un microscopio a fluorescenza dotato di filtri appropriati (vedi Appendice 3) consente di localizzare le cellule tumorali e di eseguire il conteggio dei segnali rossi (HER2) e verdi (CEN-17). Viene quindi calcolato il rapporto HER2/CEN-17. Le cellule normali nella sezione tissutale analizzata vengono utilizzate come controllo positivo interno dell’efficacia del pretrattamento e dell’ibridazione. Per informazioni, fare riferimento alla sezione “Interpretazione della colorazione”.

Per un corso di e-learning interattivo, usare il programma di e-learning HER2 IQFISH pharmDx progettato per fornire ai tecnici di laboratorio, patologi e scienziati informazioni accurate e precise su come ottenere risultati ottimali con HER2 IQFISH pharmDx: www.dako.com

Reagenti - Mammella

Materiali forniti Il materiale elencato qui di seguito è sufficiente per l’esecuzione di 20 test (un test viene definito come una area bersaglio pari a 22 mm x 22 mm). Il numero di test si basa sull’uso di 250 µL per vetrino di fiala 2A (5-8 gocce), 10 µL per vetrino di fiala 3 e 15 µL per vetrino di fiala 5. Le soluzioni nella Fiala 3 e nella Fiala 5 sono viscose e potrebbero dover essere centrifugate brevemente in una microcentrifuga per raccogliere tutto il reagente fornito.

Cancro mammario

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Questo kit fornisce materiali sufficienti per un massimo di 10 cicli di colorazione singoli (quattro cicli separati quando si utilizza il metodo di immersione in pepsina). HER2 IQFISH pharmDx è spedito su ghiaccio secco. Per verificare che i componenti del kit non siano stati esposti a temperature elevate durante il trasporto, accertarsi che vi sia ancora ghiaccio secco al momento della consegna. Si fa presente che alcuni componenti del HER2 IQFISH pharmDx possono rimanere non congelati, senza che questo ne alteri la prestazione.

Fiala 1

Soluzione di pretrattamento (20) 150 mL, concentrato 20 Tampone MES (acido 2-[N-morfolino]etansolfonico).

Fiala 2A Fiala 2B

Pepsina 4 x 6,0 mL, pronta all’uso Soluzione di pepsina, a pH 2,0, contenente uno stabilizzante ed un agente antimicrobico.

Diluente pepsina (10x) 24 mL, concentrato 10x Tampone di diluizione, a pH 2,0, contenente un agente antimicrobico.

Fiala 3 Miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH 0,2 mL, pronta per l’uso Miscela di sonde di DNA per HER2 marcate con Texas Red e di sonde di PNA per CEN-17 marcate con fluoresceina; fornite in tampone di ibridazione IQISH.

Fiala 4 Stringent Wash Buffer (20x) 150 mL, concentrato 20 Tampone SSC (soluzione salina di citrato di sodio) con detergente (Tween-20).

Fiala 5 Mezzo di montaggio a fluorescenza 0,4 mL, pronta per l’uso Mezzo di montaggio fluorescente con DAPI 500 µg/L (4’,6-diamidina-2-fenilindolo).

Fiala 6 Tampone di lavaggio (20) 500 mL, concentrato 20 Tampone Tris/HCl.

Collante coprioggetto 1 tubo, pronto per l’uso Soluzione per sigillare in modo non permanente i coprioggetto.

Cancro mammario

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NOTA: I reagenti del kit seguenti: soluzione di pretrattamento (20x), pepsina, diluente pepsina (10x), tampone stringente (20x), mezzo di montaggio a fluorescenza, tampone di lavaggio (20x) e collante coprioggetto sono intercambiabili con i reagenti corrispondenti nel Dako Histology FISH Accessory Kit, Codice K5799.

Materiale necessario ma non fornito Reagenti da laboratorio Acqua distillata o deionizzata Etanolo, 96% Xilene o derivati dello xilene

Apparecchiatura da laboratorio Garze assorbenti Pipette regolabili Termometro calibrato a immersione parziale (per temperature tra 37 e 100 °C) Termometro calibrato da superficie (per temperature tra 37 e 100 °C) Coprioggetto (22 mm x 22 mm) Pinzette Cappa aspirante Dako Hybridizer (codice S2450 o S2451) Piastra di riscaldamento o forno di ibridazione* Camera umida di ibridazione* Microcentrifuga Vetrini, Dako Silanized Slides codice n. S 3003, oppure polilisinati (vedi “Preparazione dei campioni”) Vaschette o bagni per la colorazione Contaminuti (per intervalli di 2–15 minuti) Miscelatore Vortex Bagnomaria con coperchio (in grado di mantenere una temperatura tra 37(±2) °C, 63 (±2) °C e da 95 °C a 99 °C)

Forno a microonde con funzione di rilevazione, se il pretrattamento viene eseguito utilizzando un forno a microonde (vedere B3. Protocollo di colorazione. Fase 1: Metodo di pretrattamento, metodo B)

* Blocco termico o forno di ibridazione per la denaturazione (66 (±1) °C) e l’ibridazione (45 (±2) °C) unitamente a una camera umida da usare in alternativa a Dako Hybridizer.

Apparecchiatura per microscopia e accessori Filtri per microscopio a fluorescenza: doppio filtro DAPI e FITC/Texas Red, oppure monofiltri FITC e Texas Red. Per informazioni, vedi Appendice 3.

Si consiglia l’uso di un microscopio a fluorescenza con lampada al mercurio da 100 watt come fonte luminosa. Altre fonti luminose non sono raccomandate con questi filtri. Raccoglitore per vetrini (contenitore di cartone per 20 vetrini, con chiusura a cerniera o simile).

Precauzioni - Mammella 1. Per uso diagnostico in vitro. 2. Per uso professionale. 3. Il flacone 1, Soluzione di pretrattamento (x 20), non richiede etichettatura di pericolo. Su

richiesta è disponibile una scheda di sicurezza per utenti professionisti.

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4. Il flacone 2A, Pepsin, contiene ≥5-<10% propan-2-ol, ≥0.1-<0.3% pepsina A e ≥0.011-<0.1% 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one e 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Il flacone 2A è etichettata:

Pericolo H314 Provoca gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. H317 Può provocare una reazione allergica cutanea. P280 Indossare guanti protettivi. Fare uso di un dispositivo di

protezione degli occhi o del viso. Indossare indumenti protettivi.

P304 + P340 + P310 IN CASO DI INALAZIONE: Trasportare l’infortunato all’aria aperta e mantenerlo a riposo in posizione che favorisca la respirazione. Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico.

P301 + P310 + P331 IN CASO DI INGESTIONE: Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico. NON provocare il vomito.

P303 + P361 + P353 + P310

IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE (o con i capelli): Togliere immediatamente tutti gli indumenti contaminati. Sciacquare la pelle/fare una doccia. Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico.

P305 + P310 IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico.

P405 Conservare sotto chiave. P501 Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le

normative locali, regionali, nazionali e internazionali. 5. Il flacone 2B, Pepsin Diluent (10x), contiene ≥50-<75% propan-2-ol e ≥5-<10% 2-amino-2-

(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Il flacone 2B è etichettata:

Pericolo H225 Liquido e vapori facilmente infiammabili. H319 Provoca grave irritazione oculare. H336 Può provocare sonnolenza o vertigini. P280 Indossare guanti protettivi. Proteggere gli occhi/il viso. P210 Tenere lontano da fonti di calore, superfici calde, scintille,

fiamme libere o altre fonti di accensione. Non fumare. P241 Utilizzare impianti elettrici, di ventilazione, d’illuminazione e

per la movimentazione dei materiali a prova di esplosione. P304 + P340 IN CASO DI INALAZIONE: trasportare l’infortunato all’aria

aperta e mantenerlo a riposo in posizione che favorisca la respirazione.

P303 + P361 + P353 IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE (o con i capelli): Togliere immediatamente tutti gli indumenti contaminati. Sciacquare la pelle/fare una doccia.

P235 Conservare in luogo fresco. P501 Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le

normative locali, regionali, nazionali e internazionali. 6. Il flacone, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, contiene ≥10-<25% ethylene carbonate e ≥3-

<5% sodium chloride. Il flacone 3 è etichettata:

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Attenzione H319 Provoca grave irritazione oculare. P280 Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del

viso. P264 Lavarsi accuratamente le mani dopo l’uso. P305 + P351 + P338 IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare

accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare.

7. Il flacone 4, Stringent Wash Buffer (20x), contiene ≥10-<25% sodium chloride, e ≥10-<20% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Il flacone 4 è etichettata:

Attenzione H319 Provoca grave irritazione oculare. H315 Provoca irritazione cutanea. P280 Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del



8. Il flacone 6, Wash Buffer (20x), contiene ≥10-<25% sodium chloride e ≥10-<20% trometamolo. Il flacone 6 è etichettata:

Attenzione H319 Provoca grave irritazione oculare. H315 Provoca irritazione cutanea. P280 Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del viso. P264 Lavarsi accuratamente le mani dopo l’uso. P305 + P351 + P338 IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare


9. Elemento 7, Coverslip Sealant, contiene il 100% di nafta (petrolio), frazione leggera di “hydrotreating” e è etichettata:

Pericolo H225 Liquido e vapori facilmente infiammabili. H304 Può essere letale in caso di ingestione e di penetrazione nelle

vie respiratorie. H411 Tossico per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata. P280 Indossare guanti protettivi. Proteggere gli occhi/il viso. P210 Tenere lontano da fonti di calore, superfici calde, scintille,


per la movimentazione dei materiali a prova di esplosione. P273 Non disperdere nell’ambiente.

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P303 + P361 + P353 IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare.


normative locali, regionali, nazionali e internazionali. 10. I campioni, prima e dopo la fissazione, e tutti i materiali esposti ad essi devono essere

manipolati come potenziali vettori di infezione e smaltiti con le opportune precauzioni (16). Non pipettare mai i reagenti con la bocca ed evitare che reagenti e campioni entrino in contatto con la pelle e le membrane mucose. Se i reagenti entrano in contatto con aree sensibili, lavare con abbondante acqua corrente.

11. Minimizzare la contaminazione microbica dei reagenti per evitare risultati errati. 12. Rispettare i tempi, le temperature e le modalità di incubazione specificati per evitare artefatti. 13. Metodi di fissazione tissutale e uno spessore del campione diversi da quelli specificati

possono alterare la morfologia dei tessuti e/o l’intensità dei segnali. 14. Per evitare l’evaporazione della miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH durante l’ibridazione,

assicurare una umidità sufficiente nella camera di ibridazione. 15. I reagenti sono stati diluiti in modo ottimale. Ulteriori diluizioni possono causare perdita di

prestazione. 16. Indossare dispositivi di protezione individuale appropriati per evitare il contatto con gli occhi e

con la pelle. Per ulteriori informazioni, fare riferimento alla scheda di sicurezza dei materiali (Safety Data Sheet, SDS) corrispondente.

17. Solo vaschette pulite di colorazione devono essere usate per il metodo di immersione in pepsina (Fase 2. Metodo C).

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Conservazione - Mammella Conservare la miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH (Fiala 3) a -18 °C al buio. Tutti gli altri reagenti possono essere conservati a 2–8 °C al buio. Tutti i reagenti tollerano la conservazione congelati. Il congelamento e lo scongelamento dei reagenti per un massimo di 10 volte non ne influenza la prestazione. La pepsina, la miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH e il mezzo di montaggio per fluorescenza (fiale 2A, 3 e 5) possono risultare alterati se esposti a calore. Non lasciare questi componenti a temperatura ambiente. La miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH e il mezzo di montaggio per fluorescenza (fiale 3 e 5) possono risultare alterati se esposti a luce intensa. Non conservare questi componenti né eseguire l’analisi in condizioni di luce intensa, come per esempio la luce solare diretta. Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza stampata sulla confezione del kit. Se i reagenti sono conservati in condizioni diverse da quelle specificate nel presente inserto della confezione, l’utente deve verificarne la prestazione (14). Non sono stati osservati segni evidenti che suggeriscano l’instabilità di questo prodotto; Pertanto, è importante esaminare cellule normali nella sezione tissutale analizzata. Se si dovesse osservare un pattern di fluorescenza inatteso non attribuibile a modifiche delle procedure di lavoro e si sospetta un problema relativo al kit HER2 IQFISH pharmDx, contattare il Customer Support.

Specimen preparation (Allestimento tessuto) - Mammella I campioni ottenuti con biopsie, escissioni o resezioni devono essere manipolati in modo tale da preservare il tessuto per l’analisi FISH. Utilizzare per tutti i campioni i metodi standard per la colorazione immunoistochimica (15).

Sezioni incluse in paraffina Sono idonei per l’uso in questo test solamente i tessuti preservati in formalina tamponata neutra e inclusi in paraffina. Per esempio, i campioni devono essere bloccati in uno spessore di 3 o 4 mm e fissati per 18–24 ore in formalina tamponata neutra. I tessuti vengono successivamente disidratati attraverso il passaggio in una serie di etanolo e xilene e sottoposti ad infiltrazione di paraffina fusa ad una temperatura non superiore a 60 °C. I tessuti sottoposti a fissazione e inclusione in modo corretto preservano la loro morfologia a tempo indeterminato prima del taglio delle sezioni e del montaggio su vetrino, se conservati in luogo fresco (15–25 °C) (15-16). Altri fissativi non sono adatti. I campioni di tessuto devono essere tagliati in sezioni di 4–6 µm. I vetrini necessari per l’analisi dell’amplificazione del gene HER2 e la conferma della presenza tumorale devono essere preparati contemporaneamente. Si consiglia di preparare almeno due sezioni seriali, una sezione per la presenza del tumore colorata con ematossilina ed eosina (colorazione “HE”) e l’altra per l’analisi dell’amplificazione del gene HER2. Si raccomanda di montare le sezioni tissutali su Dako Silanized Slides, codice S3003 oppure su vetrini polilisinati. I campioni devono essere analizzati entro 4–6 settimane dal taglio, quando conservati a temperatura ambiente (20–25 °C).

Cancro mammario

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ISTRUZIONI PER L’USO - Mammella

A. Preparazione dei reagenti - Mammella Per ragioni di praticità, prima di procedere alla colorazione è opportuno preparare i reagenti elencati di seguito:

A.1 Soluzione di pretrattamento Eventuali cristalli presenti nella fiala 1 si dissolvono a temperatura ambiente. Assicurarsi che non vi siano cristalli presenti prima della preparazione dei reagenti. Diluire una quantità sufficiente della fiala (soluzione di pretrattamento 20) diluendo in un rapporto 1:20 la soluzione concentrata della fiala in acqua distillata o deionizzata. La soluzione diluita non utilizzata può essere conservata a 2–8 °C per un mese. Eliminare la soluzione diluita se appare torbida.

A.2 Tampone di lavaggio di stringenza Preparare il tampone di lavaggio di stringenza per diluizione 1:20 della soluzione concentrata della fiala 4 (tampone di lavaggio di stringenza 20) in acqua distillata o deionizzata. La soluzione tampone diluita non utilizzata può essere conservata a 2–8 °C per un mese. Eliminare la soluzione tampone diluita se appare torbida.

A.3 Tampone di lavaggio Preparare il tampone di lavaggio in quantità sufficiente per diluizione 1:20 della soluzione concentrata della fiala 6 (tampone di lavaggio 20) in acqua distillata o deionizzata. La soluzione tampone diluita non utilizzata può essere conservata a 2–8 °C per un mese. Eliminare la soluzione tampone diluita se appare torbida.

A.4 Serie di etanolo A partire da una soluzione di etanolo al 96%, preparare 3 vaschette di etanolo al 70%, all’85% e al 96%. Conservare le vaschette coperte a temperatura ambiente oppure a 2–8 °C ed utilizzare per trattare un massimo di 200 vetrini. Eliminare le soluzioni se appaiono torbide.

A.5 Soluzione pepsina Una soluzione di pepsina è necessaria solo quando si utilizza il metodo di immersione in pepsina (Metodo C).

Preparare la soluzione di pepsina come segue:

Per un contenitore da 6 vetrini, preparare 60 mL di soluzione di pepsina:

Aggiungere 48 mL di acqua distillata o deionizzata a temperatura ambiente (20–25 °C) al contenitore.

Aggiungere 6 mL di diluente pepsina (10x) (Fiala 2B) freddo (2–8 °C) al contenitore.

Aggiungere 6 mL di pepsina (Fiala 2A) fredda (2–8 °C) al contenitore.

Mettere il coperchio sul contenitore ed equilibrare la soluzione di pepsina a 37 (±2) °C a bagnomaria. Per un contenitore da 24 vetrini, preparare 240 mL di soluzione di pepsina:




Mettere il coperchio sul contenitore ed equilibrare la soluzione di pepsina a 37 (±2) °C a bagnomaria. La soluzione di pepsina equilibrata deve essere utilizzata entro 5 ore.

Cancro mammario

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B. Procedura di colorazione - Mammella

B.1 Note sulla procedura Prima dell’uso, l’utente deve leggere attentamente le seguenti istruzioni e conoscere bene tutti i componenti (vedi la sezione “Precauzioni”).

Tutti i reagenti devono essere equilibrati alle seguenti temperature prima dell’uso:

Fiala 1: la soluzione di pretrattamento diluita deve essere equilibrata a 95–99 °C se il bagnomaria è stato usato per il pretrattamento (B3. Protocollo di colorazione, Passaggio 1: Metodo di pretrattamento, metodo A). Se si utilizza un forno a microonde con funzione di rilevazione per il pretrattamento (B3. Protocollo di colorazione, Passaggio 1: Metodo di pretrattamento, metodo B), è necessario equilibrare la soluzione di pretrattamento a una temperatura ambiente di 20–25 °C. Fiala 2A: la pepsina deve essere applicata a 2–8 °C (B3, Protocollo di colorazione, Fase 2: Metodo A e B) e tenuta continuamente fredda. Fiala 2B: il diluente pepsina (10x) deve essere applicato a 2–8 °C (B3, Protocollo di colorazione, Fase 2: Metodo C). Fiala 3: la miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH si separa in due fasi se conservata a -18 °C. Prima di usare la fiala 3, assicurarsi che solo una fase sia presente equilibrando la miscela a temperatura ambiente (20–25 °C) e miscelando. Scongelare la fiala 3 a temperatura ambiente (20–25 °C) per un massimo di 30 minuti (proteggere dalla luce forte del sole), quindi miscelare bene al fiala per 15 secondi a 2500 rpm usando un miscelatore vortex. Conservare la fiala 3 a -18 °C subito dopo l’uso. Fiala 4: per il tampone di lavaggio di stringenza diluito: una vaschetta deve essere equilibrata a temperatura ambiente, l’altra a 63 (±2) °C prima dell’uso. Fiala 5: il mezzo di montaggio per fluorescenza può essere applicato a qualsiasi temperatura nell’intervallo 2–25 °C. Fiala 6: il tampone di lavaggio diluito deve essere equilibrato a temperatura ambiente, a 20–25 °C. il collante per coprioggetto può essere applicato a qualsiasi temperatura nell’intervallo 2–25 °C. Tutte le fasi della procedura devono svolgersi alla temperatura indicata. La procedura include un numero di fasi di disidratazione, seguite dall’essiccazione delle sezioni tissutali. Assicurare che le sezioni tissutali siano completamente essiccate prima di procedere alla fase successiva. Non lasciare andare a secchezza le sezioni tissutali durante le fasi procedurali. Se la procedura di colorazione deve essere interrotta, i vetrini possono essere mantenuti nel Wash Buffer 1 dopo la fase di sparaffinatura sino ad un’ora a temperatura ambiente (20–25 °C) senza alterare il risultato.

B.2 Trattamento dei tessuti prima della colorazione Sparaffinatura e reidratazione: prima dell’analisi, i vetrini con i tessuti devono essere sparaffinati per eliminare il mezzo di inclusione e reidratati. Evitare la rimozione incompleta della paraffina. La presenza di eventuali residui del mezzo di inclusione può provocare un aumento della colorazione aspecifica. Questa operazione deve essere eseguita a temperatura ambiente (20–25 °C). 1. Immergere i vetrini in un bagno di xilene e incubare per 5 (±1) minuti. Cambiare il bagno e

ripetere il procedimento. 2. Eliminare l’eccesso di liquido picchiettando i vetrini e immergerli in etanolo al 96% per 2 (±1)

minuti. Cambiare il bagno e ripetere il procedimento. 3. Eliminare l’eccesso di liquido picchiettando i vetrini e immergerli in etanolo al 70% per 2 (±1)

minuti. Cambiare il bagno e ripetere il procedimento.

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4. Eliminare l’eccesso di liquido picchiettando i vetrini e immergerli in tampone di lavaggio diluito (vedi ISTRUZIONI PER L’USO, sezione A.3) per almeno 2 minuti. Iniziare la procedura di colorazione come descritto nella sezione B,3, fase 1, Pretrattamento.

Le soluzioni di xilene e di alcol devono essere sostituite dopo 200 vetrini o meno. Si possono utilizzare derivati dello xilene.

NOTA: le istruzioni e i reagenti forniti in questo kit sono stati studiati per assicurare prestazioni ottimali. L’ulteriore diluizione dei reagenti o una variazione delle temperature di incubazione potrebbero generare risultati erronei o discordanti. Differenze nella processazione del tessuto e nei procedimenti tecnici in uso presso il laboratorio dell’utente possono invalidare i risultati del saggio.

B.3 Protocollo di colorazione Fase 1: pretrattamento Il pretrattamento può essere effettuato sia usando un bagnomaria come descritto nel metodo A) che un forno a microonde con funzione di rilevazione come descritto nel metodo B. Metodo A: Pretrattamento con bagnomaria Riempire le vaschette per la colorazione, p.es. vaschette di Coplin, con la soluzione di pretrattamento diluita (vedi ISTRUZIONI PER L’USO, sezione A.1). Porre le vaschette contenenti la soluzione di pretrattamento diluita in bagnomaria. Riscaldare il bagnomaria e la soluzione Pre-Treatment Solution a 95–99 °C. Misurare la temperatura all’interno della vaschetta con un termometro calibrato, verificando che sia corretta. Coprire le vaschette con il rispettivo coperchio per stabilizzare la temperatura ed evitare l’evaporazione. Immergere le sezioni sparaffinate a temperatura ambiente nella soluzione di pretrattamento preriscaldata nelle vaschette per la colorazione. Ricontrollare la temperatura ed incubare per 10 (±1) minuti a 95–99 °C. Rimuovere tutta la vaschetta con i vetrini dal bagnomaria. Rimuovere il coperchio e lasciare raffreddare i vetrini nella soluzione di pretrattamento per 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire i vetrini in una vaschetta contenente il tampone di lavaggio diluito (vedi ISTRUZIONI PER L’USO, sezione A.3) per 3 minuti a temperatura ambiente (20–25 °C). Sostituire il tampone di lavaggio e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti. NOTA: la soluzione Pre-Treatment Solution è un prodotto esclusivamente monouso. Non riutilizzare. Metodo B: Pretrattamento con forno a microonde munito di funzione di rilevazione Riempire una vaschetta in plastica con la soluzione di pretrattamento diluita a temperatura ambiente (20–25 °C). Immergere le sezioni sparaffinate nella soluzione di pretrattamento, coprire la vaschetta con un coperchio forato e collocarla nel forno a microonde. Selezionare la funzione del sensore di ebollizione e programmarlo in modo che rimanga in funzione per 10 minuti dopo il raggiungimento della temperatura di ebollizione*. Dopo 10 minuti di incubazione, rimuovere la vaschetta con i vetrini del forno, rimuovere il coperchio e lasciare raffreddare per 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire i vetrini in una vaschetta con tampone di lavaggio e lasciarli immersi per 3 minuti a temperatura ambiente (20–25 °C). Sostituire il tampone di lavaggio e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti. * Per forno a microonde con funzione di rilevazione si intende un forno munito di un sensore e di programmi che

consentano di portare inizialmente la soluzione di pretrattamento al punto di ebollizione e successivamente di mantenere la temperatura di pretrattamento richiesta (superiore a 95 ºC) durante il conto alla rovescia dal tempo impostato (10 (±1) minuti). Alcuni modelli di forni a microonde con funzione di rilevazione non prevedono la possibilità di impostare un intervallo di tempo per il conto alla rovescia. Se il modello dispone solo di programmi pre-impostati,

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fare attenzione a selezionare un programma che mantenga la temperatura di pretrattamento richiesta (superiore a 95 ºC) per almeno 10 (±1) minuti e arrestare manualmente il programma dopo 10 (±1) minuti.

NOTA: la soluzione Pre-Treatment Solution è un prodotto esclusivamente monouso. Non riutilizzare.

Fase 2: Pepsina pronta all’uso (RTU) o soluzione di pepsina L’incubazione in pepsina può essere eseguita tramite applicazione diretta di gocce di pepsina RTU sui vetrini a temperatura ambiente (20–25 °C) (Metodo A) o a 37 °C (Metodo B). In alternativa, i vetrini possono essere immersi in una soluzione di pepsina e incubati a 37 (±2) °C (Metodo C). Metodo A e Metodo B: Eliminare picchiettando il tampone in eccesso. Usando carta bibula (per esempio una salviettina assorbente oppure carta di tessuto assorbente), asciugare accuratamente il vetrino attorno al campione per rimuovere ogni eccesso di liquido e mantenere i reagenti all’interno dell’area prescritta.

Applicare 5–8 gocce (250 µL) di pepsina (Fiala 2A) fredda (2–8 °C), in modo da coprire il campione. Conservare la pepsina sempre a 2–8 °C.

Metodo A: Pepsina, RTU – Incubazione a 20–25 °C Incubare per 5–15 minuti a temperatura ambiente (20–25 °C). Per la maggior parte dei campioni, è sufficiente un tempo di incubazione di 5–15 minuti; tuttavia, il tempo ottimale può variare a seconda della fissazione dei tessuti e/o lo spessore dei campioni e deve essere determinato dall’utente. Eliminare picchiettando la pepsina ed immergere le sezioni in tampone di lavaggio diluito (vedi ISTRUZIONI PER L’USO, sezione A.3) per 3 minuti a temperatura ambiente (20–25 °C). Sostituire il tampone Wash Buffer diluito e lasciare a bagno le sezioni per altri 3 minuti. Continuare la disidratazione.

Metodo B: Pepsina, RTU – Incubazione a 37 °C Collocare il campione con pepsina in un blocco termico a 37 °C, come Dako Hybridizer, e lasciarlo in incubazione per 3–5 minuti. Per la maggior parte dei campioni, è sufficiente un tempo di incubazione di 3–5 minuti; tuttavia, il tempo ottimale può variare a seconda della fissazione dei tessuti e/o lo spessore dei campioni e deve essere determinato dall’utente. Picchiettare per rimuovere la soluzione di pepsina in eccesso e immergere le sezioni nel tampone di lavaggio diluito per 3 minuti a temperatura ambiente (20–25 °C). Sostituire il tampone di lavaggio e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti. Continuare la disidratazione. Disidratare le sezioni di tessuto in una serie ascendente di etanolo: 2 minuti in etanolo al 70%, 2 minuti in etanolo all’85% e 2 minuti in etanolo al 96%. Lasciare essiccare le sezioni tissutali completamente all’aria. Metodo C: Soluzione pepsina - Immersione dei vetrini in soluzione di pepsina a 37 °C Il kit contiene reagenti sufficienti per quattro cicli separati (soluzione pepsina 60 mL, piccolo contenitore per sei vetrini) o un unico ciclo (soluzione pepsina 240 mL, contenitore grande per 24 vetrini). Preparare la soluzione di pepsina come descritto nella sezione A.5. Mettere il coperchio sul contenitore ed equilibrare la soluzione di pepsina a 37 (±2) °C a bagnomaria. Assicurarsi che la temperatura sia stabilizzata. Misurare la temperatura interna della vaschetta con un termometro calibrato, verificando che sia corretta. Eliminare picchiettando il tampone in eccesso. Immergere i vetrini in soluzione di pepsina a 37 (±2) °C e incubare per 20–30 minuti. Per la maggior parte dei campioni, è sufficiente un tempo di incubazione di 20–30 minuti; tuttavia, il tempo ottimale può variare a seconda della fissazione dei tessuti e/o lo spessore dei campioni e deve essere determinato dall’utente. Picchiettare per rimuovere la pepsina in eccesso e immergere le sezioni nel tampone di lavaggio diluito per 3 minuti a temperatura ambiente (20–25 °C). Sostituire il tampone di lavaggio e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti. Continuare la disidratazione.

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Disidratare le sezioni di tessuto in una serie ascendente di etanolo: 2 minuti in etanolo al 70%, 2 minuti in etanolo all’85% e 2 minuti in etanolo al 96%. Lasciare essiccare le sezioni tissutali completamente all’aria. Fase 3: Miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH La miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH si separa in due fasi se conservata a -18 °C. Prima di usare la fiala 3, assicurarsi che solo una fase sia presente equilibrando la miscela a temperatura ambiente (20–25 °C) e miscelando. Scongelare la fiala 3 a temperatura ambiente (20–25 °C) per un massimo di 30 minuti (proteggere dalla luce forte del sole), quindi miscelare bene al fiala per 15 secondi a 2500 rpm usando un miscelatore vortex. Conservare la fiala 3 a -18 °C subito dopo l’uso. Applicare 10 µL della miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH (fiala 3) al centro della sezione tissutale. Ricoprire immediatamente la miscela di sonde con un vetrino coprioggetto 22 mm x 22 mm e lasciare che il reagente si diffonda in modo omogeneo. Evitare l’intrappolamento di bolle d’aria. Eliminare eventuali bolle d’aria presenti picchiettando delicatamente con le pinzette per allontanarle dal tessuto.

Conservare la fiala 3 a -18 °C subito dopo l’uso. Sigillare il coprioggetto distribuendo il collante attorno al bordo. Lasciare che il collante si sovrapponga al coprioggetto e al vetrino formando così una chiusura ermetica. Assicurarsi che il collante ricopra l’intero bordo del coprioggetto.

Preparare Dako Hybridizer* (codice S2450 o S2451) per la fase di ibridazione. Verificare che gli Humidity Control Strips (codice S2452) siano saturati e ottimali per l’uso. Avviare l’Hybridizer e selezionare il programma per:

Denaturare a 66 °C per 10 minuti e quindi eseguire l’ibridazione a 45 °C per 60–120 minuti.

Collocare i vetrini nell’Hybridizer, verificare che il coperchio sia perfettamente chiuso e avviare il programma. Per istruzioni dettagliate consultare la Guida dell’utente Dako Hybridizer. * Per la denaturazione e l’ibridazione è possibile anche usare altra strumentazione che consenta di ottenere condizioni

identiche a quelle descritte in precedenza.

Collocare i vetrini su una superficie piatta di metallo o pietra (termoblocco o blocco in un forno di ibridazione) preriscaldata a 66 (±1) °C. Denaturare per 10 minuti, Collocare i vetrini all’interno di una camera di ibridazione umidificata precedentemente riscaldata. Richiudere la camera con un coperchio e incubare a 45 (±2) °C per 60–120 minuti. Si noti che la temperatura di ibridazione di 37 °C non è adatta per l’uso con le sonde contenute in questo kit.

Fase 4: Stringent Wash Riempire due vaschette per la colorazione, p. es. vaschette di Coplin, con il tampone di lavaggio di stringenza diluito (vedi ISTRUZIONI PER L’USO, sezione A.2). Si raccomanda di utilizzare un volume minimo di 100 mL oppure 15 mL per vetrino in ciascuna vaschetta.

Collocare una vaschetta contenente il tampone di lavaggio di stringenza diluito a temperatura ambiente in una cappa aspirante e l’altra in un bagnomaria. Riscaldare il bagnomaria e il tampone stringente diluito a 63 (±2) °C. Assicurarsi che la temperatura si sia stabilizzata. Coprire le vaschette con il rispettivo coperchio per stabilizzare la temperatura ed evitare l’evaporazione. Con un termometro calibrato, verificare che la temperatura all’interno della vaschetta nel bagnomaria sia corretta. Il tampone di lavaggio di stringenza contiene un detergente e può diventare torbido a 63 °C. Tuttavia, questo fenomeno non altera la prestazione del reagente.

Usando pinzette o guanti, estrarre i vetrini dalla camera di ibridazione, rimuovere delicatamente il collante e il coprioggetto e collocare i vetrini uno alla volta nella vaschetta di prelavaggio a temperatura ambiente.

Dopo avere rimosso tutti i vetrini coprioggetto, trasferire i vetrini dalla vaschetta di prelavaggio a temperatura ambiente alla vaschetta a 63 (±2) °C nel bagnomaria.

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Subito dopo aver trasferito i vetrini nel tampone stringente diluito a 63 (±2) °C in bagnomaria, deve essere avviato il timer. Eseguire il lavaggio stringente per 10 minuti. Estrarre i vetrini dal tampone di lavaggio di stringenza diluito ed immergere le sezioni in tampone di lavaggio diluito per 3 minuti a temperatura ambiente (20–25 °C).

Sostituire il tampone Wash Buffer diluito e lasciare a bagno le sezioni per altri 3 minuti.

Disidratare le sezioni di tessuto in una serie ascendente di etanolo: 2 minuti in etanolo al 70%, 2 minuti in etanolo all’85% e 2 minuti in etanolo al 96%. Lasciare essiccare le sezioni tissutali completamente.

Fase 5: montaggio Applicare 15 µL di mezzo di montaggio per fluorescenza contenente DAPI (fiala 5) sull’area bersaglio del vetrino e coprire con un vetrino coprioggetto.

NOTA: è possibile eseguire una lettura dei vetrini dopo 15 minuti o entro 7 giorni dal montaggio. Tuttavia, i preparati potrebbero sbiadire se i vetrini sono esposti a luce o temperature eccessive. Per minimizzare questo rischio, conservare i vetrini al buio a -18–8 °C.

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Controllo di qualità - Mammella 1. I segnali devono essere chiari, netti e facili da valutare. 2. Le cellule normali consentono un controllo interno del ciclo di colorazione.

• Le cellule normali devono presentare 1-2 segnali verdi chiaramente visibili indicanti che la sonda di PNA per CEN-17 è stata ibridata con successo alla regione centromerica del cromosoma 17.

• Le cellule normali devono presentare 1-2 segnali rossi chiaramente visibili indicanti che la sonda di DNA per HER2 è stata ibridata con successo al sito di amplificazione (amplicon) di HER2.

• A causa del taglio dei tessuti, alcune cellule normali possono presentare meno dei 2 segnali attesi per ciascun colore.

• La mancata rilevazione dei segnali nelle cellule normali indica che il saggio non è valido e i risultati devono essere considerati non validi.

3. La morfologia nucleare deve risultare intatta all’esame con un filtro DAPI. La presenza di numerose cellule fantasma e una morfologia nucleare generalmente scarsa indicano una digestione eccessiva del campione, con conseguente perdita o frammentazione dei segnali. Questi campioni devono essere considerati non validi.

4. Le differenze che esistono tra i laboratori per quanto riguarda lo svolgimento di procedure quali la fissazione, l’allestimento e l’inclusione del tessuto, ad esempio, possono determinare una certa variabilità dei risultati, per cui si rendono necessari controlli interni periodici.

Interpretazione della colorazione - Mammella Tessuti idonei alla valutazione Devono essere considerati per l’analisi solamente i campioni provenienti da pazienti con carcinoma mammario invasivo. In caso di carcinoma in situ e carcinoma invasivo presenti nello stesso campione, assegnare un punteggio al solo componente invasivo. Evitare le aree di necrosi e laddove i bordi nucleari risultano ambigui. Non includere i nuclei che richiedono una valutazione soggettiva. Ignorare i nuclei con un segnale di intensità debole e un fondo non specifico o elevato.

Conteggio dei segnali: collocare il tumore nel contesto del vetrino colorato con “H&E” e valutare la stessa area sul vetrino colorato secondo la tecnica FISH. Considerare numerose aree di cellule tumorali per giustificare l’eventuale eterogeneità. Selezionare un’area caratterizzata da una buona distribuzione nucleare. Cominciare l’analisi sul quadrante in alto a sinistra dell’area scelta e, eseguendo l’esame da sinistra a destra, contare il numero di segnali all’interno del bordo nucleare di ciascun nucleo esaminato secondo le seguenti linee guida (vedi anche Appendice 3).

- Variare la profondità del fuoco per rilevare tutti i segnali del nucleo individuale. - Contare due segnali di dimensioni eguali e separati da una distanza pari o inferiore al

diametro del segnale come un solo segnale. - Nei nuclei con elevati livelli di amplificazione del gene HER2, i segnali HER2 possono essere

posizionati molto vicini l’uno all’altro, formando un cluster di segnali. In questi casi, il numero di segnali HER2 non può essere contato, ma deve essere stimato. Prestare particolare attenzione ai segnali verdi, dal momento che i cluster dei segnali HER2 possono ricoprire i segnali verdi rendendoli invisibili. In caso di dubbio, controllare i segnali verdi con un filtro FITC specifico.

- Non inserire nella scala di lettura nuclei senza segnali o con segnali di un solo colore. Inserire nella scala di lettura solamente i nuclei con uno o più segnali FISH di ciascun colore.

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Guida al conteggio dei segnali

1

Non contare. I nuclei si sovrappongono, non tutte le aree sono visibili.

2 Due segnali verdi, non inserire nella scala di lettura nuclei con segnali di un solo colore

3 Contare come 3 segnali verdi e 12 rossi (stima del cluster)

4 Contare come 1 segnale verde e 1 segnale rosso. Due segnali di dimensioni eguali e separati da una distanza pari o inferiore al diametro di un segnale vengono contati come un solo segnale

5 Non contare (nucleo iper- o ipodigerito) Segnali mancanti al centro del nucleo (nucleo a forma di ciambella)

6 Contare come 2 segnali verdi e 3 segnali rossi. Due segnali di dimensioni eguali e separati da una distanza pari o inferiore al diametro di un segnale vengono contati come un solo segnale

7 Contare come 1 segnale verde e 5 segnali rossi.

8 Contare come 3 segnali verdi (1 segnale verde è sfuocato) e 3 segnali rossi

9 Cluster di segnali rossi che coprono segnali verdi; controllare i segnali verdi con un filtro FITC specifico, oppure non contare

Registrare i conteggi in una tabella, come riportato nell’Appendice 2. Contare 20 nuclei per campione di tessuto, se possibile da aree di tumore distinte (17). Calcolare il rapporto HER2/CEN-17 dividendo il numero totale di segnali HER2 rossi per il numero totali di segnali CEN-17 verdi. I campioni con un rapporto HER2/CEN-17 superiore o pari a 2 devono essere considerati amplificati per il gene HER2 (5, 17-19). I risultati vicini o coincidenti al valore di cut-off (1,8–2,2) devono essere interpretati con cautela. Se il rapporto è ad un valore limite (1,8–2,2) eseguire il conteggio di altri 20 nuclei e ricalcolare il rapporto per i 40 nuclei. In caso di dubbio, il vetrino del campione deve essere sottoposto ad una nuova lettura. Per i casi limite, si raccomanda un consulto tra il patologo e il medico curante.

oppure

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Limitazioni - Mammella 1. FISH è una tecnica diagnostica multistadio che richiede un addestramento specifico per la

selezione dei reagenti appropriati, la selezione, la fissazione e la processazione dei tessuti, la preparazione del vetrino per FISH e l’interpretazione dei risultati della colorazione.

2. I risultati della tecnica FISH dipendono dalla manipolazione e dalla processazione del tessuto prima della colorazione. L’errata esecuzione della fissazione, il lavaggio, l’essiccazione, il riscaldamento, il taglio oppure la contaminazione con altri tessuti o fluidi possono alterare l’ibridazione della sonda. Risultati incoerenti possono essere dovuti anche a modifiche apportate ai metodi di fissazione e di inclusione o ad irregolarità intrinseche del tessuto.

3. Per risultati ottimali e riproducibili, i vetrini dei tessuti devono essere sparaffinati completamente. La rimozione della paraffina deve essere completa all’inizio dell’intero processo di colorazione. (vedi ISTRUZIONI PER L’USO, sezione B.2).

4. Utilizzare solamente bagnomaria, blocchi riscaldanti e forni per ibridazione a temperatura calibrata. L’uso di altri tipi di apparecchiatura può indurre l’evaporazione della miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH durante l’ibridazione e deve essere convalidato dall’utente.

Caratteristiche prestazionali - Mammella

Sensibilità analitica

La sensibilità della miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH è stata valutata utilizzando 18 campioni di epitelio mammario umano normale. Il rapporto tra il numero di segnali HER2 e CEN-17 è stata calcolata in base ad un conteggio di 20 nuclei per campione. Il rapporto HER2/CEN-17 per 18 campioni per epitelio mammario umano normale era compreso tra 0,97–1,08.

Specificità analitica Le sonde di DNA per HER2 nella miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH sono state sequenziate e mappate per confermare una copertura totale di 218 kb comprendente il gene HER2. Le sonde di PNA per CEN-17 PNA nella miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH sono state esaminate singolarmente ed in combinazione per confermare l’ibridazione specifica alla regione centromerica del cromosoma 17. Per misurare la capacità del dosaggio di identificare esclusivamente le sostanze target HER2 e CEN-17 senza interferenza di altre sottosostanze, sono stati eseguiti degli studi su campioni di tessuto di epitelio mammario umano normale usando la Fiala 3 contenente il campione di ibridazione senza la miscela di sonde. Un totale di 18 campioni è stato valutato per la presenza di segnali non correlati alla miscela di sonde. Nessun rilevamento di altri target di cromosomi o interferenza con sostanze strettamente correlate è stato osservato in nessuno dei 18 campioni.

Studi di resistenza La robustezza del dosaggio HER2 IQFISH pharmDx è stata valutata variando il tempo di pretrattamento, la temperatura e i metodi di riscaldamento del tampone di pretrattamento (microonde o bagnomaria), il tempo di incubazione in pepsina e il metodo (pepsina RTU o immersione), temperatura e tempo di denaturazione, tempo di ibridazione e tempo e temperatura del lavaggio stringente.

Non è stata osservata alcuna differenza significativa nelle seguenti condizioni sperimentali:

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• Metodo di pretrattamento A) Bagnomaria per 10 minuti unito a ognuna delle temperature 95 °C, 95–99 °C e 99 °C unitamente a 9, 10 e 11 minuti a 95–99 °C

• Metodo di pretrattamento B) Microonde per 9, 10 e 11 minuti a >95 °C. • Metodo digestione pepsina A) con tempi di incubazione di 5, 10 e 15 minuti a

temperatura ambiente (20–25 °C). • Metodo digestione pepsina B) con tempi di incubazione di 3, 4 e 5 minuti a 37 °C). • Metodo digestione pepsina C) con tempi di incubazione di 20, 25 e 30 minuti

combinati con ognuna delle temperature 35, 37 e 39 °C. • Denaturazione per 10 minuti combinata a ognuna delle temperature 65, 66 e 67 °C

unitamente a 9, 10 e 11 minuti a 66 °C. Tempo di ibridazione a 60, 90 e 120 minuti a 45 °C.

• Lavaggio stringente per 10 minuti unito a ognuna delle temperature 61, 63 e 65 °C unitamente a 9, 10 e 11 minuti a 63 °C.

Nota: per gli studi di resistenza, è stato modificato solo un parametro alla volta nella procedura di colorazione, mantenendo costanti tutti gli altri parametri. Si raccomanda di rispettare i tempi e le temperature indicate nella procedura di colorazione. L’ibridazione per 60 minuti ha restituito un’intensità di segnale elevata, sebbene leggermente ridotta rispetto all’ibridazione per 90 e 120 minuti. Non è stata osservata alcuna differenza significativa nei risultati nelle altre combinazioni di tempo/temperatura. La procedura di colorazione per HER2 IQFISH pharmDx offre variabili del protocollo per pretrattamento, digestione pepsina e tempo di ibridazione. Ogni opzione unica è stata convalidata rispetto allo stato del gene HER2. La convalida è stata eseguita su 10 campioni di carcinoma mammario umano FFPE per ognuna delle 12 possibili combinazioni. HER2 FISH pharmDx Kit (K5331) è stato usato come riferimento. Il rapporto HER2/CEN-17 per ogni singolo campione è mostrato in Figura 1. Le tabulazioni crociate tra i 12 test e la colorazione di riferimento hanno mostrato un accordo complessivo nello stato del gene HER2 del 100% (10/10) con limiti di confidenza inferiori e superiori a due code del 96% a 78,3% e 100% rispettivamente. Il valore Kappa era 1,00 e il test di McNemars ha mostrato assenza di scostamento (valore p a due code pari a 1,00).

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Figura 1. Rapporti singoli HER2/CEN-17 per 10 campioni di carcinoma mammario umano usando le 12 variazioni possibili del protocollo con HER2 IQFISH pharmDx (codice K5731) (Test 1-12) e HER2 FISH pharmDx Kit (codice K5331) come riferimento (R). La linea orizzontale illustra il valore di cutoff di 2,0.

Ripetibilità La ripetibilità del rapporto HER2/CEN-17 è stata investigata con il dosaggio HER2 IQFISH pharmDx usando sezioni consecutive di nove campioni di carcinoma mammario umano con stato del gene HER2 amplificato e non. Sezioni triplicate di ogni campione sono state testate nello stesso ciclo. Il coefficiente di variazione medio era di 5,2% per campioni non amplificati (range 1%–8%) e 14% per campioni amplificati (range 7%–20%). Sono state esaminate in totale cinque sezioni consecutive di campioni di carcinoma mammario con diversi spessori (3, 4, 5, 6 e 7 µm) con HER2 IQFISH pharmDx. Il coefficiente di variazione medio del rapporto HER2/CEN-17 è risultato del 7% (range 6%–9%).

Riproducibilità Il dosaggio HER2 IQFISH pharmDx è stato testato per la riproducibilità da lotto a lotto e da osservatore a osservatore usando tre lotti di HER2 IQFISH pharmDx e tre osservatori. La riproducibilità è stata testata su nove campioni di carcinoma mammario umano diversi con stato del gene HER2 amplificato e non. Il coefficiente di variazione medio per la riproducibilità intralotto era di 5% per campioni non amplificati (range 2%–8%) e 7,8% per campioni amplificati (range 5%–11%). Il coefficiente di variazione medio per la riproducibilità da osservatore ad osservatore era di 3,2% per campioni non amplificati (range 0,2%–6%) e 2,8% per campioni amplificati (range 2%–4%).

Utilità clinica L’utilità clinica del kit Dako HER2 FISH pharmDx (codice K5331) è stata esaminata in uno studio comparativo con il kit Vysis PathVysion™ HER-2 DNA Probe. Lo studio includeva 150 campioni archiviati da pazienti affetti da carcinoma mammario di stadio II-III con presenza o assenza di noduli. L’obiettivo primario dello studio era la valutazione del grado di concordanza tra i rapporti HER2/CEN-17 per i 150 campioni esaminati con i kit Dako e Vysis, entrambi riguardanti la corrispondenza generale dei rapporti e la corrispondenza dei risultati FISH dicotomizzati (gruppi +/-). Venivano ibridati e valutati con successo in totale 145 campioni che risultavano pertanto idonei all’analisi statistica. Una tabella di contingenza 2 x 2 dei risultati viene presentata nella Tabella 1. Tabella 1. Risultati dicotomizzati da 145 campioni di carcinoma mammario analizzati con Dako HER2 FISH pharmDx Kit e Vysis PathVysion™ HER-2 DNA Probe. Venivano inclusi nell’analisi con ciascun kit 60 nuclei per campione.

Kit Dako amplificato (-)

Kit Dako amplificato (+)

Somma

Kit Vysis amplificato (-)

95 2 97

Kit Vysis amplificato (+)

5 43 48

Somma 100 45 145

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La concordanza tra i saggi Dako e Vysis risultava pari al 95% con un intervallo di confidenza del 92–99%. Il valore kappa era 0,89. Il test McNemar per le differenze sistematiche tra i due test non era significativo (p=0,22).

Nella figura 2 viene presentato un diagramma diffuso delle osservazioni accoppiate per i 145 campioni.

Cancro mammario

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Figura 2. 145 campioni di carcinoma mammario analizzati per l’amplificazione del gene HER2 con i kit Dako HER2 FISH pharmDx e Vysis PathVysion™ HER-2 DNA Probe. I risultati sono espressi come rapporti HER2/cromosoma 17 centromero. Venivano inclusi nell’analisi con ciascun kit 60 nuclei per campione.

La corrispondenza generale tra i saggi Dako HER2 FISH pharmDx e Vysis PathVysion™ HER-2 DNA Probe veniva esaminata mediante l’analisi della differenza tra osservazioni accoppiate del logaritmo (rapporto) ed una analisi di regressione lineare del logaritmo (rapporto) dei due saggi. Si concludeva che la differenza tra osservazioni accoppiate del logaritmo (rapporto) aumenta sistematicamente della somma dei rapporti HER2/CEN-17, e che, per rapporti più elevati, il rapporto misurato è maggiore nel saggio Dako rispetto al saggio Vysis. Il maggiore rapporto HER2/CEN-17 osservato con il kit Dako HER2 FISH pharmDx Kit può essere correlato ad una reale differenza tra i due saggi, p. es., si può pensare che una maggiore risoluzione del kit Dako HER2 FISH pharmDx Kit, induca rapporti maggiori nei casi altamente amplificati per il gene HER2. Tuttavia, dato che l’analisi dei kit era stata eseguita in 2 centri differenti, è attesa una variazione interlaboratorio. Inoltre, una variazione maggiore per casi altamente amplificati è stata riportata in letteratura, tuttavia non è considerata clinicamente rilevante (18). L’indagine di una differenza sistematica tra i due saggi in laboratori multipli non è contemplata nell’ambito dello studio in corso. Si deve aggiungere che la variazione osservata tra i due saggi è di entità simile alla variazione tra centri osservata nello studio di ripetibilità interlaboratorio. Dako HER2 IQFISH pharmDx (codice K5731) è stato confrontato con Dako HER2 FISH pharmDx Kit (codice K5331) in uno studio comparativo su 78 campioni di tessuto mammario di carcinoma mammario umano. La tabulazione crociata dello stato HER2

Scatter plot of paired observations

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00

Vysis PathVysion™ HER-2 DNA Probe Kit

Dako

Cyto

mat

ion

HER2

FIS

H ph

arm

Dx™

Kit

Diagramme diffuso delle osservazioni accoppiate D

ako

HE

R2

FIS

H p

harm

Dx

Kit

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ottenuta dai due dosaggi ha restituito un accordo complessivo del 98,7% con limiti inferiore e superiore per l’intervallo di confidenza del 95% a 94,2% e 99,9%. Il valore Kappa era di 0,96, con limiti inferiore e superiore per l’intervallo di confidenza del 95% a 0,89 e 1,00. Il valore p per il test McNemars era 1,00, indicando assenza di scostamento tra i due dosaggi.

Cancro mammario

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Risoluzione dei problemi - Mammella Problema Probabile causa Intervento consigliato 1. Nessun segnale o

segnali deboli 1a. Il Kit è stato esposto ad

elevate temperature durante il trasporto o la conservazione

1a. Controllare le condizioni di conservazione. Accertarsi che il ghiaccio secco fosse presente al momento della consegna. Assicurarsi che la fiala 3 sia stata conservata a -18 °C al buio. Controllare che le fiale 2A e 5 siano state conservate ad un massimo di 2–8 °C al buio.

1b. Il microscopio non funziona correttamente

- Il filtro impostato non è adatto

- Lampada errata - La lampada al mercurio è

datata - Le lenti sono sporche o

graffiate - L’olio di immersione non è

adatto

1b. Controllare lo stato del microscopio e verificare che i filtri impiegati siano idonei all’uso con i fluorocromi del kit e che la lampada a mercurio sia corretta e non utilizzata oltre la durata consigliata. (vedere l’Appendice 3). In caso di dubbio, contattare il fornitore del microscopio.

1c. Segnali sbiaditi 1c. Evitare lunghe analisi microscopiche e minimizzare l’esposizione a luce intensa.

1d. Errate condizioni di pretrattamento

1d. Assicurarsi che il pretrattamento avvenga alla temperatura consigliata.

1e. Evaporazione della miscela di sonda durante l’ibridazione

1e. Assicurare una umidità sufficiente nella camera di ibridazione

2. Nessun segnale blu

2a. Errate condizioni del lavaggio di stringenza

2a. Assicurarsi che siano impiegati i tempi e la temperatura raccomandati per il lavaggio di stringenza e che i coprioggetto vengano rimossi prima di eseguire il lavaggio di stringenza

3. Assenza di segnali rossi

3a. Errate condizioni di pretrattamento

3a. Assicurarsi che il pretrattamento avvenga alla temperatura consigliata.

4. Aree senza segnali 4a. Volume della sonda troppo piccolo

4a. Assicurarsi che il volume della sonda sia sufficientemente largo da ricoprire l’area al di sotto del coprioggetto

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Problema Probabile causa Intervento consigliato 4b. Bolle d’aria intrappolate

durante l’applicazione della miscela di sonde o durante il montaggio

4b. Evitare l’intrappolamento di bolle d’aria. Eliminare eventuali bolle d’aria presenti picchiettando delicatamente con le pinzette

5. Colorazione eccessiva del fondo

5a. Metodo di fissazione dei tessuti inadeguato

5a Assicurarsi che vengano utilizzate solamente sezioni tissutali incluse in paraffina, fissate in formalina

5b. Rimozione incompleta della paraffina

5b. Seguire le procedure di sparaffinatura e di reidratazione descritte nella sezione B.2

5c. Temperatura per il lavaggio di stringenza troppo bassa

5c. Assicurarsi che la temperatura del lavaggio di stringenza sia 63 (±2) °C

5d. La sezione sottoposta a ibridazione è stata esposta a una fonte di luce intensa per troppo tempo.

5d. Evitare lunghe analisi microscopiche e minimizzare l’esposizione a luce intensa

6. Scarsa morfologia dei tessuti

6a. Errato trattamento con pepsina

6a. Rispettare i tempi d’incubazione raccomandati per la pepsina. Vedi sezione B.3, fase 2.

Assicurarsi che il prodotto Pepsin venga utilizzato alla temperatura indicata. Vedi sezione B.1.

6b. Errate condizioni di pretrattamento possono indurre un aspetto non trasparente o torbido

6c. Un trattamento con Pepsin eccessivamente prolungato o uno spessore troppo piccolo possono provocare la comparsa di cellule fantasma o cellule “donut” (a ciambella).

6b. Assicurarsi che il pretrattamento avvenga alla temperatura consigliata.

6c. Abbreviare l’incubazione

con Pepsin. Vedi Sezione B.3, fase 2. Assicurarsi che lo spessore di sezione sia 4–6 µm.

7. Livello elevato di autofluorescenza verde sui vetrini, comprese le aree senza tessuto FFPE

7. Uso di vetrini scaduti o sconsigliati

7. Assicurarsi che il vetrino rivestito (Dako Silanized Slides, codice S3003 o vetrini rivestiti in poli-L-lisina) non abbiano superato la data di scadenza.

NOTA: Se il problema non è imputabile a nessuna di queste cause o se l’intervento correttivo consigliato non si rivela efficace, contattare l’Assistenza Tecnica Dako per ricevere ulteriori suggerimenti.

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Appendice 1 - Mammella HER2 IQFISH pharmDx, codice K5731 Checklist protocollo

Rif. scheda del ciclo di colorazione:______________ Data del ciclo: __________________ HER2 IQFISH pharmDx, lotto K5731: __________________ Rif. campione: __________________ Rif. apparecchiatura: __________________ Data di diluizione/scadenza del tampone di lavaggio 1 x (fiala 6 diluita 1:20): _________ /_________ Tessuto fissato in formalina tamponata neutra Sì No

Fase 1: pretrattamento Data di diluizione/scadenza della soluzione di pretrattamento (fiala 1 diluita 1:20)

/

Temperatura misurata della soluzione di pretrattamento (95–99 °C) se si utilizza un bagnomaria per il riscaldamento

°C

Pretrattamento (10 minuti) e raffreddamento (15 minuti) Lavaggio in tampone di lavaggio (fiala 6 diluita 1:20) (2 x 3 minuti)

Fase 2: Pepsina Durata del trattamento con pepsina (fiala 2) a 37 °C o Minuti Durata del trattamento con pepsina (fiala 2) a temperatura ambiente (20–25 °C) o

Minuti

Durata dell’immersione in pepsina a 37 (±2) °C Minuti Lavaggio in tampone di lavaggio (fiala 6 diluita 1:20) (2 x 3 minuti)

Disidratare i vetrini (3 x 2 minuti) attraverso il passaggio in una serie di etanolo ed essiccare all’aria

Fase 3: Miscela di sonde HER2/CEN-17 Applicare la miscela di sonde (fiala 3), coprire con il coprioggetto e sigillare con il collante

Misurare la temperatura di denaturazione (66 (±1) °C) °C Denaturazione per 10 minuti Misurare la temperatura di ibridazione (45 (±2) °C) °C Tempo di ibridazione (60–120 minuti) Minuti Fase 4: Stringent Wash Data di diluizione/scadenza del tampone di lavaggio di stringenza (fiala 4 diluita 1:20)

/

Temperatura misurata del tampone di lavaggio di stringenza (63 (±2) °C)

°C

Lavaggio di stringenza (10 minuti) dopo la rimozione dei coprioggetto

Lavaggio in tampone di lavaggio (fiala 6 diluita 1:20) (2 x 3 minuti)

°C


Minuti

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Fase 5: montaggio Applicare 15 µL di mezzo di montaggio per fluorescenza (fiala 5) e coprire con il coprioggetto

Commenti:

Data e firma, nome del tecnico:

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Appendice 2 - Mammella

HER2 IQFISH pharmDx, codice K5731 Schema di lettura Rif. scheda del ciclo di colorazione: _________ Data del ciclo: __________________ HER2 IQFISH pharmDx, K5731 Lotto: ________ Rif. campione: _______________

Contare i segnali in 20 nuclei

Nucleo n.

HER2 lettura (rossi)

CEN-17 lettura (verdi)

Nucleo n.

HER2 lettura (rossi)

CEN-17 lettura (verdi)

1 11

2 12

3 13

4 14

5 15

6 16

7 17

8 18

9 19

10 20

Totale (1-10) Totale (11-20)

Per la determinazione del rapporto HER2/CEN-17, contare il numero di segnali HER2 e il numero dei segnali CEN-17 negli stessi 20 nuclei e dividere il numero totale dei segnali HER2 per il numero totale dei segnali CEN-17. Se il rapporto è ad un valore limite (1,8–2,2), eseguire il conteggio su altri 20 nuclei e ricalcolare il rapporto. I risultati vicini o pari al valore di cut-off (1,8–2,2) devono essere interpretati con cautela (vedi guida sul conteggio).

HER2 CEN-17 Rapporto HER2/CEN-17

Lettura totale (1-20) Rapporto < 2: amplificazione del gene HER2 non osservata

Rapporto ≥ 2: amplificazione del gene HER2 osservata


Data e firma, nome del patologo:

Per le linee guida sulla lettura: vedi Interpretazione della colorazione.

Cancro mammario

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Appendice 3 - Mammella

HER2 IQFISH pharmDx, codice K5731 Specifiche per il microscopio a fluorescenza Dako raccomanda la seguente apparecchiatura per l’uso con HER2 IQFISH pharmDx, K5731:

1. Tipo di microscopio

• Microscopio ad epifluorescenza.

2. Lampada • Lampada a mercurio da 100 watt (prendere nota dei tempi d’impiego).

3. Obiettivi • Per l’esame del tessuto, utilizzare obiettivi a secco per fluorescenza 10X oppure obiettivi a

immersione d’olio per fluorescenza 16X. • Per un ingrandimento elevato e per la valutazione dei segnali, utilizzare solo obiettivi a

immersione d’olio per fluorescenza, in particolare 100X.

4. Filtri Esistono filtri progettati in modo specifico per singoli fluorocromi. Dako raccomanda l’uso di un filtro DAPI specifico in combinazione con un doppio filtro Texas Red/FITC di alta qualità.

• Filtro DAPI • Doppio filtro Texas Red/FITC • Ai fini della conferma, è possibile utilizzare filtri singoli Texas Red e FITC.

Fluorocromo Lunghezza d’onda di eccitazione Lunghezza d’onda di emissione FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm

Dato che esistono filtri specifici per ogni tipo di microscopio, l’uso dei filtri adatti è fondamentale per una corretta interpretazione. Per ulteriori informazioni, contattare il rivenditore di microscopi oppure il rappresentante Dako di zona.

5. Olio • Olio non fluorescente.

Precauzioni • Non si raccomanda l’uso di una lampada a mercurio da 50 watt. • Non si possono utilizzare filtri a rodamina. • Non si raccomanda l’uso di filtri tripli.

L’uso di un microscopio non ottimizzato potrebbe causare problemi durante la lettura dei segnali fluorescenti. È importante che la fonte di illuminazione non sia utilizzata oltre la data di scadenza e che sia allineata con precisione e a fuoco. È compito del cliente controllare e seguire le raccomandazioni del fabbricante per la lampada a mercurio. Il microscopio deve essere sottoposto a manutenzione e la lampada a mercurio deve essere allineata prima dell’interpretazione dei risultati. È necessario assicurarsi che il campione sia esposto alla luce di eccitazione per il minor tempo possibile, di modo che la fluorescenza non perda intensità. Si raccomanda di consultare il fabbricante per l’impostazione del microscopio utilizzato prima di iniziare la procedura di ibridazione in situ in fluorescenza, oppure fare riferimento alla letteratura.

Cancro gastrico

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Cenni introduttivi - Gastrico Il gene umano HER2 (noto anche come ERBB2 o NEU) è localizzato sul cromosoma 17 e codifica la proteina indicata come HER2 o p185HER2. La proteina HER2 è un recettore di transmembrana ad attività tirosin-chinasica con omologia per il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR o HER1) (1-2). Il gene HER2 è presente in 2 coppie in tutte le cellule diploidi normali.

L’iperespressione della proteina HER2 e l’amplificazione del gene HER2 nel cancro gastrico sono stati mostrati in molti studi (revisionati in (20)). La positività all’HER2 può essere rilevata in circa il 20% dei pazienti tramite IHC o FISH (21).(20) Studi preclinici in vitro e in vivo hanno dimostrato che il trastuzumab (Herceptin™) è efficace in diversi modelli di cancro gastrico, portando così all’avvio di studi clinici (20-24). In uno studio di fase III BO18255, lo studio ToGA, i pazienti positivi all’HER2 con adenocarcinoma in stadio avanzato localmente inoperabile, ricorrente e/o metastatico dello stomaco o della giunzione esofagea sono stati sottoposti in maniera randomizzata a terapia con 5 FU o capecitabina o cisplatina, da soli o in combinazione con il trastuzumab. È stato rilevato un aumento significativo nella sopravvivenza globale (OS) nei pazienti sottoposti al trattamento combinato di trastuzumab e chemioterapia (25). Il trastuzumab è un anticorpo monoclonale umanizzato che presenta un’elevata affinità di legame con la proteina HER2 e che, come si è dimostrato, è in grado di inibire la proliferazione delle cellule tumorali umane che iperesprimono la proteina HER2 sia in vitro, sia in vivo (21-24).

Principio della procedura - Gastrico HER2 IQFISH pharmDx contiene tutti i reagenti necessari per la completa esecuzione di una procedura FISH su campioni di sezioni tissutali fissate in formalina, incluse in paraffina.

Dopo la deparaffinatura e la reidratazione, i campioni sono riscaldati in soluzione di pretrattamento seguita da digestione proteolitica usando pepsina. Dopo le fasi di riscaldamento e pretrattamento protelitico, il kit impiega una miscela di sonde IQISH non tossica (12)pronta per l’uso basata su una combinazione di tecnologia di PNA (acido peptidil nucleico) e di DNA. La miscela di sonde consiste di una soluzione di sonde di DNA marcate con Texas Red che coprono una regione di 218 kb, in cui è incluso il gene HER2 sul cromosoma 17, ed una miscela di sonde di PNA marcate con fluoresceina e dirette alla regione centromerica del cromosoma 17 (CEN-17). L’ibridazione specifica ai due siti bersaglio porta alla formazione di un segnale fluorescente rosso caratteristico in corrispondenza di ciascun locus del gene HER2 e ad un segnale fluorescente caratteristico in corrispondenza di ciascun centromero del cromosoma 17. Dopo un lavaggio di stringenza, i campioni sono montati con un mezzo di montaggio per fluorescenza contenente DAPI e coperti con vetrino coprioggetto. L’uso di un microscopio a fluorescenza dotato di filtri appropriati (vedi Appendice 3) consente di localizzare le cellule tumorali e di eseguire il conteggio dei segnali rossi (HER2) e verdi (CEN-17). Viene quindi calcolato il rapporto HER2/CEN-17. Viene quindi calcolato il rapporto HER2/CEN-17. Le cellule normali nella sezione tissutale analizzata vengono utilizzate come controllo positivo interno dell’efficacia del pretrattamento e dell’ibridazione. Per informazioni, fare riferimento alla sezione “Interpretazione della colorazione”.

Per un corso di e-learning interattivo, usare il programma di e-learning HER2 IQFISH pharmDx progettato per fornire ai tecnici di laboratorio, patologi e scienziati informazioni accurate e precise su come ottenere risultati ottimali con HER2 IQFISH pharmDx: www.dako.com

Reagenti - Gastrico

Materiali forniti Il materiale elencato qui di seguito è sufficiente per l’esecuzione di 20 test (un test viene definito come una area bersaglio pari a 22 mm x 22 mm). Il numero di test si basa sull’uso di 250 µL per vetrino di fiala 2A (5-8 gocce), 10 µL per vetrino di fiala 3 e 15 µL per vetrino di fiala 5). Le soluzioni nella Fiala 3 e nella Fiala 5 sono viscose e potrebbero dover essere centrifugate brevemente in una microcentrifuga per raccogliere tutto il reagente fornito.

Cancro gastrico

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Questo kit fornisce materiali sufficienti per un massimo di 10 cicli di colorazione singoli (quattro cicli separati quando si utilizza il metodo di immersione in pepsina). HER2 IQFISH pharmDx è spedito su ghiaccio secco. Per verificare che i componenti del kit non siano stati esposti a temperature elevate durante il trasporto, accertarsi che vi sia ancora ghiaccio secco al momento della consegna. Si fa presente che alcuni componenti del HER2 IQFISH pharmDx possono rimanere non congelati, senza che questo ne alteri la prestazione.

Fiala 1

Soluzione di pretrattamento (20) 150 mL, concentrato 20 Tampone MES (acido 2-[N-morfolino]etansolfonico).

Fiala 2A Fiala 2B

Pepsina 4 x 6,0 mL, pronto all’uso Soluzione di pepsina, a pH 2,0, contenente uno stabilizzante ed un agente antimicrobico.

Diluente pepsina (10x) 24 mL, concentrato 10x Tampone di diluizione, a pH 2,0, contenente un agente antimicrobico.

Fiala 3 Miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH 0,2 mL, pronta per l’uso Miscela di sonde di DNA per HER2 marcate con Texas Red e di sonde di PNA per CEN-17 marcate con fluoresceina; fornite in tampone di ibridazione IQISH.

Fiala 4 Stringent Wash Buffer (20x) 150 mL, concentrato 20 Tampone SSC (soluzione salina di citrato di sodio) con detergente (Tween-20).

Fiala 5 Mezzo di montaggio a fluorescenza 0,4 mL, pronta per l’uso Mezzo di montaggio fluorescente con DAPI 500 µg/L (4’,6-diamidina-2-fenilindolo).

Fiala 6 Tampone di lavaggio (20) 500 mL, concentrato 20 Tampone Tris/HCl.

Collante coprioggetto 1 tubo, pronto per l’uso Soluzione per sigillare in modo non permanente i coprioggetto.

NOTA: I reagenti del kit seguenti: soluzione di pretrattamento (20x), pepsina, diluente pepsina (10x), tampone stringente (20x), mezzo di montaggio a fluorescenza, tampone di lavaggio (20x) e collante coprioggetto sono intercambiabili con i reagenti corrispondenti nel Dako Histology FISH Accessory Kit, Codice K5799.

Cancro gastrico

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Materiale necessario ma non fornito Reagenti da laboratorio Acqua distillata o deionizzata Etanolo, 96% Xilene o derivati dello xilene

Apparecchiatura da laboratorio Garze assorbenti Pipette regolabili Termometro calibrato a immersione parziale (per temperature tra 37 e 100 °C) Termometro calibrato da superficie (per temperature tra 37 e 100 °C) Coprioggetto (22 mm x 22 mm) Pinzette Cappa aspirante Dako Hybridizer (codice S2450 o S2451) Piastra di riscaldamento o forno di ibridazione* Camera umida di ibridazione* Microcentrifuga Vetrini, Dako Silanized Slides codice n. S 3003, oppure polilisinati (vedi “Preparazione dei campioni”) Vaschette o bagni per la colorazione Contaminuti (per intervalli di 2–15 minuti) Miscelatore Vortex Bagnomaria con coperchio (in grado di mantenere una temperatura tra 37(±2) °C, 63 (±2) °C e da 95 °C a 99 °C) Forno a microonde con funzione di rilevazione se il pretrattamento viene eseguito utilizzando un forno a microonde (vedere B3. Protocollo di colorazione. Fase 1: Metodo di pretrattamento, metodo B) * Blocco termico o forno di ibridazione per la denaturazione (66 (±1) °C) e l’ibridazione (45 (±2) °C) unitamente a una camera umida da usare in alternativa a Dako Hybridizer.

Apparecchiatura per microscopia e accessori Filtri per microscopio a fluorescenza: doppio filtro DAPI e FITC/Texas Red, oppure monofiltri FITC e Texas Red. Per informazioni, vedi Appendice 3.

Si consiglia l’uso di un microscopio a fluorescenza con lampada al mercurio da 100 watt come fonte luminosa. Altre fonti luminose non sono raccomandate con questi filtri. Raccoglitore per vetrini (contenitore di cartone per 20 vetrini, con chiusura a cerniera o simile)

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Precauzioni - Gastrico 1. Per uso diagnostico in vitro. 2. Per uso professionale. 3. Il flacone 1, Soluzione di pretrattamento (x 20), non richiede etichettatura di pericolo. Su

richiesta è disponibile una scheda di sicurezza per utenti professionisti. 4. Il flacone 2A, Pepsin, contiene ≥5-<10% propan-2-ol, ≥0.1-<0.3% pepsina A e ≥0.011-<0.1%

5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one e 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Il flacone 2A è etichettata:

Pericolo H314 Provoca gravi ustioni cutanee e gravi lesioni oculari. H317 Può provocare una reazione allergica cutanea. P280 Indossare guanti protettivi. Fare uso di un dispositivo di

protezione degli occhi o del viso. Indossare indumenti protettivi.

P304 + P340 + P310 IN CASO DI INALAZIONE: Trasportare l’infortunato all’aria aperta e mantenerlo a riposo in posizione che favorisca la respirazione. Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico.


P303 + P361 + P353 + P310

IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE (o con i capelli): Togliere immediatamente tutti gli indumenti contaminati. Sciacquare la pelle/fare una doccia. Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico.

P305 + P310 IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Contattare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI/un medico.

P405 Conservare sotto chiave. P501 Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le

normative locali, regionali, nazionali e internazionali. 5. Il flacone 2B, Pepsin Diluent (10x), contiene ≥50-<75% propan-2-ol e ≥5-<10% 2-amino-2-

(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Il flacone 2B è etichettata:

Pericolo H225 Liquido e vapori facilmente infiammabili. H319 Provoca grave irritazione oculare. H336 Può provocare sonnolenza o vertigini. P280 Indossare guanti protettivi. Proteggere gli occhi/il viso. P210 Tenere lontano da fonti di calore, superfici calde, scintille,


per la movimentazione dei materiali a prova di esplosione. P304 + P340 IN CASO DI INALAZIONE: trasportare l’infortunato all’aria

aperta e mantenerlo a riposo in posizione che favorisca la respirazione.

P303 + P361 + P353 IN CASO DI CONTATTO CON LA PELLE (o con i capelli): Togliere immediatamente tutti gli indumenti contaminati.

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Sciacquare la pelle/fare una doccia. P235 Conservare in luogo fresco. P501 Smaltire il prodotto e il recipiente in conformità a tutte le

normative locali, regionali, nazionali e internazionali. 6. Il flacone, HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, contiene ≥10-<25% ethylene carbonate e ≥3-

<5% sodium chloride. Il flacone 3 è etichettata:

Attenzione H319 Provoca grave irritazione oculare. P280 Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del



7. Il flacone 4, Stringent Wash Buffer (20x), contiene ≥10-<25% sodium chloride, e ≥10-<20% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Il flacone 4 è etichettata:

Attenzione H319 Provoca grave irritazione oculare. H315 Provoca irritazione cutanea. P280 Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del



8. Il flacone 6, Wash Buffer (20x), contiene ≥10-<25% sodium chloride e ≥10-<20% trometamolo. Il flacone 6 è etichettata:

Attenzione H319 Provoca grave irritazione oculare. H315 Provoca irritazione cutanea. P280 Fare uso di un dispositivo di protezione degli occhi o del viso. P264 Lavarsi accuratamente le mani dopo l’uso. P305 + P351 + P338 IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare


9. Elemento 7, Coverslip Sealant, contiene il 100% di nafta (petrolio), frazione leggera di “hydrotreating” e è etichettata:

Pericolo H225 Liquido e vapori facilmente infiammabili. H304 Può essere letale in caso di ingestione e di penetrazione nelle

vie respiratorie. H411 Tossico per gli organismi acquatici con effetti di lunga durata.

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P280 Indossare guanti protettivi. Proteggere gli occhi/il viso. P210 Tenere lontano da fonti di calore, superfici calde, scintille,


per la movimentazione dei materiali a prova di esplosione. P273 Non disperdere nell’ambiente. P301 + P310 + P331 IN CASO DI INGESTIONE: Contattare immediatamente un

CENTRO ANTIVELENI/un medico. NON provocare il vomito. P303 + P361 + P353 IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare



normative locali, regionali, nazionali e internazionali. 10. I campioni, prima e dopo la fissazione, e tutti i materiali esposti ad essi devono essere

manipolati come potenziali vettori di infezione e smaltiti con le opportune precauzioni (16). Non pipettare mai i reagenti con la bocca ed evitare che reagenti e campioni entrino in contatto con la pelle e le membrane mucose. Se i reagenti entrano in contatto con aree sensibili, lavare con abbondante acqua corrente.

11. Minimizzare la contaminazione microbica dei reagenti per evitare risultati errati. 12. Rispettare i tempi, le temperature e le modalità di incubazione specificati per evitare artefatti. 13. Metodi di fissazione tissutale e uno spessore del campione diversi da quelli specificati

possono alterare la morfologia dei tessuti e/o l’intensità dei segnali. 14. Per evitare l’evaporazione della miscela di sonde HER2/CEN-17 durante l’ibridazione,

assicurare una umidità sufficiente nella camera di ibridazione. 15. I reagenti sono stati diluiti in modo ottimale. Ulteriori diluizioni possono causare perdita di

prestazione. 16. Indossare dispositivi di protezione individuale appropriati per evitare il contatto con gli occhi e

con la pelle. Per ulteriori informazioni, fare riferimento alla scheda di sicurezza dei materiali (Safety Data Sheet, SDS) corrispondente.

17. A causa della natura eterogenea dei campioni di cancro gastrico, è importante eseguire un controllo accurato di tutto il campione, per valutare la distribuzione del segnale prima di selezionare l’area per il conteggio dei segnali.

18. Si sconsiglia di valutare campioni molto piccoli (i campioni devono avere una morfologia integra e nuclei sufficienti per il conteggio).

19. Se si esegue l’analisi HER2 FISH su un campione proveniente da biopsia, è necessario analizzare più (7-8) campioni bioptici da differenti regioni del tumore, al fine di garantire un’accurata determinazione dello stato dell’HER2.

20. Per l’identificazione di tutti i nuclei di tessuto in un campione bioptico, è importante ispezionare il vetrino colorato H&E.

21. Solo vaschette pulite di colorazione devono essere usate per il metodo di immersione in pepsina (Fase 2. Metodo C).

Conservazione - Gastrico Conservare la miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH (Fiala 3) a -18 °C al buio. Tutti gli altri reagenti possono essere conservati a 2–8 °C al buio. Tutti i reagenti tollerano la conservazione congelati. Il congelamento e lo scongelamento dei reagenti per un massimo di 10 volte non ne influenza la prestazione.

La pepsina, la miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH e il mezzo di montaggio per fluorescenza (fiale 2A, 3 e 5) possono risultare alterati se esposti a calore. Non lasciare questi componenti a temperatura ambiente.

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La miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH e il mezzo di montaggio per fluorescenza (fiale 3 e 5) possono risultare alterati se esposti a luce intensa. Non conservare questi componenti né eseguire l’analisi in condizioni di luce intensa, come per esempio la luce solare diretta.

Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza stampata sulla confezione del kit. Se i reagenti sono conservati in condizioni diverse da quelle specificate nel presente inserto della confezione, l’utente deve verificarne la prestazione (13).

Non sono stati osservati segni evidenti che suggeriscano l’instabilità di questo prodotto; Pertanto, è importante esaminare cellule normali nella sezione tissutale analizzata. Se si dovesse osservare un pattern di fluorescenza inatteso non attribuibile a modifiche delle procedure di lavoro e si sospetta un problema relativo al kit HER2 IQFISH pharmDx, contattare il Customer Support.

Specimen preparation (Allestimento tessuto) - Gastrico I campioni di adenocarcinomi dello stomaco o della giunzione gastroesofagea ottenuti con biopsie, escissioni o resezioni devono essere manipolati in modo tale da preservare il tessuto per l’analisi FISH. Utilizzare per tutti i campioni i metodi standard per la colorazione immunoistochimica (14). Durante l’analisi di piccoli campioni bioptici, verificare la morfologia integra del tumore e la presenza di nuclei sufficienti per il conteggio del segnale. Se si esegue l’analisi HER2 FISH su un campione proveniente da biopsia, è necessario analizzare più (7-8) campioni bioptici da differenti regioni del tumore, al fine di garantire un’accurata determinazione dello stato dell’HER2.

Sezioni incluse in paraffina Sono idonei per l’uso in questo test solamente i tessuti preservati in formalina tamponata neutra e inclusi in paraffina. Per esempio, i campioni devono essere bloccati in uno spessore di 3 o 4 mm e fissati per 18–24 ore in formalina tamponata neutra. Nello studio ToGA, i campioni bioptici sono stati fissati per 6–8 ore (per riferimenti sullo studio, vedere (25)). I tessuti vengono successivamente disidratati attraverso il passaggio in una serie di etanolo e xilene e sottoposti ad infiltrazione di paraffina fusa ad una temperatura non superiore a 60 °C. I tessuti sottoposti a fissazione e inclusione in modo corretto preservano la loro morfologia a tempo indeterminato prima del taglio delle sezioni e del montaggio su vetrino se conservati in luogo fresco (15–25 °C) (14, 15). Altri fissativi non sono adatti.

I campioni di tessuto devono essere tagliati in sezioni di 3–6 µm.

I vetrini necessari per l’analisi dell’amplificazione del gene HER2 e la conferma della presenza tumorale devono essere preparati contemporaneamente. Si consiglia di preparare almeno due sezioni seriali, una sezione per la presenza del tumore colorata con ematossilina ed eosina (colorazione “HE”) e l’altra per l’analisi dell’amplificazione del gene HER2. Si raccomanda di montare le sezioni tissutali su Dako Silanized Slides, codice S3003 oppure su vetrini polilisinati. I campioni devono essere analizzati entro 4–6 settimane dal taglio, quando conservati a temperatura ambiente (20–25 °C).

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ISTRUZIONI PER L’USO - Gastrico

A. Preparazione dei reagenti - Gastrico Per ragioni di praticità, prima di procedere alla colorazione è opportuno preparare i reagenti elencati di seguito:

A.1 Soluzione di pretrattamento Eventuali cristalli presenti nella fiala 1 si dissolvono a temperatura ambiente. Assicurarsi che non vi siano cristalli presenti prima della preparazione dei reagenti.

Diluire una quantità sufficiente della fiala (soluzione di pretrattamento 20) diluendo in un rapporto 1:20 la soluzione concentrata della fiala in acqua distillata o deionizzata. La soluzione diluita non utilizzata può essere conservata a 2–8 °C per un mese. Eliminare la soluzione diluita se appare torbida.

A.2 Tampone di lavaggio di stringenza Preparare il tampone di lavaggio di stringenza per diluizione 1:20 della soluzione concentrata della fiala 4 (tampone di lavaggio di stringenza 20) in acqua distillata o deionizzata. La soluzione tampone diluita non utilizzata può essere conservata a 2–8 °C per un mese. Eliminare la soluzione tampone diluita se appare torbida.

A.3 Tampone di lavaggio Preparare il tampone di lavaggio in quantità sufficiente per diluizione 1:20 della soluzione concentrata della fiala 6 (tampone di lavaggio 20) in acqua distillata o deionizzata. La soluzione tampone diluita non utilizzata può essere conservata a 2–8 °C per un mese. Eliminare la soluzione tampone diluita se appare torbida.

A.4 Serie di etanolo A partire da una soluzione di etanolo al 96%, preparare 3 vaschette di etanolo al 70%, all’85% e al 96%. Conservare le vaschette coperte a temperatura ambiente oppure a 2–8 °C ed utilizzare per trattare un massimo di 200 vetrini. Eliminare le soluzioni se appaiono torbide.

A.5 Soluzione pepsina Una soluzione di pepsina è necessaria solo quando si utilizza il metodo di immersione in pepsina (Metodo C). Preparare la soluzione di pepsina come segue:

Per un contenitore da 6 vetrini, preparare 60 mL di soluzione di pepsina:




Mettere il coperchio sul contenitore ed equilibrare la soluzione di pepsina a 37 (±2) °C a bagnomaria. Per un contenitore da 24 vetrini, preparare 240 mL di soluzione di pepsina:



Aggiungere 24 mL di Pepsin (Fiala 2A) fredda (2–8 °C) al contenitore.

Mettere il coperchio sul contenitore ed equilibrare la soluzione di pepsina a 37 (±2) °C a bagnomaria. La soluzione di pepsina equilibrata deve essere utilizzata entro 5 ore.

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B. Procedura di colorazione - Gastrico

B.1 Note sulla procedura Prima dell’uso, l’utente deve leggere attentamente le seguenti istruzioni e conoscere bene tutti i componenti (vedi la sezione “Precauzioni”).

Tutti i reagenti devono essere equilibrati alle seguenti temperature prima dell’uso:

Fiala 1:la soluzione di pretrattamento diluita deve essere equilibrata a 95–99 °C se il bagnomaria è stato usato per il pretrattamento (B3. Protocollo di colorazione, Passaggio 1: Metodo di pretrattamento A). Se si utilizza un forno a microonde con funzione di rilevazione per il pretrattamento (B3. Protocollo di colorazione, Passaggio 1: Metodo di pretrattamento B), è necessario equilibrare la soluzione di pretrattamento a una temperatura ambiente di 20–25 °C.

Fiala 2A: La pepsina deve essere applicata a 2–8 °C (B3, Protocollo di colorazione, Fase 2 Metodo A e B) e mantenuto continuamente freddo.

Fiala 2B: il diluente pepsina (10x) deve essere applicato a 2–8 °C (B3, Protocollo di colorazione, Fase 2 Metodo C).

Fiala 3: La miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH si separa in due fasi se conservata a -18 °C. Prima di usare la fiala 3, assicurarsi che solo una fase sia presente equilibrando la miscela a temperatura ambiente (20–25 °C) e miscelando. Scongelare la fiala 3 a temperatura ambiente (20–25 °C) per un massimo di 30 minuti (proteggere dalla luce forte del sole), quindi miscelare bene al fiala per 15 secondi a 2500 rpm usando un miscelatore vortex. Conservare la fiala 3 a -18 °C subito dopo l’uso.

Fiala 4: per il tampone di lavaggio di stringenza diluito: una vaschetta deve essere equilibrata a temperatura ambiente, l’altra a 63 (±2) °C prima dell’uso.

Fiala 5: il mezzo di montaggio per fluorescenza può essere applicato a qualsiasi temperatura nell’intervallo 2–25 °C. Fiala 6: il tampone di lavaggio diluito deve essere equilibrato a temperatura ambiente, a 20–25 °C. il collante per coprioggetto può essere applicato a qualsiasi temperatura nell’intervallo 2–25 °C. Tutte le fasi della procedura devono svolgersi alla temperatura indicata. La procedura include un numero di fasi di disidratazione, seguite dall’essiccazione delle sezioni tissutali. Assicurare che le sezioni tissutali siano completamente essiccate prima di procedere alla fase successiva. Non lasciare andare a secchezza le sezioni tissutali durante le fasi procedurali.

Se la procedura di colorazione deve essere interrotta, i vetrini possono essere mantenuti nel Wash Buffer 1 dopo la fase di sparaffinatura sino ad un’ora a temperatura ambiente (20–25 °C) senza alterare il risultato.

B.2 Trattamento dei tessuti prima della colorazione Sparaffinatura e reidratazione: prima dell’analisi, i vetrini con i tessuti devono essere sparaffinati per eliminare il mezzo di inclusione e reidratati. Evitare la rimozione incompleta della paraffina. La presenza di eventuali residui del mezzo di inclusione può provocare un aumento della colorazione aspecifica. Questa operazione deve essere eseguita a temperatura ambiente (20–25 °C). 1. Immergere i vetrini in un bagno di xilene e incubare per 5 (±1) minuti. Cambiare il bagno e

ripetere il procedimento. 2. Eliminare l’eccesso di liquido picchiettando i vetrini e immergerli in etanolo al 96% per 2 (±1)

minuti. Cambiare il bagno e ripetere il procedimento. 3. Eliminare l’eccesso di liquido picchiettando i vetrini e immergerli in etanolo al 70% per 2 (±1)

minuti. Cambiare il bagno e ripetere il procedimento.

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4. Eliminare l’eccesso di liquido picchiettando i vetrini e immergerli in tampone di lavaggio diluito (vedi ISTRUZIONI PER L’USO, sezione A.3) per almeno 2 minuti. Iniziare la procedura di colorazione come descritto nella sezione B,3, fase 1, Pretrattamento.

Le soluzioni di xilene e di alcol devono essere sostituite dopo 200 vetrini o meno.

Si possono utilizzare derivati dello xilene.

NOTA: le istruzioni e i reagenti forniti in questo kit sono stati studiati per assicurare prestazioni ottimali. L’ulteriore diluizione dei reagenti o una variazione delle temperature di incubazione potrebbero generare risultati erronei o discordanti. Differenze nella processazione del tessuto e nei procedimenti tecnici in uso presso il laboratorio dell’utente possono invalidare i risultati del saggio.

B.3 Protocollo di colorazione Fase 1: pretrattamento Il pretrattamento può essere effettuato sia usando un bagnomaria come descritto nel metodo A) che un forno a microonde con funzione di rilevazione come descritto nel metodo B.

Metodo A: Pretrattamento con bagnomaria Riempire le vaschette per la colorazione, p.es. vaschette di Coplin, con la soluzione di pretrattamento diluita (vedi ISTRUZIONI PER L’USO, sezione A.1). Porre le vaschette contenenti la soluzione di pretrattamento diluita in bagnomaria. Riscaldare il bagnomaria e la soluzione Pre-Treatment Solution a 95–99 °C. Misurare la temperatura all’interno della vaschetta con un termometro calibrato, verificando che sia corretta. Coprire le vaschette con il rispettivo coperchio per stabilizzare la temperatura ed evitare l’evaporazione.

Immergere le sezioni sparaffinate a temperatura ambiente nella soluzione di pretrattamento preriscaldata nelle vaschette per la colorazione. Ricontrollare la temperatura ed incubare per 10 (±1) minuti a 95–99 °C. Rimuovere tutta la vaschetta con i vetrini dal bagnomaria. Rimuovere il coperchio e lasciare raffreddare i vetrini nella soluzione di pretrattamento per 15 minuti a temperatura ambiente.

Trasferire i vetrini in una vaschetta contenente il tampone di lavaggio diluito (vedi ISTRUZIONI PER L’USO, sezione A.3) per 3 minuti a temperatura ambiente (20–25 °C).

Sostituire il tampone di lavaggio e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti.

NOTA: la soluzione Pre-Treatment Solution è un prodotto esclusivamente monouso. Non riutilizzare. Metodo B: Pretrattamento con forno a microonde munito di funzione di rilevazione Riempire una vaschetta in plastica con la soluzione di pretrattamento diluita a temperatura ambiente (20–25 °C). Immergere le sezioni sparaffinate nella soluzione di pretrattamento, coprire la vaschetta con un coperchio forato e collocarla nel forno a microonde. Selezionare la funzione del sensore di ebollizione e programmarlo in modo che rimanga in funzione per 10 minuti dopo il raggiungimento della temperatura di ebollizione*.

Dopo 10 minuti di incubazione, rimuovere la vaschetta con i vetrini del forno, rimuovere il coperchio e lasciare raffreddare per 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire i vetrini in una vaschetta con tampone di lavaggio e lasciarli immersi per 3 minuti a temperatura ambiente (20–25 °C). Sostituire il tampone di lavaggio e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti. * Per forno a microonde con funzione di rilevazione si intende un forno munito di un sensore e di programmi che

consentano di portare inizialmente la soluzione di pretrattamento al punto di ebollizione e successivamente di mantenere la temperatura di pretrattamento richiesta (superiore a 95 ºC) durante il conto alla rovescia dal tempo impostato (10 (±1) minuti). Alcuni modelli di forni a microonde con funzione di rilevazione non prevedono la possibilità di impostare un intervallo di tempo per il conto alla rovescia. Se il modello dispone solo di programmi pre-impostati, fare attenzione a selezionare un programma che mantenga la temperatura di pretrattamento richiesta (superiore a 95 ºC) per almeno 10 (±1) minuti e arrestare manualmente il programma dopo 10 (±1) minuti.

NOTA: la soluzione Pre-Treatment Solution è un prodotto esclusivamente monouso. Non riutilizzare.

Fase 2: Soluzione pepsina o pepsina pronta all’uso (RTU) L’incubazione in pepsina può essere eseguita tramite applicazione diretta di gocce di pepsina RTU sui vetrini a temperatura

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ambiente (20–25 °C) (Metodo A) o a 37 °C (Metodo B). In alternativa, i vetrini possono essere immersi in una soluzione di pepsina e incubati a 37 (±2) °C (Metodo C).

Metodo A e Metodo B:

Eliminare picchiettando il tampone in eccesso. Usando carta bibula (per esempio una salviettina assorbente oppure carta di tessuto assorbente), asciugare accuratamente il vetrino attorno al campione per rimuovere ogni eccesso di liquido e mantenere i reagenti all’interno dell’area prescritta.

Applicare 5–8 gocce (250 µL) di Pepsin (Fiala 2A) fredda (2–8 °C), in modo da coprire il campione. Conservare la pepsina sempre a 2–8 °C.

Metodo A: Pepsina, RTU – Incubazione a 20–25 °C Incubare per 5–15 minuti a temperatura ambiente (20–25 °C). Per la maggior parte dei campioni, è sufficiente un tempo di incubazione di 5–15 minuti; tuttavia, il tempo ottimale può variare a seconda della fissazione dei tessuti e/o lo spessore dei campioni e deve essere determinato dall’utente.

Eliminare picchiettando la pepsina ed immergere le sezioni in tampone di lavaggio diluito (vedi ISTRUZIONI PER L’USO, sezione A.3) per 3 minuti a temperatura ambiente (20–25 °C).

Sostituire il tampone Wash Buffer diluito e lasciare a bagno le sezioni per altri 3 minuti. Continuare la disidratazione.

Metodo B: Pepsina, RTU – Incubazione a 37 °C Collocare il campione con pepsina in un blocco termico a 37 °C, come Dako Hybridizer, e lasciarlo in incubazione per 3–5 minuti. Per la maggior parte dei campioni, è sufficiente un tempo di incubazione di 3–5 minuti; tuttavia, il tempo ottimale può variare a seconda della fissazione dei tessuti e/o lo spessore dei campioni e deve essere determinato dall’utente.

Picchiettare per rimuovere la soluzione di pepsina in eccesso e immergere le sezioni nel tampone di lavaggio diluito per 3 minuti a temperatura ambiente (20–25 °C).

Sostituire il tampone di lavaggio e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti. Continuare la disidratazione.

Disidratare le sezioni di tessuto in una serie ascendente di etanolo: 2 minuti in etanolo al 70%, 2 minuti in etanolo all’85% e 2 minuti in etanolo al 96%. Lasciare essiccare le sezioni tissutali completamente all’aria. Metodo C: Soluzione pepsina - Immersione dei vetrini in soluzione di pepsina a 37 °C

Il kit contiene reagenti sufficienti per quattro cicli separati (soluzione pepsina 60 mL, piccolo contenitore per sei vetrini) o un unico ciclo (soluzione pepsina 240 mL, contenitore grande per 24 vetrini). Preparare la soluzione di pepsina come descritto nella sezione A.5.

Mettere il coperchio sul contenitore ed equilibrare la soluzione di pepsina a 37 (±2) °C a bagnomaria. Assicurarsi che la temperatura sia stabilizzata. Misurare la temperatura interna della vaschetta con un termometro calibrato, verificando che sia corretta.

Eliminare picchiettando il tampone in eccesso. Immergere i vetrini in soluzione di pepsina a 37 (±2) °C e incubare per 20–30 minuti. Per la maggior parte dei campioni, è sufficiente un tempo di incubazione di 20–30 minuti; tuttavia, il tempo ottimale può variare a seconda della fissazione dei tessuti e/o lo spessore dei campioni e deve essere determinato dall’utente.

Picchiettare per rimuovere la pepsina in eccesso e immergere le sezioni nel tampone di lavaggio diluito per 3 minuti a temperatura ambiente (20–25 °C) Sostituire il tampone di lavaggio e lasciare le sezioni immerse per altri 3 minuti. Continuare la disidratazione.

Disidratare le sezioni di tessuto in una serie ascendente di etanolo: 2 minuti in etanolo al 70%, 2 minuti in etanolo all’85% e 2 minuti in etanolo al 96%.

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Lasciare essiccare le sezioni tissutali completamente all’aria.

Fase 3: Miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH La miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH si separa in due fasi se conservata a -18 °C. Prima di usare la fiala 3, assicurarsi che solo una fase sia presente equilibrando la miscela a temperatura ambiente (20–25 °C) e miscelando. Scongelare la fiala 3 a temperatura ambiente (20–25 °C) per un massimo di 30 minuti (proteggere dalla luce forte del sole), quindi miscelare bene al fiala per 15 secondi a 2500 rpm usando un miscelatore vortex. Conservare la fiala 3 a -18 °C subito dopo l’uso. Applicare 10 µL di miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH (fiala 3) al centro della sezione tissutale. Ricoprire immediatamente la miscela di sonde con un vetrino coprioggetto 22 mm x 22 mm e lasciare che il reagente si diffonda in modo omogeneo. Evitare l’intrappolamento di bolle d’aria. Eliminare eventuali bolle d’aria presenti picchiettando delicatamente con le pinzette per allontanarle dal tessuto.

Conservare la fiala 3 a -18 °C subito dopo l’uso. Sigillare il coprioggetto distribuendo il collante attorno al bordo. Lasciare che il collante si sovrapponga al coprioggetto e al vetrino formando così una chiusura ermetica. Assicurarsi che il collante ricopra l’intero bordo del coprioggetto.

Preparare Dako Hybridizer* (codice S2450 o S2451) per la fase di ibridazione. Verificare che gli Humidity Control Strips (codice S2452) siano saturati e ottimali per l’uso. Avviare l’Hybridizer e selezionare il programma per:

Denaturare a 66 °C per 10 minuti e quindi eseguire l’ibridazione a 45 °C per 60–120 minuti.

Collocare i vetrini nell’Hybridizer, verificare che il coperchio sia perfettamente chiuso e avviare il programma. Per istruzioni dettagliate consultare la Guida dell’utente Dako Hybridizer. * Per la denaturazione e l’ibridazione è possibile anche usare altra strumentazione che consenta di ottenere condizioni

identiche a quelle descritte in precedenza.

Collocare i vetrini su una superficie piatta di metallo o pietra (termoblocco o blocco in un forno di ibridazione) preriscaldata a 66 (±1) °C. Denaturare per 10 minuti,

Collocare i vetrini all’interno di una camera di ibridazione umidificata precedentemente riscaldata. Richiudere la camera con un coperchio e incubare a 45 (±2) °C per 60–120 minuti. Si noti che la temperatura di ibridazione di 37°°C non è adatta per l’uso con le sonde contenute in questo kit.

Fase 4: Stringent Wash Riempire due vaschette per la colorazione, p. es. vaschette di Coplin, con il tampone di lavaggio di stringenza diluito (vedi ISTRUZIONI PER L’USO, sezione A.2). Si raccomanda di utilizzare un volume minimo di 100 mL oppure 15 mL per vetrino in ciascuna vaschetta.

Collocare una vaschetta contenente il tampone di lavaggio di stringenza diluito a temperatura ambiente in una cappa aspirante e l’altra in un bagnomaria. Riscaldare il bagnomaria e il tampone stringente diluito a 63 (±2) °C. Assicurarsi che la temperatura si sia stabilizzata. Coprire le vaschette con il rispettivo coperchio per stabilizzare la temperatura ed evitare l’evaporazione. Con un termometro calibrato, verificare che la temperatura all’interno della vaschetta nel bagnomaria sia corretta. Il tampone di lavaggio di stringenza contiene un detergente e può diventare torbido a 63 °C. Tuttavia, questo fenomeno non altera la prestazione del reagente.

Usando pinzette o guanti, estrarre i vetrini dalla camera di ibridazione, rimuovere delicatamente il collante e il coprioggetto e collocare i vetrini uno alla volta nella vaschetta di prelavaggio a temperatura ambiente.

Dopo avere rimosso tutti i vetrini coprioggetto, trasferire i vetrini dalla vaschetta di prelavaggio a temperatura ambiente alla vaschetta a 63 (±2) °C nel bagnomaria.

Subito dopo aver trasferito i vetrini nella vaschetta a 63 (±2) °C in bagnomaria, deve essere avviato il timer. Eseguire un lavaggio stringente per 10 minuti esatti.

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Estrarre i vetrini dal tampone di lavaggio di stringenza diluito ed immergere le sezioni in tampone di lavaggio diluito per 3 minuti a temperatura ambiente (20–25 °C).

Sostituire il tampone Wash Buffer diluito e lasciare a bagno le sezioni per altri 3 minuti.

Disidratare le sezioni di tessuto in una serie ascendente di etanolo: 2 minuti in etanolo al 70%, 2 minuti in etanolo all’85% e 2 minuti in etanolo al 96%.

Lasciare essiccare le sezioni tissutali completamente.

Fase 5: Montaggio Applicare 15 µL di mezzo di montaggio per fluorescenza contenente DAPI (fiala 5) sull’area bersaglio del vetrino e coprire con un vetrino coprioggetto.

NOTA: è possibile eseguire una lettura dei vetrini dopo 15 minuti o entro 7 giorni dal montaggio. Tuttavia, i preparati potrebbero sbiadire se i vetrini sono esposti a luce o temperature eccessive. Per minimizzare questo rischio, conservare i vetrini al buio a -18–8 °C.

Controllo di qualità - Gastrico 1. I segnali devono essere chiari, netti e facili da valutare. 2. Le cellule normali consentono un controllo interno del ciclo di colorazione.

• Le cellule normali devono presentare 1-2 segnali verdi chiaramente visibili indicanti che la sonda di PNA per CEN-17 è stata ibridata con successo alla regione centromerica del cromosoma 17.

• Le cellule normali devono presentare 1-2 segnali rossi chiaramente visibili indicanti che la sonda di DNA per HER2 è stata ibridata con successo al sito di amplificazione (amplicon) di HER2.

• A causa del taglio dei tessuti, alcune cellule normali possono presentare meno dei 2 segnali attesi per ciascun colore.

• La mancata rilevazione dei segnali nelle cellule normali indica che il saggio non è valido e i risultati devono essere considerati non validi.

3. La morfologia nucleare deve risultare intatta all’esame con un filtro DAPI. La presenza di numerose cellule fantasma e una morfologia nucleare generalmente scarsa indicano una digestione eccessiva del campione, con conseguente perdita o frammentazione dei segnali. Questi campioni devono essere considerati non validi.

4. Il numero minimo di cellule tumorali valutabili è 20. 5. Le differenze che esistono tra i laboratori per quanto riguarda lo svolgimento di procedure

quali la fissazione, l’allestimento e l’inclusione del tessuto, ad esempio, possono determinare una certa variabilità dei risultati, per cui si rendono necessari controlli interni periodici.

Interpretazione della colorazione - Gastrico Tessuti idonei alla valutazione Collocare il tumore nel contesto del vetrino colorato con “HE” e valutare la stessa area sul vetrino colorato secondo la tecnica FISH (nel filtro DAPI). Limitare la valutazione ai soli campioni provenienti da pazienti affetti da adenocarcinoma gastrico con giunzione gastroesofagea. In caso di metaplasia intestinale e adenocarcinoma presenti nello stesso campione, assegnare un punteggio al solo componente dell’adenocarcinoma. Evitare le aree forte infiammazione, di necrosi e le aree in cui i perimetri nucleari risultano ambigui. Non includere i nuclei che richiedono una valutazione soggettiva. Ignorare i nuclei con un segnale di intensità debole e un fondo non specifico o elevato.

All’inizio, valutare a livello microscopico il vetrino FISH completo sottoposto a colorazione e l’area assegnata sulla sezione H&E. Prima di valutare il vetrino FISH sottoposto a colorazione, annotare la distribuzione complessiva del segnale (omogeneo o eterogeneo) sul foglio per il conteggio dei segnali. In caso di distribuzione eterogenea, annotare l’eventuale presenza di amplificazione focale o amplificazione a singole cellule (mosaico).

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1) Distribuzione omogenea dei segnali Nel caso in cui la distribuzione del segnale sia omogenea, conteggiare il numero di centometri dei cromosomi (segnali verdi) e il numero di geni HER2 (segnali rossi), da 20 cellule in 1-2 aree tumorali rappresentative.

2) Distribuzione eterogenea dei segnali Nel caso in cui la distribuzione del segnale sia eterogenea, enumerare un totale di 20 cellule da aree selezionate come specificato di seguito: A) Se è presenza un’amplificazione focale, è necessario selezionare le aree con cellule amplificate. B) Se sono presenti cellule disomali e polisomali, amplificate o con distribuzione a mosaico, contare nelle aree con cellule amplificate. All’interno di queste aree, non solo le cellule amplificate ma anche le cellule adiacenti non amplificate devono essere contate per un totale di 20 cellule.

Ove possibile, non selezionare aree sovrapposte. Ignorare la colorazione di DNA batterico Alcune cellule specializzate (mastociti e macrofagi), presenti nel tessuto gastrico, mostrano un livello elevato di colorazione da parte della sonda HER2 a causa della presenza di DNA batterico. Ciò implica la presenza di cellule rosse e fluorescenti, chiaramente distinte dalle cellule tumorali con amplificazione del gene HER2 elevata. Conteggio dei segnali Quando viene selezionata un’area per la valutazione dei segnali, cominciare l’analisi in uno dei 20 nuclei adiacenti selezionati e contare cellula per cellula ignorando solo i nuclei che non rispondono ai criteri di qualità. Contare il numero di segnali all’interno del bordo nucleare di ciascun nucleo esaminato secondo le seguenti linee guida (vedi anche Appendice 7).

- Variare la profondità del fuoco per rilevare tutti i segnali del nucleo individuale. - Contare due segnali di dimensioni eguali e separati da una distanza pari o inferiore al diametro

del segnale come un solo segnale. La distanza deve essere almeno uguale al diametro di un segnale di dimensioni normali per contare due segnali separati. Quando la distanza tra due segnali è inferiore al diametro di un segnale, deve essere contata come un unico segnale.

- Nei nuclei con elevati livelli di amplificazione del gene HER2, i segnali HER2 possono essere posizionati molto vicini l’uno all’altro, formando un cluster di segnali. In questi casi, il numero di segnali HER2 non può essere contato, ma deve essere stimato. Prestare particolare attenzione ai segnali verdi, dal momento che i cluster dei segnali HER2 rossi possono ricoprire i segnali verdi rendendoli invisibili. In caso di dubbio, controllare i segnali verdi con un filtro FITC specifico.

Non inserire nella scala di lettura nuclei senza segnali o con segnali di un solo colore. Inserire nella scala di lettura solamente i nuclei con uno o più segnali FISH di ciascun colore.

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Guida al conteggio dei segnali 1

Non contare. I nuclei si sovrappongono, non tutte le aree sono visibili.

2 Due segnali verdi, non inserire nella scala di lettura nuclei con segnali di un solo colore

3 Contare come 3 segnali verdi e 12 rossi (stima del cluster)

4 Contare come 1 segnale verde e 1 segnale rosso. Due segnali di dimensioni eguali e separati da una distanza pari o inferiore al diametro di un segnale vengono contati come un solo segnale

5 Non contare (nucleo iper- o ipodigerito) Segnali mancanti al centro del nucleo (nucleo a forma di ciambella)

6 Contare come 2 segnali verdi e 3 segnali rossi. Due segnali di dimensioni eguali e separati da una distanza pari o inferiore al diametro di un segnale vengono contati come un solo segnale

7 Contare come 1 segnale verde e 5 segnali rossi.

8 Contare come 3 segnali verdi (1 segnale verde è sfuocato) e 3 segnali rossi

9 Cluster di segnali rossi che coprono segnali verdi; controllare i segnali verdi con un filtro FITC specifico, oppure non contare

Registrare i conteggi in una tabella, come riportato nell’Appendice 5 e 6.

Contare 20 nuclei per campione di tessuto, se possibile da aree di tumore distinte.

Calcolare il rapporto HER2/CEN-17 dividendo il numero totale di segnali HER2 rossi per il numero totali di segnali CEN-17 verdi.

I campioni con un rapporto HER2/CEN-17 superiore o pari a 2 devono essere considerati amplificati per il gene HER2 (26).

I risultati vicini o coincidenti al valore di cut-off (1,8–2,2) devono essere interpretati con cautela.

Se il rapporto è ad un valore limite (1,8–2,2), eseguire il conteggio di altri 40 nuclei e calcolare il rapporto per i 40 nuclei. Se il conteggio continua a essere limite, considerare come valido il risultato della seconda valutazione. Ove disponibile, deve essere inclusa una colorazione immunoistochimica di HER2 per un miglior orientamento durante il secondo conteggio.

In caso di dubbio, il vetrino del campione deve essere sottoposto ad una nuova lettura. Per i casi limite, si raccomanda un consulto tra il patologo e il medico curante.

oppure

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Limitazioni - Gastrico 1. FISH è una tecnica diagnostica multistadio che richiede un addestramento specifico per la

selezione dei reagenti appropriati, la selezione, la fissazione e la processazione dei tessuti, la preparazione del vetrino per FISH e l’interpretazione dei risultati della colorazione.

2. I risultati della tecnica FISH dipendono dalla manipolazione e dalla processazione del tessuto prima della colorazione. L’errata esecuzione della fissazione, il lavaggio, l’essiccazione, il riscaldamento, il taglio oppure la contaminazione con altri tessuti o fluidi possono alterare l’ibridazione della sonda. Risultati incoerenti possono essere dovuti anche a modifiche apportate ai metodi di fissazione e di inclusione o ad irregolarità intrinseche del tessuto.

3. Per risultati ottimali e riproducibili, i vetrini dei tessuti devono essere sparaffinati completamente. La rimozione della paraffina deve essere completa all’inizio dell’intero processo di colorazione. (vedi ISTRUZIONI PER L’USO, sezione B.2).

4. Utilizzare solamente bagnomaria, blocchi riscaldanti e forni per ibridazione a temperatura calibrata. L’uso di altri tipi di apparecchiatura può indurre l’evaporazione della miscela di sonde HER2/CEN-17 durante l’ibridazione e deve essere validato dall’utente.

Caratteristiche prestazionali - Gastrico Dati di base La sicurezza e l’efficacia di trastuzumab (Herceptin™) è stata dimostrata in uno studio clinico (lo studio ToGA) (25). Lo studio è stato pensato come uno studio di fase III multicentro, randomizzato in aperto in pazienti positivi all’HER2 con adenocarcinoma gastrico in stadio avanzato localmente non operabile, ricorrente e/o metastatico dello stomaco o della giunzione gastroesofagea. Nello studio ToGA, la positività all’HER2 è stata definita come positiva all’IHC (3+) (HercepTest™, Dako) e/o positiva tramite HER2 FISH (HER2/CEN-17≥2,0)(HER2 FISH pharmDx Kit, Dako (codice K5331)). Dopo l’inclusione nello studio, i pazienti sono stati sottoposti in maniera randomizzata a chemioterapia (5-FU o capecitabina e cisplatina) o chemioterapia più trastuzumab. L’endpoint primario dello studio era la sopravvivenza complessiva (OS).

Nello studio, sono stati randomizzati in totale 594 pazienti e 584 pazienti hanno assunto il farmaco di studio e sono stati inclusi nell’intero insieme di analisi (FAS, full analyses set). Per l’endpoint primario, la combinazione di chemioterapia più trastuzumab si è dimostrata statisticamente superiore rispetto alla sola chemioterapia. L’OS mediana è aumentata da 11,1 a 13,8 mesi (p=0,0046), con un rapporto di pericolo di 0,74 (95 % CI: 0,60–0,91). Le curve di Kaplan-Meier per l’OS sono mostrate in Figura 3.

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Figura 3. Curva di Kaplan-Meier curve dell’OS (n=584)

Analisi di sottogruppi esplorativi pre-specificati per stato HER2 sono stati eseguiti quando sono stati disponibili i dati. Due nuovi sottogruppi HER2 sono stati definiti post-hoc in base alla valutazione IHC: Gruppo 1 (“gruppo con espressione bassa dell’HER2”):

IHC 0/FISH+ e IHC 1+/FISH+ (n=131)

Gruppo 2 (“gruppo con espressione elevata dell’HER2”):

IHC 2+/FISH+ e IHC 3+ (FISH positivo o FISH negativo o FISH nessun risultato (n=446))

In occasione della ripetizione post-hoc dell’analisi primaria sull’OS per il “gruppo con espressione elevata dell’HER2” (n=446), il beneficio in favore del trattamento combinato è risultato ancora maggiore. L’OS mediana per il gruppo di pazienti sottoposti a chemioterapia più trastuzumab è aumentata a 16,0 mesi rispetto agli 11,8 mesi per i pazienti sottoposti solo a chemioterapia. Il rapporto di pericolo per questa analisi è sceso a 0,65 (95 % CI: 0,51–0,83). Le curve di Kaplan-Meier per l’OS per il “gruppo con espressione elevata dell’HER2” sono mostrate in Figura 4.

11,1

Gruppo di trattamento Tras/Fluoro/Cisp Fluoro/Cisp

Tempo (mesi)

Tempo (mesi) Tras/Fluoro/Cisp Fluoro/Cisp

Log-Rank Test P = 0,0046

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

13,8

Probabilità di sopravvivenza

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Figura 4. Curva di Kaplan-Meier per l’OS per il “gruppo con espressione elevata dell’HER2” (n=446). Lo studio BO18255 ha dimostrato l’utilità clinica di entrambi i HercepTest™ and HER2 FISH pharmDx Kit per la valutazione dello stato dell’HER2 in pazienti con adenocarcinoma gastrico in stadio avanzato localmente non operabile, ricorrente e/o metastatico dello stomaco o della giunzione gastroesofagea. Sensibilità analitica La sensibilità analitica della miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH è stata valutata utilizzando 18 campioni di adecarcinomi gastric. Il rapporto tra il numero di segnali HER2 e CEN-17 è stata calcolata in base ad un conteggio di 20 nuclei di cellule normali presenti attorno al tumore. Il rapporto HER2/CEN-17 per 18 campioni di adenocarcinoma gastrico era compreso tra 0,95 e 1,06.

Specificità analitica Le sonde di DNA per HER2 nella miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH sono state sequenziate e mappate per confermare una copertura totale di 218 kb comprendente il gene HER2. Le sonde di PNA per CEN-17 PNA nella miscela di sonde HER2/CEN-17 IQISH sono state esaminate singolarmente ed in combinazione per confermare l’ibridazione specifica alla regione centromerica del cromosoma 17.

Per misurare la capacità del dosaggio di identificare esclusivamente le sostanze target HER2 e CEN-17 senza interferenza di altre sottosostanze, sono stati eseguiti degli studi su campioni di adenocarcinoma usando la Fiala 3 contenente il campione di ibridazione senza la miscela di sonde. Un totale di 18 campioni sono stati valutati per la presenza di segnali non correlati alla miscela di sonde. Nessun rilevamento di altri target di cromosomi o interferenza con sostanze strettamente correlate è stato osservato in nessuno dei 18 campioni.

Studi di resistenza La robustezza del dosaggio HER2 IQFISH pharmDx è stata valutata variando il tempo di pretrattamento, la temperatura e i metodi di riscaldamento del tampone di pretrattamento (microonde o bagnomaria), il tempo di incubazione in pepsina e il metodo (pepsina RTU o immersione), temperatura e tempo di denaturazione, tempo di ibridazione e tempo e temperatura del lavaggio stringente.

11,8

Probabilità di sopravvivenza

Gruppo di trattamento Tras/Fluoro/Cisp Fluoro/Cisp

Tempo (mesi)

Tempo (mesi) Tras/Fluoro/Cisp Fluoro/Cisp

1,0

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

16,0

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Non è stata osservata alcuna differenza significativa nelle seguenti condizioni sperimentali: • Metodo di pretrattamento A) Bagnomaria per 10 minuti unito a ognuna delle temperature

95 °C, 95–99 °C e 99 °C unitamente a 9, 10 e 11 minuti a 95–99 °C • Metodo di pretrattamento B) Microonde per 9, 10 e 11 minuti a >95 °C. • Metodo digestione pepsina A) con tempi di incubazione di 5, 10 e 15 minuti a temperatura

ambiente (20–25 °C). • Metodo digestione pepsina B) con tempi di incubazione di 3, 4 e 5 minuti a 37 °C). • Metodo digestione pepsina C) con tempi di incubazione di 20, 25 e 30 minuti combinati con

ognuna delle temperature 35, 37 e 39 °C. • Denaturazione per 10 minuti unito a ognuna delle temperature 65, 66 e 67 °C unitamente a 9,

10 e 11 minuti a 66 °C. • Tempo di ibridazione di 60, 90 e 120 minuti a 45 °C. • Lavaggio stringente per 10 minuti unito a ognuna delle temperature 61, 63 e 65 °C unitamente

a 9, 10 e 11 minuti a 63 °C. Nota: per gli studi di resistenza, è stato modificato solo un parametro alla volta nella procedura di colorazione, mantenendo costanti tutti gli altri parametri. Si raccomanda di rispettare i tempi e le temperature indicate nella procedura di colorazione. La procedura di colorazione per HER2 IQFISH pharmDx offre variabili del protocollo per pretrattamento, digestione pepsina e tempo di ibridazione. Ogni opzione unica è stata convalidata rispetto allo stato del gene HER2. La convalida è stata eseguita su 10 campioni di adenocarcinoma della giunzione gastroesofagea e gastrico FFPE per ognuna delle 12 possibili combinazioni. HER2 FISH pharmDx Kit (K5331) è stato usato come riferimento. Il rapporto HER2/CEN-17 per ogni singolo campione è mostrato in Figura 5. Le tabulazioni crociate tra i 12 test e la colorazione di riferimento hanno mostrato un accordo complessivo nello stato del gene HER2 del 100% (10/10) con limiti di confidenza inferiori e superiori a due code del 96% a 78,3% e 100% rispettivamente. Il valore Kappa era 1,00 e il test di McNemars ha mostrato assenza di scostamento (valore p a due code pari a 1,00).

Figura 5. Rapporti singoli HER2/CEN-17 per 10 campioni di adenocarcinoma gastrico usando le 12 variazioni possibili del protocollo con HER2 IQFISH pharmDx (codice K5731) (Test 1-12) e HER2 FISH pharmDx Kit (codice K5331) come riferimento (R). La linea orizzontale illustra il valore di cutoff di 2,0.

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Ripetibilità La ripetibilità del rapporto HER2/CEN-17 è stata investigata con il dosaggio HER2 IQFISH pharmDx usando sezioni consecutive di nove campioni di adenocarcinoma gastrico con stato del gene HER2 amplificato e non. Sezioni triplicate di ogni campione sono state testate nello stesso ciclo. Il coefficiente di variazione medio era di 3,5% per campioni non amplificati (range 1%–5%) e 2,8% per campioni amplificati (range 1%–5%).

La ripetibilità su sezioni consecutive di campioni di adenocarcinoma gastrico con spessore diverso (2, 3, 4, 5, 6, e 7 µm) è stata testata con il HER2 IQFISH pharmDx. Il coefficiente di variazione medio del rapporto HER2/CEN-17 riscontrato è risultato pari al 4,5% (range 3–6%), cioè nello stesso intervallo delle sezioni tissutali di uguale spessore e nei criteri di accettazione preimpostati.

Riproducibilità Il dosaggio HER2 IQFISH pharmDx è stato testato per la riproducibilità da lotto a lotto e da osservatore a osservatore usando tre lotti di HER2 IQFISH pharmDx e tre osservatori. La riproducibilità è stata testata su nove campioni di adenocarcinoma gastrico diversi con stato del gene HER2 amplificato e non.

Il coefficiente di variazione medio per la riproducibilità intralotto era di 3,8% per campioni non amplificati (range 2%–7%) e 1,8% per campioni amplificati (range 1%–3%).

Il coefficiente di variazione medio per la riproducibilità da osservatore ad osservatore era di 4,3% per campioni non amplificati (range 3%–5%) e 4,4% per campioni amplificati (range 2%–7%). I campioni di adenocarcinoma gastrico consistevano in 78,8% resezioni e 22,2% di campioni bioptici. 55,6% dei campioni sono stati ottenuti dallo stomaco e 44,4% dalla giunzione gastroesofagea.

Utilità clinica L’utilità clinica del Dako HER2 IQFISH pharmDx (codice K5731) è stata verificata in uno studio comparativo con Dako HER2 FISH pharmDx Kit (codice K5331). Lo studio includeva 79 campioni di cancro gastrico consistenti in tipi di tessuto di adenocarcinoma gastrico diversi, ad es. adenocarcinomi dello stomaco e della giunzione esofagea e resezioni o biopsie con distribuzione del segnale omogenea o eterogenea (focale o a mosaico). I tumori erano stati tutti valutati per lo stato dell’espressione della proteina HER2 usando Dako HercepTest™ (codice K5207). I campioni di ognuno dei quattro gruppi di valutazione IHC (0, 1+, 2+, 3+) sono stati inclusi nello studio. La tabulazione crociata dello stato HER2 ottenuta dai due dosaggi ha restituito un accordo complessivo del 98,7% con limiti inferiore e superiore per l’intervallo di confidenza del 95% a 94,2% e 99,9%. Il valore Kappa era di 0,97, con limiti inferiore e superiore per l’intervallo di confidenza del 95% a 0,92 e 1,00. Il valore p per il test McNemars era 1,00, indicando assenza di scostamento tra i due dosaggi.

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Risoluzione dei problemi - Gastrico Problema Probabile causa Intervento consigliato 1. Nessun segnale o

segnali deboli 1a. Il Kit è stato esposto ad

elevate temperature durante il trasporto o la conservazione

1a. Controllare le condizioni di conservazione. Accertarsi che il ghiaccio secco fosse presente al momento della consegna. Assicurarsi che la fiala 3 sia stata conservata a -18 °C al buio. Controllare che le fiale 2A e 5 siano state conservate ad un massimo di 2–8 °C al buio.

1b. Il microscopio non funziona correttamente

- Il filtro impostato non è adatto

- Lampada errata - La lampada al mercurio

è datata - Le lenti sono sporche o

graffiate - L’olio di immersione non

è adatto

1b. Controllare lo stato del microscopio e verificare che i filtri impiegati siano idonei all’uso con i fluorocromi del kit e che la lampada a mercurio sia corretta e non utilizzata oltre la durata consigliata. (vedere l’Appendice 7). In caso di dubbio, contattare il fornitore del microscopio.

1c. Segnali sbiaditi

1c. Evitare lunghe analisi microscopiche e minimizzare l’esposizione a luce intensa.

1d. Errate condizioni di pretrattamento

1d. Assicurarsi che il pretrattamento avvenga alla temperatura consigliata.

1e. Evaporazione della miscela di sonda durante l’ibridazione

1e. Assicurare una umidità sufficiente nella camera di ibridazione

2. Nessun segnale blu

2a. Errate condizioni del lavaggio di stringenza

2a. Assicurarsi che siano impiegati i tempi e la temperatura raccomandati per il lavaggio di stringenza e che i coprioggetto vengano rimossi prima di eseguire il lavaggio di stringenza

3. Assenza di segnali rossi

3a. Errate condizioni di pretrattamento

3a. Assicurarsi che il pretrattamento avvenga alla temperatura consigliata.

4. Aree senza segnali 4a. Volume della sonda troppo piccolo

4a. Assicurarsi che il volume della sonda sia sufficientemente largo da ricoprire l’area al di sotto del coprioggetto

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Problema Probabile causa Intervento consigliato 4b. Bolle d’aria intrappolate

durante l’applicazione della miscela di sonde o durante il montaggio

4b. Evitare l’intrappolamento di bolle d’aria. Eliminare eventuali bolle d’aria presenti picchiettando delicatamente con le pinzette

5. Colorazione eccessiva del fondo

5a. Metodo di fissazione dei tessuti inadeguato

5a. Assicurarsi che vengano utilizzate solamente sezioni tissutali incluse in paraffina, fissate in formalina

5b. Rimozione incompleta della paraffina

5b. Seguire le procedure di sparaffinatura e di reidratazione descritte nella sezione B.2

5c. Temperatura per il lavaggio di stringenza troppo bassa

5c. Assicurarsi che la temperatura del lavaggio di stringenza sia 63 (±2) °C

5d. La sezione sottoposta a ibridazione è stata esposta a una fonte di luce intensa per troppo tempo.

5d. Evitare lunghe analisi microscopiche e minimizzare l’esposizione a luce intensa

6. Scarsa morfologia dei tessuti

6a. Errato trattamento con pepsina

6a. Rispettare i tempi d’incubazione raccomandati per la pepsina. Vedi sezione B.3, fase 2.

Assicurarsi che il prodotto Pepsin venga utilizzato alla temperatura indicata. Vedi sezione B.1.

6b. Errate condizioni di pretrattamento possono indurre un aspetto non trasparente o torbido

6b. Assicurarsi che il pretrattamento avvenga alla temperatura consigliata.

6c. Un trattamento con Pepsin eccessivamente prolungato o uno spessore troppo piccolo possono provocare la comparsa di cellule fantasma o cellule “donut” (a ciambella).

6c. Abbreviare l’incubazione con Pepsin. Vedi Sezione B.3, fase 2. Assicurarsi che lo spessore di sezione sia 3–6 µm.

7. Livello elevato di autofluorescenza verde sui vetrini, comprese le aree senza tessuto FFPE

7. Uso di vetrini scaduti o sconsigliati

7. Assicurarsi che il vetrino rivestito (Dako Silanized Slides, codice S3003 o vetrini rivestiti in poli-L-lisina) non abbiano superato la data di scadenza.

NOTA: Se il problema non è imputabile a nessuna di queste cause o se l’intervento correttivo consigliato non si rivela efficace, contattare l’Assistenza Tecnica Dako per ricevere ulteriori suggerimenti.

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Appendice 4 - Gastrico HER2 IQFISH pharmDx, codice K5731 Checklist protocollo Rif. scheda del ciclo di colorazione:______________ Data del ciclo: __________________ HER2 IQFISH pharmDx, lotto K5731: __________________ Rif. campione: __________________ Rif. apparecchiatura: __________________ Data di diluizione/scadenza del tampone di lavaggio 1 x (fiala 6 diluita 1:20): _________ /_________

Tessuto fissato in formalina tamponata neutra Sì No

Fase 1: pretrattamento Data di diluizione/scadenza della soluzione di pretrattamento (fiala 1 diluita 1:20)

/

Temperatura misurata della soluzione di pretrattamento (95–99 °C) se si utilizza un bagnomaria per il riscaldamento

°C

Pretrattamento (10 minuti) e raffreddamento (15 minuti) Lavaggio in tampone di lavaggio (fiala 6 diluita 1:20) (2 x 3 minuti)

Fase 2: Pepsina Durata del trattamento con pepsina (fiala 2) a 37 °C o Minuti Durata del trattamento con pepsina (fiala 2) a temperatura ambiente o

Minuti

Durata dell’immersione in pepsina a 37 (±2) °C Minuti Lavaggio in tampone di lavaggio (fiala 6 diluita 1:20) (2 x 3 minuti)


Fase 3: Miscela di sonde HER2/CEN-17 Applicare la miscela di sonde (fiala 3), coprire con il coprioggetto e sigillare con il collante

Misurare la temperatura di denaturazione (66 (±1) °C) °C Denaturazione per 10 minuti Misurare la temperatura di ibridazione (45 (±2) °C) °C Tempo di ibridazione (60–120 minuti) Minuti Fase 4: Stringent Wash Data di diluizione/scadenza del tampone di lavaggio di stringenza (fiala 4 diluita 1:20)

/

Temperatura misurata del tampone di lavaggio di stringenza (63 (±2) °C)

°C

Lavaggio di stringenza (10 minuti) dopo la rimozione dei coprioggetto

Lavaggio in tampone di lavaggio (fiala 6 diluita 1:20) (2 x 3 minuti)

°C


Minuti

Fase 5: montaggio Applicare 15 µL di mezzo di montaggio per fluorescenza (fiala 5) e coprire con il coprioggetto

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Commenti:


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Appendice 5 - Gastrico

HER2 IQFISH pharmDx, codice K5731 Schema di lettura

HER2 IQFISH pharmDx, K5731 lotto: ___________ Rif. scheda del ciclo di colorazione: _____________ Data del ciclo: ________________________ ID campione: _______________

Caratterizzazione della distribuzione dei segnali nel tessuto: Omogenea: Eterogenea - Focale: oppure Eterogenea - Mosaico:

Contare i segnali in 20 nuclei

N. nucleo Rosso (HER2)

Verde (CEN-17) N. nucleo Rosso

(HER2) Verde (CEN-17)

1 11 2 12 3 13 4 14 5 15 6 16 7 17 8 18 9 19

10 20 Totale (1-10) Totale (11-20)

Per la determinazione del rapporto HER2/CEN-17, contare il numero di segnali HER2 e il numero dei segnali CEN-17 negli stessi 20 nuclei e dividere il numero totale dei segnali HER2 per il numero totale dei segnali CEN-17. Se il rapporto HER2/CEN-17 è ad un valore limite (1,8–2,2), eseguire il conteggio su altri 40 nuclei e ricalcolare il rapporto (fare riferimento allo schema di valutazione del riconteggio). I risultati vicini o pari al valore di cut-off (1,8–2,2) devono essere interpretati con cautela (vedi guida sul conteggio).

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Rapporto < 2: amplificazione del gene HER2 non osservata Rapporto ≥ 2: amplificazione del gene HER2 osservata


Data e firma, nome del patologo: Per le linee guida sulla lettura: vedi Interpretazione della colorazione.

HER2 FISH HER2 CEN-17 Rapporto HER2/CEN-17

LETTURA TOTALE (1-20)

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HER2 IQFISH pharmDx, codice K5731 Schema di lettura ricalcolo

HER2 IQFISH pharmDx, K5731 lotto: ___________ Rif. scheda del ciclo di colorazione: _____________ Data del ciclo: ________________________ ID campione: ______________

Segnali nei 40 nuclei aggiuntivi (1-40)

N. nucleo

Rosso HER2

Verde CEN-17

N. nucleo

Rosso HER2

Verde CEN-17

N. nucleo

Rosso HER2

Verde CEN-17

N. nucleo

Rosso HER2

Verde CEN-17

1 11 21 31 2 12 22 32 3 13 23 33 4 14 24 34 5 15 25 35 6 16 26 36 7 17 27 37 8 18 28 38 9 19 29 39 10 20 30 40 Totale 1-10

Totale 11-20

Totale 21-30

Totale 31-40

Per la determinazione del rapporto HER2/CEN-17, contare il numero di segnali HER2 e il numero dei segnali CEN-17 negli stessi 40 nuclei e dividere il numero totale dei segnali HER2 per il numero totale dei segnali CEN-17. Riportare il punteggio totale dei 1-40 nuclei nella tabella seguente.

Rapporto < 2: amplificazione del gene HER2 non osservata Rapporto ≥ 2: amplificazione del gene HER2 osservata


Data e firma, nome del patologo: Per le linee guida sulla lettura: vedi Interpretazione della colorazione.

HER2 FISH HER2 CEN-17 Rapporto HER2/CEN-17

LETTURA TOTALE (1-40)

Cancro gastrico

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HER2 IQFISH pharmDx, codice K5731 Specifiche per il microscopio a fluorescenza Dako raccomanda la seguente apparecchiatura per l’uso con HER2 IQFISH pharmDx, K5731:

1. Tipo di microscopio

• Microscopio ad epifluorescenza.

2. Lampada • Lampada a mercurio da 100 watt (prendere nota dei tempi d’impiego).

3. Obiettivi • Per l’esame del tessuto, utilizzare obiettivi a secco per fluorescenza 10X oppure obiettivi a

immersione d’olio per fluorescenza 16X. • Per un ingrandimento elevato e per la valutazione dei segnali, utilizzare solo obiettivi a

immersione d’olio per fluorescenza, in particolare 100X.

4. Filtri Esistono filtri progettati in modo specifico per singoli fluorocromi. Dako raccomanda l’uso di un filtro DAPI specifico in combinazione con un doppio filtro Texas Red/FITC di alta qualità.

• Filtro DAPI • Doppio filtro Texas Red/FITC • Ai fini della conferma, è possibile utilizzare filtri singoli Texas Red e FITC.

Fluorocromo Lunghezza d’onda di eccitazione Lunghezza d’onda di emissione

FITC 495 nm 520 nm

Texas Red 596 nm 615 nm

Dato che esistono filtri specifici per ogni tipo di microscopio, l’uso dei filtri adatti è fondamentale per una corretta interpretazione. Per ulteriori informazioni, contattare il rivenditore di microscopi oppure il rappresentante Dako di zona.

5. Olio • Olio non fluorescente.

Precauzioni • Non si raccomanda l’uso di una lampada a mercurio da 50 watt. • Non si possono utilizzare filtri a rodamina. • Non si raccomanda l’uso di filtri tripli.

L’uso di un microscopio non ottimizzato potrebbe causare problemi durante la lettura dei segnali fluorescenti. È importante che la fonte di illuminazione non sia utilizzata oltre la data di scadenza e che sia allineata con precisione e a fuoco. È compito del cliente controllare e seguire le raccomandazioni del fabbricante per la lampada a mercurio. Il microscopio deve essere sottoposto a manutenzione e la lampada a mercurio deve essere allineata prima dell’interpretazione dei risultati. È necessario assicurarsi che il campione sia esposto alla luce di eccitazione per il minor tempo possibile, di modo che la fluorescenza non perda intensità. Si raccomanda di consultare il fabbricante per l’impostazione del microscopio utilizzato prima di iniziare la procedura di ibridazione in situ in fluorescenza, oppure fare riferimento alla letteratura.

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Spiegazione dei simboli

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Limiti di temperatura Codeice del lotto

Dispositivo medico-diagnostico in vitro

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Utilizzare entro

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