Frazionamento di un lisato cellulare tramite CENTRIFUGAZIONE Capitolo 3 Centrifugazione preparativa...

Frazionamento di un lisato cellulare tramite

CENTRIFUGAZIONE

Capitolo 3

Centrifugazione preparativa e analitica

1. Centrifugazione preparativa

Centrifugazione analitica è utilizzata principalmente per gli studi di macromolecole purificate o di complessi sovramolecolari isolati

2. Ultracentrifugazione analitica

Centrifugazione preparativa permette di separare i vari elementi di un omogenato cellulare

Centrifughe

Centrifughe preparative

Centrifughe da tavolo•Massimo volume di carico: 24 microprovette da ml 1,5/2.0 •Massima velocità (RPM): 13300 •Massima accelerazione centrifuga

Centrifuga tipo sorvall

Ultracentrifuga analitica

Puo’ operare a velocita’ di 700.000 rpm (500.000g)

Il rotore e’ contenuto in una camera blindata, refrigerata e sottovuoto.

Il rotore è fatto in un materiale particolarmente resistenteEs. TITANIO

La sedimentazione è controllata da un sistema ottico per

consentire l’ osservazione del materiale che va sedimentandosi

Ultracentrifugazione analitica viene utilizzata perdeterminare:

-il grado di purezza di una macromolecola

-la massa molecolare relativa di soluti nel loro stato nativo

-le costanti di affinità tra ligandi e proteine

-esaminare i cambiamenti di massa molecolare relativa di complessi sovramolecolari

- studiare i cambiamenti conformazionali

Rotore Verticale

Centrifugazione isopicnica

Rotore ad angolo fissoseparazione differenziale

Rotore a bracci

OscillantiCentrifugazione

isopicnica massima

risoluzione delle bande

Tipi di rotori

Wilson and Wolker Biochimica e biologia molecolare Ed. Raffaello cortina

Che cosa è il campo centrifugo?

CAMPO CENTRIFUGO:

Una qualsiasi particella che viene fatta ruotare all’interno

di un rotore da centrifuga

avrà una velocità di sedimentazione che sarà pari al

campo centrifugo G applicato

G = rvelocita’ angolare del rotore espressa come 2 rad

r = distanza radiale (cm) della particella dall’asse di rotazione


Una rivoluzione del rotore e’ pari a 360°=

2rev min-1 =2r.p.m.

la velocita’ angolare ( del rotore

si può esprimere come

velocità del rotore in giri al min= rev min-1=r.p.m.

2r.p.m. 60

da cui la velocità angolarerad sec-1

=

Campo centrifugo G = r = 2r.p.m. 60

r = distanza radiale della particella dall’asse della rotazione espressa in cm

4r.p.m.)2

3600r2

= r

RCF = rapporto tra il peso della particella sottoposta al campo centrifugo

e il peso della particella in presenza della sola forza di gravita’

Campo centrifugo relativo (RCF)

RCF=G = r =

4r.p.m)2 r 3600 x 981

g g

= = 1.12x10-5 r.p.m2 r

RCF= = 1.12x10-5 r.p.m.2 r

campo gravitazionale terrestre g = 981 cm s -2

si esprime in g= il rapporto tra campo centrifugo G , a uno specifico raggio, e la velocità all’accellerazione normale g=981

Le centrifughe sono provviste di NOMOGRAMMA

che permettono di trasformare r.p.m in g

Forza centrifuga relativa

Distanza radiale (mm)

RCF(xg)

NOMOGRAMMA

Velocità del

rotore (r.p.m)


Una volta stabilito che cosa è il campo centrifugo

Ci interesserà sapere quali leggi governano la sedimentazione

Di una particella in quel determinato compo centrifugo relativo

Una miscela di particelle eterogenee, approssimativamente sferiche,

può essere separata mediante centrifugazione, in base alla :

1. densità

2. dimensione delle particelle,

3. tempo di sedimentazione,

4. livello di sedimentazione raggiunto dopo un periodo di tempo definito..

La velocita’ di sedimentazione di una particella e’ proporzionale alle sue dimensioni, alla differenza tra le densita’ di particella e mezzo e al campo centrifugo applicato

La velocita’ di sedimentazione dipende anche dalla forma della particella:

una particella allungata offre maggior attrito rispetto ad una con la stessa massa ma di forma globulare quindi le particelle allungate sedimentano piu’ lentamente

=2rp2(pm ) r

9

= coef . di viscosita’ del mezzo

pdensita’della particella

m=densita’ del mezzo

rp=raggio della

particella

Legge di STOKES

La velocita’ di sedimentazione di una particella disciolta in una soluzione dipendera’ non solo dal campo centrifugo applicato ma anche dalla:

1.massa della particella

In sommario:

2.Densita’ e viscosita’ del solvente in cui avviene la sedimentazione e 3.dalla sua forma (sferica o allungata)

Quando si riportano le condizioni per la separazione

di particelle bisogna quindi specificare:

1) la velocita’ del rotore,

2) dimensioni dell raggio (o tipo di rotore)

3) tempo di centrifugazione

Coefficienti di sedimentazione

Il coefficiente di sedimentazione s

È dato dalla velocità di sedimentazione v su campo centrifugo G applicato

s = v/ G = v/r

E’ espresso in secondi e dipende dalla 1) temperatura 2) densita’ 3) viscosita’ del mezzo

Per convenzione si usa esprimere il coefficiente di sedimentazione trovato sperimentalmente in quel valore che si otterrebbe in un mezzo la cui viscosita’ e densita’ fosse pari all’ acqua a 20°C

Coefficienti di sedimentazioni standard = Svedberg units

1unita’ Svedberg= 10-13 sec

Es. 5S RNA =5x10-13 sec

vescicole

xg unita’ Svedberg


Segue…CENTRIFUGAZIONE

Frazionamento cellulare

~2µm

= GFP-Sec2p

DAPI

Nuclei (P1)

Apparato del Golgi (P2)

Vescicole secretorie (P3)

Centrifugazione differenziale

e’ la sedimentazione successiva di particelle aventi dimensione e densità diverse

P1

LT

P2

S1 S2

P3

S1 S2

500g 35000g

10g

P1

S1

S1LT

P2

S2

Lisato

P1

S1 S2

P2 P3

S36500g13000g

Es. schematico di centrifugazione differenziale di un lisato cellulare:

PM, Nucleo MitocondriER, Golgi

Vescicole ER, Golgi Membrane frammentate

100000g

CE from wt cells expressing GFP-Mlc1p

P1/ S1= 6.250xgP2/ S2 = 35.000xgP3/ S3= 100.000xg

Pdr5p : PM protein Sec61p :ER +Golgi proteinSec4p : vesicles and cytosol

Centrifugazione differenziale di GFP-Mlc1p e Sec4p

Esempio di

Centrifugazione in gradiente di densita’:

Tecnica zonale di velocita’ e isopicnica

1. Nella tecnica zonale di velocita’ le particelle si separano principalmente per differenza di dimensioni, perchè particelle biologiche di tipo simile sono spesso simili in forma e la loro densita’ rientra in una gamma ristretta.

2.Nella tecnica isopicnica: la separazione dipende dalla densita’ idrostatica delle particelle e non dalla forma ne’ dalla dimensione ed e’ indipendente dal tempo:

Questa tecnica viene utilizzata per separare particelle di dimensioni simili ma di diversa densita’

Materiali usati per la formazione dei gradienti

La scelta del soluto dipende dalla natura delle particelle da separare


Separazione di velocita’ su gradiente di densita’

Particelle a bassa densita’

Particelle ad alta densita’

GRADIETE

Campocentrifugo

campione

Il campione viene fatto stratificare su un gradiente pre-formato la cui

densita’ massima non deve superare quella delle particelle piu’ dense da

separare

Separazione isopicnica zonale di velocità:

la corsa deve essere terminata prima che le particelle raggiungano la base del tubo

Nota: Gli organelli subcellulari che hanno densita’ differenti ma

dimensioni simili non sono ben separati con

questo metodo

Centrifugazione isopicnica all’equilibrio

Il gradiente non è preformato ma si genera durante la centrifugazione

Gli organelli subcellulari che hanno densita’ differenti ma dimensioni simili

sono separati con questo metodo

Centrifugazione isopicnica con metodo dell’isodensita’ all’equilibrio

Campione +mezzo

Particelle a bassa densita’

Particelle ad alta densita’

La centrifugazione va fatta all’equilibrio(densita’ idrostatica = a quella dell gradiente)

Il campione viene mescolato con il mezzo del gradiente

GRADIETE

Campocentrifugo

Il gradiente si forma durante la centrifugazione

Centrifugazione isopicnica con metodo all’equilibrio

GRADIETE

Campocentrifugo Particelle a bassa densita’

Particelle ad alta densita’campione

Il campione viene stratificato sotto (o sopra) il gradiente la cui densita’ massima deve superare quella delle particelle piu’ dense da separare

Gli organelli subcellulari che hanno densita’ differenti ma dimensioni simili sono separati con questo metodo

TEMPO di centrifugazione

La centrifugazione va fatta all’equilibrio (densita’ idrostatica = a quella del gradiente)

wt cells expressing GFP-Mlc1p

Sucrose Velocity gradient

Esempi di

wt cells expressing GFP-Mlc1p

Density gradient

Esempi di

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 frazioni

Cellule wt +GFPMlc1p

Gradiente di saccarosio

Gradiente di saccarosio

Metodi di determinazione della concentrazionedi proteine nel lisato cellulare

Paragrafo 8.3.2

Metodi colorimetrici:

La soluzione proteica reagisce con un reagente che da luogo

ad un prodotto colorato.

La quantita’ del prodotto viene quindi determinata allo

spettrofotometro.

Con appropriata calibratura si correla

l’ intensita’ della colorazione alla quantita’ della proteina

Metodi colorimetrici:

Metodo di Lowry, BCA e Bradford.

Metodo di BradfordQuesto metodo si basa sul legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine (non molto accurato, poco sensibile 20g/cm3)

E’ basato sull’ immediato shift di assorbimentoda 465nm a 595 nm che occorre quando il colorante Comassie Brilliant blue G-250 si lega alle proteine in soluzione acida.

Protein + Comassie brilliant blue Protein Dye complex (acidic, A465nm) (A595nm)

Si assume che il colorante si leghi alla proteina via attrazione elettrostatica dei gruppi acidi sulfonici del colorante.

Gli studi sul meccanismo della formazione di questo complesso suggeriscono che la forma anionica del colorante e’ la specie che complessa con la proteina.

Questa interazione causa lo shift di assorbimento con un picco a 595nm

Metodo di Lowry:

rileva quantitativi proteici inferiori a 10µg/cm3.

Schema di reazione Lowry modificato = prodotto +stabile

Proteine+Cu+ OH- complesso tetracoordinato-Cu+1

+ Folin fenolo+ Acido Fosfomolibdenico / fosfotugstenico complesso colorato

Blu A750nm

Interference.: con tamponi Tris, e zwitterionici (PIPES, HEPES) o contenenti EDTA

Le proteine si fanno reagire con una soluzione alcalina contenente solfato di rame in presenza di tartrato

(reagente di Folin: tugstato, molibdato e fosfato di sodio)

si sviluppa un colore blu porpora che assorbe ad un massimo di A 660nm

Assorbimento della luce ultravioletta:

utile per piccole quantita’ di proteine e per riutilizzare il campione(sensibilita’ fino a 10g/cm3)

I residui aromatici della tirosina e triptofano hanno un assorbimento max a 280nm. In una miscela complessa si puo’ calcolare con buona approssimazione che una soluzione con A280= 1.0 (considerando 1cm di percorso) abbia una concentrazione proteica di circa 1mg/cm3

Attenzione : questo metodo e’ soggetto ad interferenza. es.: anche gli acidi nucleici assorbono a 280nm

1

Fattore di correzione:

Proteine mg/cm3 =1.55A280-0.76A260

2 Misurazione dell’ assorbanza dei legami peptidici a 205-210nm.

Questo metodo ha una sensibilita’ maggiore fino a >1g/cm3.

Nota che: I legami peptidici assorbono ad un massimo di 190nm ma gli spettrofotometri hanno scarsa resa a queste lunghezze d’onda

applicazioni: FPLC= Fast Protein liquid chromatography

HPLC= High Performance Liquid Chromatography

METODI DI FRAZIONAMENTO delle proteine

Paragrafo 8.3.4

Frazionamento stabilità : -denaturazione tramite temperatura

Frazionamento per solubilità e/o idrofobicità :--Sali, -solventi organici,-punto isoleletrico,

Frazionamento per carica: -colonne a scambio ionico

Fattori che diminuiscono la stabilità delle proteine:

-Temperatura-Congelamento

-Scuotimento

-pH dei buffer di solubilizzazione

-Ossidazione-Presenza di metalli come co-fattori

-Sali

Frazionamento per STABILITA’

SOLUBILITA’ differenziale delle proteine

Può essere un criterio di purificazione di proteine da una miscela complessa

[(NH4)2SO4] (M)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Fra

zio

ne

so

lub

ile

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Precipitazionedelle proteinemeno solubili

Precipitazionedelle proteine

più solubili

Precipitazionedella proteina

d’interesse

Pag 345-348

Figures from:http://biotecnologie.unipr.it/didattica/att/5cc0.file.doc

Frazionamento per solubilità e/o idrofobicità Precipitazione delle proteine

-Precipitazione con Sali

-Precipitazione con Solventi organici

-Precipitazioni con PEG

Perche’ in presenza di sali o metanolo le proteine precipitano?

quindi la loro solubilita’ sara’ diversa in presenza di concentrazioni diverse di sali o solventi organici.

Le proteine differiscono nel numero di gruppi polari esposti al solvente


d’interesse

% del solvente

http://biotecnologie.unipr.it/didattica/att/5cc0.file.doc

Una proteina e’ solubile in acqua fintanto che i gruppi carichi sono solvatati da molecole di acqua e i

gruppi idrofobici sono mantenuti all’ interno della proteine.

I gruppi idrofobici sono rivolti verso l’interno

I gruppi idrofilici sono rivolti verso l’esterno.

Questo permette interazioni dipolari con il solvente

HO-

H+

+

In una soluzione acquosa contenente proteine e sali

..Se si aumenta la concentrazione di sali

le molecole libere di H2O che possono solvatare gli ioni salini diminuiscono.

Le prime molecole di H2O che si rendono disponibili a questo punto sono quelle che si trovano intorno ai gruppi idrofobici delle

proteine

poiche’ le altre sono impegnate con interazioni elettrostatiche con i gruppi polari delle proteine e quindi sono piu’ difficilmente

cedibili.

PRECIPITAZIONE CON SALI



HO-

H+

+

HO-

H+

+

HO-

H+

+H

O-H+

+

HO-

H+

+

Na+-Cl-

Na+-Cl-

Na+-Cl-

Na+-Cl-Na+-Cl-Na+-Cl-Na+-Cl-

Na+-Cl-

al crescere della concentrazione salina i gruppi idrofobici delle proteine vengono scoperti

Questi frammenti idrofobici esposti causano l’ aggregazione delle proteine e a seguito di interazioni idrofobiche che e causano la precipitazione delle proteine

o ‘salting out’ .

Naturalmente più la proteina contiene tratti idrofobici e’ piu’ risultera’ insolubile a basse concentrazioni saline (e vice versa).

[(NH4)2SO4] (M)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Fra

zio

ne

so

lub

ile

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Precipitazionedelle proteinemeno solubili

Precipitazionedelle proteine

più solubili


d’interesse

Schema di percipitazione in presenza di Ammonio solfato

In una soluzione acquosa contenente solventi organici

(metanolo, etanolo, butanolo, acetone)

le molecole di acqua si dispongono a idratare le molecole di solvente organico. L’ acqua di solvatazione viene quindi rimossa

dai gruppi carichi e polari sulla superficie delle proteine.

I gruppi carichi delle proteine vengono quindi scoperti e le proteine si aggregano per formazione

di interazioni ioniche tra le molecole proteiche.

PRECIPITAZIONE CON SOLVENTI ORGANICI

I gruppi carichi delle proteine vengono quindi scoperti e le proteine si aggregano per formazione

di interazioni ioniche tra le molecole proteiche



HO-

H+

+

HO-

H+

+H

O-H+

+

HO-

H+

+

HO-

H+

+

HO-

H+

+

HO-

H+

+

HO-

H+

+

Di conseguenza le proteine presenti in una soluzione

acquosa contenente solventi organici precipitano

HO-

H+

+

HO-

H+

+

HO-

H+

+

HO-

H+

+

in ordine decrescente a seconda del numero di gruppi carichi presenti sulla loro superficie e in misura maggiore man mano che aumenta la concentrazione del solvente

IlPEG e ’un polimero organicoche precipita le proteine con un meccanismo simile a quello dei solventi organici

richiede concentrazioni piu ’ basse per precipitare le proteine e ha minor probabilita ’ di determinare la loro denaturazione .

PEG puo’ essere usato

Poly(ethylene glycol) (PEG) :

HO-(CH2CH2O)nCH2CH2-OH

1. per guidare le proteine e acidi nucleici a formare cristalli.

2. Per purificazioni proteiche: PEG + destrano + buffer --> e’ un sistema bi-fasico utile per ospitare materiali biologici

3.per aiutare la fusione cellulare. Il PEG interagisce con le membrane cellulari, a un processo chiave usato in biotecnologia.

4. Il legame covalente del PEG alle proteine da coniugati che non sono "-immunogenici " e antigenici = uso in vaccini .5. Il legame covalente del PEG a superficie retarda l’ assorbimento delle proteine a queste superfici

Frazionamento per dimensioni:

-centrifugazione,

-cromatografia a settaccio molecolare,

Frazionamento per affinità :

Co-immunoprecipitazione utilizzando interazione tra antigene-anticorpo

colonne di affinità per cofattori

Altri metodi di frazionamento delle proteine

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