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I webinar per gli insegnanti di matematica e scienze

FORMARSI AGGIORNARSI CONDIVIDERE

DNA ricombinante

Dalla manipolazione del DNA agli OGM

30 marzo 2016

Relatore: Livia Pirovano

Docente distaccata presso il CusMiBi

1) Un po’ di storia

2) Tappe della trasformazione

- Isolare il DNA esogeno

- Inserirlo nel vettore

-Tecniche di trasformazione

- Selezione dei trasformati

3) Applicazioni (anche sull’uomo)

INGEGNERIE GENETICA: produzione di nuove combinazioni di materiale ereditabile, ottenute mediante inserzione di molecole di DNA di qualunque provenienza, in un organismo ospite, nel quale tali molecole non sono presenti naturalmente ma nel quale, una volta acquisite, possono propagarsi indefinitamente. (Governo britannico)

DNA ricombinante

1973: primo esperimento di

trasformazione batterica

(introduzione di un gene

eterologo in E. coli),

effettuato da Cohen e Boyer.

Essi riuscirono a dimostrare che: • Si possono creare plasmidi artificiali in grado di replicarsi autonomamente in E. coli. • Non esistono barriere specie-specifiche. Infatti il gene che conferisce resistenza alla penicillina prelevato dal batterio Staphylococcus aureus rimane perfettamente funzionale se clonato in E. coli.

Una pietra miliare

Conferenza di Asilomar 1975

Risultati: linee guida che permettevano di utilizzare solo alcuni tipi di batteri ritenuti “sicuri” e che imponevano restrizioni sull’utilizzo di DNA di mammifero. Cinque anni dopo queste restrizioni furono corrette, permettendo un ampliamento della ricerca sui mammiferi.

Striscione di protesta nel 1977 al National Academy of Sciences Forum on Recombinant DNA

L’ Università di Stanford depose domanda di brevetto per la procedura di clonazione del DNA.

Da queste licenze nacquero 125 prodotti vendute per un totale di 35 miliardi di dollari.

Produzione di insulina umana mediante trasformazione di batteri (1982)

Ricadute DNA ricombinante

Boyer fu uno dei fondatori della Genetech, prima società biotec che sviluppo, insieme alla Eli Lilly, la produzione di insulina umana da batteri

• La scoperta di enzimi per manipolare il DNA in vitro: ENZIMI DI

RESTRIZIONE; DNA LIGASI, ecc.

• Lo sviluppo di molecole di DNA in grado di accettare DNA esogeno

e propagarsi poi negli ospiti: VETTORI

• La messa a punto di metodi per introdurre DNA esogeno attraverso

la membrana ospite: TRASFORMAZIONE

• Metodiche per IDENTIFICARE E ISOLARE le

cellule/organismi TRASFORMATI e il prodotto genico

• Metodiche che consentono di identificare, ISOLARE i GENI di

interesse

Tappe importanti per lo sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante

Scoperta degli enzimi di restrizione*(1962-72)

* premio Nobel 1978 a W. Arber, H. Smith e D. Nathans

1) Il fago inietta il suo DNA nel battere

2) Gli enzimi di restrizione lo tagliano

3) Il genoma batterico è metilato per evitare il taglio

1 2

3

Sito di restrizione (sequenza di basi riconosciuta da un enzima di restrizione)

sequenze palindrome

“forbici molecolari”

Taglio sfalsato

Taglio netto SI CONOSCONO OLTRE 11.000 ENZIMI

Lascia estremità a singola elica coesive

Taglio sfalsato

Taglio sfalsato

DNA ligasi

+ ATP

Lecienze: 1975 n. 87 Cohen

Arthur Kornberg identificò un meccanismo per saldare il DNA,

un enzima che egli chiamò DNA ligasi e che riforma il legame

fosfodiesterico tra due nucleotidi.

DNA ligasi

Plasmide tagliato con EcoRI DNA tagliato con lo stesso enzima EcoRI

+

Enzimi di restrizione + DNA ligasi DNA ricombinante

I DNA si uniscono con legami H perché hanno basi complementari

La DNA ligasi salda formando legami covalenti fosfodiesterici








cellule/organismi trasformati e il prodotto genico

• Metodiche che consentono di identificare, isolare i GENI di

interesse


I vettori di clonaggio in ingegneria genetica

Plasmidi

Inserto fino a 12kb

Virus

Inserto fino a 25 kb

Cosmide

Inserto fino a 45 kb

Cromosomi artificiali (YAC o BAC)

Inserto fino a 200-2000 kb

COS’E’ UN PLASMIDE

Molecola di DNA extracromosomico a doppio filamento circolare contenente geni che conferiscono proprietà particolari (es. resistenza agli antibiotici, ecc.)

Si replicano indipendentemente dal cromosoma batterico

Microfotografia elettronica

del plasmide pSC101 isolate

dal batterio E.coli e usato da

Cohen e Boyer

A partire da quelli naturali, sono stati costituiti dei plasmidi artificiali

Polylinker: sequenze nucleotidiche

riconosciute da vari enzimi di

restrizione. Si inserisce all’interno

del gene lacZ+ per la beta-

galattosidasi

ampR: marcatore selettivo,

conferisce resistenza

all’ampicillina e permette di

selezionare solo i batteri

trasformati

Ori: origine della replicazione

UN VETTORE PLASMIDICO: pUC19










interesse


Metodi di trasformazione

elettroporazione










interesse


Selezionare i trasformati

LB+ antibiotico o erbicida o agente selettivo

Si fanno crescere le cellule su un terreno selettivo che permette la crescita solo delle cellule trasformate.









• Metodiche che consentono di identificare, ISOLARE i GENI di

interesse


Isolare il DNA di interesse

Genoma umano 3,3 x 109 pb Ogni coppia di nucleotidi 1 carattere tipografico

A) Sintesi chimica del gene di cui conosciamo la sequenza del gene o della proteina (Sanger

negli anni ’50 aveva inventato il metodo per sequenziare le proteine e negli anni ‘70 il metodo per sequenziare il DNA).

B) Genoteche a DNA o cDNA

C) Amplificazione con PCR (sfruttando la conoscenza di geni omologhi)

Isolare DNA di interesse

A) Sintesi chimica del gene della somatostatina

Il gene fu sintetizzato a partire da 8 frammenti di DNA, 42 basi codificano per la somatostatina e le altre sono estremità coesive per permettere l’inserimento nel vettore e l’epressione del gene. Il gene della somatostatina nel plasmide è fuso con il gene della beta galattosodasi che consente la normale trascrizione e traduzione

B) Genoteche genomiche

RNasi

B) Genoteca a cDNA

RNAsi

Selezione clone con gene di interesse

4) Lavaggi e esposizione del nylon a lastra fotografica per identificare il clone che porta il gene

2) Trattare il nylon con detergenti e NaOh per lisare i batteri e denaturare il DNA

1) Trasferire parte dei cloni su nylon 3) Aggiungere la

sonda che ibridizza con il gene di interesse

1. Isolare il DNA esogeno

2. Inserirlo nel vettore (ligazione)

3. Trasformazione

4. Selezione dei trasformati

5. Controllo

Tappe della trasformazione

3) Miscelare plamide e DNA esogeno e trattare

con la DNA ligasi

2) Taglio del DNA esogeno con lo

stesso enzima di restrizione

1) Taglio del vettore con enzima di restrizione

Plasmide ricombinanate

2) Inserimento nel vettore

3) Trasformazione batterica

• Attraverso la trasformazione si introduce del DNA estraneo nella cellula batterica

• Avviene in natura ma MOLTO RARAMENTE

• Ci sono due metodi artificiali che consentono di introdurre DNA estraneo nei batteri

www.pinterest.com


• Elettroporazione:

Uno shock elettrico rende le membrane

cellulari permeabili al DNA

• Calcium Chloride/Heat-Shock:

Cellule competenti assorbono il DNA dopo

un trattamento chimico e uno shock termico

Tipicamente la resa di trasformazione è di 1 su 10.000 cellule per CaCl2 ma 1 su 100 per l’elettroporazione

3) Trasformazione batterica: Elettroporazione

Gli impulsi elettrici ad alto voltaggio destabilizzano la membrana cellulare e inducono la formazione transiente di pori che favorisce l’ingresso del DNA Funziona per batteri e cellule animali e vegetali

1. Trattamento con CaCl2:

gli ioni Ca++ schermano le cariche negative del DNA e le cariche negative dei fosfolipidi di membrana

2. Incubare in ghiaccio:

rallenta il movimento delle molecole della membrana

3. Heat-shock:incrementa la permeabilità delle membrane

3) Trasformazione batterica: Calcium Chloride/Heat-Shock

Ca

++

Ca++

Ca++

4) Selezione dei batteri trasformati

1 su 10.000 batteri vengono trasformati mediante heat-shock

Per selezionare i batteri trasformati si fanno crescere su un terreno selettivo cioè contenente un antibiotico

LB + Amp

Batterio Lacz-

con plasmide LacZ+

Batterio Lacz-

senza plasmide

Batterio Lacz-

con plasmide e inserto

X-Gal

IPTG

LB + Amp

IPTG= analogo lattosio

Il lattosio è un disaccaride formato da una molecola di galattosio e da

una di glucosio unite da un legame β-glucosidico. La β-galattosidasi

rompe questo legame

X-gal:molecola di glucosio unita a un precursore dell’indaco: l’enzima-β galattosidasi rompe il legame e si produce il colore blu

X-Gal:substrato cromogeno


LATTOSIO IPTG

X-Gal:5-bromo-4-cloro-3-indolyl- β galatoside

IPTG: isopropyl- β-D-1-thiogalactopyranoside

lacZ+

lacZ+

inserto

-galactosidasi tetramero

(funzionale)

-galactosidasi monomero

(non funzionale)

Colonie bianche

LB+ Amp + X-gal + IPTG

Colonie blu

Plasmide senza inserto Plasmide con inserto


Metodi di trasformazione nei

vegetali

• Agrobacterium tumefaciens

• Particle gun o

Biolistico

• Trasferimento chimico

elettrico, microiniezione

Si spara su diversi

tessuti vegetali:

foglie, calli,

embrioni, cotiledoni,

ecc.

Particle gun o biolistico

Un batterio presente naturalmente nel suolo che infetta molti tipi di piante

Agrobacterium tumefaciens

Ti:Tumor inducing

contiene geni vir

T-DNA: transfer DNA

contiene geni per

opine e ormoni

vegetali

in natura Opine

Ormoni vegetali

Right Border

Auxine Opine

Citochinine

Geni vir ORI

Catabolismo

opine

in laboratorio

Agrobacterium tumefaciens

Geni nuovi Marcatore di

selezione

Ti plasmide

Si eliminano tutti i geni non utili e si inseriscono tra i left e right border i geni

nuovi e gene selettivo

Plamide

ricombinante

T-DNA Left Border

DNA esogeno

A. tumefancies ricombinante

Alberts et al. (2002) Molecular biology of the cell

Come si ottengono piante trasformate

Terreno con ormoni

vegetali

1 2

3

4

4

• Resistenza agli insetti, virus, funghi, nematodi

• Tolleranza agli erbicidi

• Resistenza a stress: siccità, salinità….

• Miglioramento della qualità nutrizionale e commerciale

• Produzione di composto ad uso biomedico e industriale (vaccini, ormoni, enzimi, biocarburanti…)

Pomodoro transgenico a maturazione ritardata

Mais Bt

Agricoltura: le PGM: perché si fanno?

Golden Rice contiene il

precursore della vitamina A

Maiale transgenico: produce, nel

latte, la proteina C umana

(controlla la coagulazione)

Trasformazione animale

Microiniezione ovocita fecondato

Elettroporazione in ES

Vettore virale in ES (staminali embrionali)

Agricoltura-Zootecnica: piante resistenti a parassiti, tolleranti agli erbicidi, miglioramento qualità nutrizionali e commerciali, resistenti a stress, che producono proteine utili… Medicina-Farmacologia: produrre farmaci, vaccini, antibiotici, reagenti diagnostici o per terapie contro il cancro o terapie geniche Bioindustria (chimica, alimentare): produzione di enzimi (es. rennina per i formaggi), solventi, detergenti, materie plastiche, reagenti.. Protezione ambientale: biorisanamento di ambienti contaminati, depurazione delle acque e dei reflui, bioindicatori Energia: batteri che producono sostanze tensioattive che ne favoriscono la separazione del petrolio dalle rocce, biocarburanti

Perché trasformare organismi Applicazioni

Prodotto Uso Anno

• Insulina diabete 1982

• Ormone della crescita nanismo 1985

• Interferone cancro, infezioni virali 1986

• Antigene Virus rabbia vaccino 1986

• Antigene Virus polio vaccino 1987

• Antigene Virus epatite vaccino 1987

• TPA (tissue plasminogen activator) dissolve i coaguli 1988

• Fattore di necrosi tumorale terapia cancro 1989

• Fattore VIII emofilia 1989

• Eritropoietina anemia 1989

Medicina e Farmacologia Esempi di prodotti in commercio

ottenuti medianti OGM

più economici, abbondanti e sicuri

Microbial Cell Factories 2014, 13:141 400 PROTEINE

CHO: Chinese Hamster Ovary Mammalian cell

Cricetulus griseus

Yeast: Saccaromyces cerevisiae

Medicina e Farmacologia

Trasformazione cellule umane Terapia in vivo: si introduce direttamente il gene sano nel

corpo del paziente.

Terapia ex vivo: si modificano le cellule del paziente all’esterno e poi si reintroducono.

http://stemcells.nih.gov/staticresources/info/scireport/PDFs/F.%20Chapter%204.pdf

Vettori: virus

(disarmati), liposomi,

DNA nudo

Primi anni 1980: caso Cline (UCLA) - esperimenti non autorizzati in USA- tentativo di inserire geni per la globina in due talassemici (Italia e Israele) 1984: usato vettore retrovirus per trasformare cellule di mammmifero 1990: prima sperimentazione di terapia genica con finalità terapeutiche linfociti ingegnerizzati con ADA introdotti in due bambine con ADA-SCID (Severe Combined Immune Deficiency)

TERAPIA GENICA

Cenni storici:

Culver, Anderson, Blaese con le due bambine affette da

immunodeficienza trattate con terapia genica

1990 primi pazienti (4 e 9 anni) ad essere trattata con terapia genica al NIH Clinical Center a Bethesda Avevano una mutazione nel gene dell’adenosina deaminasi che causa una severa immunideficienza (ADA-SCID). I loro globuli bianchi sono stati prelevati e trasforamati con il gene corretto, usando vettore retrovirale , selezionati e trasfusi. Le due bambine hanno ricevuta diversi tratamenti di terapia genica nell’arco di 2 anni e continuavano a ricevere l’enzima ADA come proteina ricombinante.

PRIMA TERAPIA GENICA APPROVATA

1) Isolamento dei globuli bianchi

del bambino

2) Infezione dei globuli bianchi con il vettore retrovirale ADA+

3) Crescita delle cellula in coltura e verifica espressione del

transgene umano

4) Infusione dei globuli bianchi che esprimono il

gene ADA nel sistema circolatorio del paziente

ADA-SCID ImunoDeficienza Combinata Severa

La sintesi di ADA (enzima: adenosina deaminasi) ripristina la

funzione immunitaria solo per la durata della vita dei globuli

bianchi, perciò il trattamento deve essere ripetuto.

Globuli bianchi

con linfociti T

Retrovirus contente il

gene umano ADA

TERAPIA GENICA

Cenni storici:

Primi anni 1980: caso Cline (UCLA) - esperimenti non autorizzati- tentativo di inserire geni per la globina in due

talassemici in fin di vita (Italia e Israele)

1984: usato vettore retrovirus per trasformare cellule di mammmifero

1989: approvazione del primo protocollo di terapia ex-vivo

1990: linfociti ingegnerizzati con ADA introdotti in due bambine con ADA-SCID (Severe Combined Immune Deficiency)

1990-1999: Approvazione di numerosi protocolli clinici con

diversi vettori

1999: Primo decesso (Gelsinger) causato da vettori virali -

rivalutazione di tutti i protocolli clinici

Settembre 1999: morte di un paziente maschio di 18 anni (Jesse Gelsinger) affetto da deficit di ornitina-transcarbamilasi (OTC). Incapacità di metabolizzare ammonio. La sua mutazione non era severa e poteva vivere seguendo una dieta restrittiva e uso di medicine appropriate.

Decorso Clinico:

12h: febbre,

trombocitopenia,

18h: stato mentale alterato

SIRS (systemic

inflammatory responce

syndrome)

DIC (disseminated

intravascular coagulation),

multiple organ failure

98h: morte del paziente

vettore usato: adenovirus

via di somministrazione: arteria epatica

Protocollo sbagliato: iniettati un eccesso di adenovirus, lo stesso trattamento aveva portato a morte delle scimmie, Gelsinger non aveva livelli di ammonio così elevati da includerlo nella sperimentazione

Cenni storici:

2002-05: 20 pazienti trattati con terapia genica per X-linked SCID (Parigi-Londra, Dr. Fischer), con vettore retrovirale. L’integrazione retrovirale in punti sensibili del genoma di 5 pazienti causò leucemia e la morte di un paziente. Il 25% dei pazienti trattati con terapia convenzionale muore

TERAPIA GENICA

Fisher Naldini (lentivirus) Bordignon stem cell

“deve essere assolutamente chiaro che la terapia genica non è “LA TERAPIA” è un approccio tra tanti”

Trials approvati nel

mondo dal 1989 al 2015

http://www.nature.com/nbt/journal/v29/n2/full/nbt.1769.html

Terapia genica: vettori usati

dsDNA non si integra transiente immunogenico

ssDNA non si integra Poco immunogenico

ssRNA si integra Cellule in divisione

ssRNA si integra

Anche cellule non in divisione

Non immunogenico Bassa efficienza

Patologie in studio nei trials di terapia genica

Terapia genica: fasi

2003: approvato in Cina il primo prodotto per terapia genica contro cancro al capo e collo, la GENDICINA è un adenovirus contenente il gene oncosoppressore p53.

2012: approvato in Europa e USA il GLYBERA, un vettore AAV contenente il gene LPL, una lipasi. Terapia genica per la LPL deficiency

Problemi principali della terapia genica

Espressione bassa o transitoria

Dimensioni dell’inserto rispetto alla capacità del vettore

Difficoltà a raggiungere alcuni tessuti (es.SNC)

Risposte immunitarie dell’ospite

Incapacità ad infettare cellule quiescenti (retrovirus)

Mutagenesi inserzionale (con ruolo oncogeno)

2015: scoperta dell’anno per Science

DNA editing CRISPR-Cas: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas.

Scoperto da Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna è un meccanismo di difesa dei batteri dai virus Formato da un RNA guida che indica il punto preciso dove va tagliato il DNA e una proteina che opera il taglio. Con questo metodo si può fare una inserzione oppure una modificazione mirata del DNA dell’ospite

Molti scienziati, tra cui gli inventori di CRISPR, chiedono una moratoria, in mancanza di regole condivise, sull’uso della tecnica su cellule germinali o embrioni umane a scopo terapeutico ma concordano sulla necessità di continuare la sperimentazione

Io sono leggenda è un film del 2007 di Lawrence, tratto dal romanzo di Matheson e gli zombi sono persone infettate da un virus creato per curare il cancro.

TERAPIA GENICA è ALLA BASE DI ALCUNI FILM Cultura popolare

L’alba del pianeta delle scimmie è un film del 2011di Wyatt, in cui la terapia genica con il virus ALZ-112 riguarda la cura dell’Alzheimer capace di potenziare i recettori neurali.

Essenziale è CORRETTA INFORMAZIONE in modo da non creare:

-eccessive e false aspettative che possono aprire le porte ai ciarlatani (vedi caso stamina)

-nell’opinione pubblica “anticorpi” contro la scienza e le sue possibili applicazioni biotecnologiche (vedi OGM e vaccini)

Conclusioni

Siti internet

http://stemcells.nih.gov/info/scireport/pages/chapter11.aspx http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jgm.2698/full http://www.asgct.org/general-public/educational-resources/faqs http://www.gmo-compass.org/eng/gmo/db/ http://archiv.ipn.uni-kiel.de/eibe/HOME.htm http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp http://croptechnology.unl.edu/pages/index.php?featmed=1 http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/molecularbiology.html http://www.biology.arizona.edu/default.html http://learn.genetics.utah.edu https://www.dnalc.org http://www.nature.com/nature/archive/specials.html

http://stemcells.nih.gov/info/scireport/pages/chapter11.aspx



http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jgm.2698/full

http://www.asgct.org/general-public/educational-resources/faqs





http://www.gmo-compass.org/eng/gmo/db/



http://archiv.ipn.uni-kiel.de/eibe/HOME.htm




http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp

http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp

http://croptechnology.unl.edu/pages/index.php?featmed=1

http://croptechnology.unl.edu/pages/index.php?featmed=1

http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/molecularbiology.html

http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/molecularbiology.html

http://www.biology.arizona.edu/default.html

http://www.biology.arizona.edu/default.html

http://learn.genetics.utah.edu

https://www.dnalc.org

https://www.dnalc.org

http://www.nature.com/nature/archive/specials.html

• 1985 trasformare con successo le cellule (coltivate in vitro) di pazienti affetti da ADA con retrovirus

• 1986 hanno provato l’efficienza e la innocuità della trasformazione di cellule del midollo osseo di animali. Il metodo è innocuo ma l’efficacia era molto bassa

• 1988 provano a trasformare colture in vitro di globuli bianchi animali. L’esperimento ebbe così successo che il team pensò di applicarlo all’uomo.

• 1990 a due bambine venne applicata con successo la terapia genica con linfociti trasformati

• 1992 Bordignon usa cellule staminali ematopoietiche per curare la stessa patologia

• 1993 altri bambini con questa malattia sono stati trattati con terapia genica usando cellule del sangue immature ricavate dal cordone ombellicale, con questo si è ottenuta una maggior durata.

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• Riceverete nella medesima e-mail le istruzioni per scaricare, dal sito Pearson, i materiali presentati oggi

Scuola secondaria di secondo grado:

il calendario dei webinar sul sito www.pearson.it

13 aprile - "Io e le Scienze della Terra", Katia Carbonara

29 aprile - "Io e la Fisica", Nicoletta Protti

4 maggio - "Io e la Chimica", Davide Morselli

Eureka! Giovani ricercatori si raccontano

Risorse online per tutti!

Area Tematica Science Factory e la rivista «Science Magazine»

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