Fondamenti di spettrofotometria [modalità compatibilità]
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Fondamenti di Fondamenti di spettrofotometriap
Spettroscopia UV/Visp p
SpettroscopiaSpettroscopiaDefinizione: Lo studio della struttura e della dinamicadella materia (in biologia delle molecole) attraversodella materia (in biologia delle molecole) attraverso
l’analisi dell’interazione con la luce
La lunghezza d’onda della luce (quindi la suaenergia) determina il modo in cui questa interagisce
con la materiacon la materia
Serve per:Serve per:Quantificare molecoleIdentificare molecoleAnalizzare cambiamenti dinamici nellacomposizione o nella struttura delle molecole(cinetica di reazioni …)(cinetica di reazioni …)………………………
Proprietà della luceProprietà della luce
La Radiazione Elettromagnetica• Secondo la meccanica quantistica laSecondo la meccanica quantistica la
radiazione elettromagnetica ha una doppia natura Essa possiede le proprietà dinatura. Essa possiede le proprietà di un’onda e di un corpuscolo
NATURA ONDULATORIAlunghezza d’onda (λ)
frequenza (ν) X
ν = c / λ λ
AZY
Parametri di un’onda:Lunghezza d’onda (λ): distanza tra due massimiFrequenza (ν): numero di oscillazioni in 1 secondo (Hz = 1 ciclo/s)nel vuoto c ≅ 3.108 m/s.
F l h d' d INVERSAMENTE PROPORZIONALIFrequenza e lunghezza d'onda sono INVERSAMENTE PROPORZIONALI:
NATURA CORPUSCOLARE
Una radiazione elettromagnetica consiste in “pacchetti discreti” di energia, chiamatiFOTONI l i i di d d ll f d l' iFOTONI, la cui energia dipende dalla frequenza, secondo l'equazione:
E = h . νdove h indica la costante di Planck: h = 6 63 . 10-34 J. sdove h indica la costante di Planck: h 6.63 10 J sL'energia di un fotone viene a volte espressa anche in elettron-volt (1eV=1.6 . 10-19 J).
Quindi: ENERGIA E FREQUENZA SONO DIRETTAMENTEPROPORZIONALI
Questa relazione ci indica l'energia associata a ciascun fotone per ogni fascio difrequenza ν; per cui un fascio di luce è più o meno intenso a seconda che porti più oq ; p p p pmeno fotoni nell'unità di tempo, ma l'energia di ciascun fotone (il quanto di energia), è sempre la stessa per una determinata frequenza della radiazione.
Che accade quando una radiazione colpisce un oggetto?
• L’energia da una sorgente luminosa interagisce con le proteine in diversi modi.
A li ll d i l i i i di l i di l i iù l i•A livello dei legami atomici vediamo la promozione di elettroni a più alti livelli energetici.
•A livello molecolare vediamo assorbimento ed emissione della luce.
•Le transizioni tra livelli energetici non sono limitate agli elettroni; I legami chimici possono andare incontro a una varietà di livelli energetici vibrazionalichimici possono andare incontro a una varietà di livelli energetici vibrazionali e atomi connessi da legami covalenti possono ruotare l’uno rispetto all’altro.
105 microonde10
104
microondeTransizioni rotazionali
104
Infrarosso Transizioni vibrazionali gi
a
103
visibile Transizioni ll’en
er
102ultravioletto
elettroniche
T i i i l tt i h ento
de
10
Transizioni elettroniche
Aum
e
1
Raggi-X Diffrazione
1
•Una transizione avviene quando l’energia di una molecola cambia daUna transizione avviene quando l energia di una molecola cambia da uno stato all’altro.
e•L’assorbimento avviene quando la radiazione causa e e
T i i
un aumento di energia nel sistema con cui interagisce.
e
Transizione•L’emissione avviene
e e
e quando la radiazione è prodotta da un sistema durante una transizione
ee
durante una transizione da un alto livello energetico a uno più bassobasso
si ottiene uno spettro di emissione quando si analizza unfascio di luce emesso in opportune condizioni da unafascio di luce emesso, in opportune condizioni, da unasostanza;
si ottiene uno spettro di assorbimento quando si analizzasi ottiene uno spettro di assorbimento quando si analizzaun fascio di luce dopo che ha attraversato una sostanza.
P t t l tt di i i diPer una stessa sostanza lo spettro di emissione e diassorbimento sono pressappoco come il positivo e ilnegativo di una fotografia nel senso che una radiazionenegativo di una fotografia, nel senso che una radiazionepresente nello spettro di emissione sarà mancante inquello di assorbimento.q
Quando una radiazione passa attraverso uno strato di sostanza solida, liquida o gassosa, alcuneQ p , q g ,frequenze possono essere rimosse selettivamente mediante assorbimento, cioè un processo in cuil’en. elettromagnetica viene trasferita agli atomi, ioni o molecole che costituiscono il campione.L’assorbimento di radiazione promuove queste particelle dal loro stato normale (fondamentale) atemperatura ambiente a uno o più stati eccitati ad energia più alta.Secondo la teoria quantistica, gli atomi, le molecole o gli ionipossiedono soltanto un numero limitato di livelli energetici
Stato eccitato (E )discreti; perché si abbia assorbimento della radiazione, l’energiadel fotone eccitante deve essere esattamente uguale alladifferenza di energia fra lo stato fondamentale ed uno degli
Stato eccitato (E1)
ΔE = hνstati eccitati della specie assorbente. Su questo principio sibasano sia la spettroscopia di assorbimento sia quella diemissione.
tt i di ASSORBIMENTO d t i l l
Stato fondamentale (E0)
• spettroscopia di ASSORBIMENTO: quando atomi o molecolevengono eccitati e passano a stati energetici maggiori• spettroscopia di EMISSIONE: dagli stati eccitati, ritornandoallo stato fondamentale le particelle riemettono energia sottoallo stato fondamentale, le particelle riemettono energia sottoforma di radiazioni elettromagnetiche (hν)
Spettro di assorbimentoSpettro di assorbimento
Gli elettroni sono distribuiti su diversi livelli energetici,ma tendono ad occupare i livelli energetici più bassi (stato f d l )fondamentale)Quando viene ceduta energia la sistema gli elettroni possono passare ad un livello energetico superiore (stato eccitato)possono passare ad un livello energetico superiore (stato eccitato)
Se l’energia deriva da una radiazione elettromagnetica, si avrà unog gspettro di assorbimento.
Vi bit l l tità di i i l t llViene assorbita solo la quantità di energia equivalente alla differenza tra i diversi livelli energetici, in accordo con leregole della meccanica quantistica La grandezza assoluta di ogniregole della meccanica quantistica. La grandezza assoluta di ogni quanto sarà diversa a seconda dei livelli energetici coinvolti
Stato fondamentaleStato fondamentale
Lo stato a più bassa energia possibile in un sistema fisico in termini di particelle elementari. E’ anche chiamato stato basale. Gli elettroni si trovano sugli orbitali a più bassa energia
Stato eccitato
Un livello energetico più alto di quello basale. GliUn livello energetico più alto di quello basale. Gli elettroni passano su orbitali ad energia più alta.
Spettro di assorbimentoSpettro di assorbimento
• Quando la luce colpisce un campione, le le lunghezze d’onda con energia idonea a g gpromuovere il salto degli elettroni dallo stato basale a quello eccitato sonostato basale a quello eccitato sono rimosse dallo spettro trasmesso
Energia delle radiazionigNella tecnica UV-vis si impiegano radiazioni nell’intervallo 200-800 nm, la cuienergia è sufficiente ad attivare transizioni elettroniche, che causano il passaggiog , p ggdi elettroni degli strati esterni a stati eccitati
UV (Ultravioletto) ⇒ 200-400 nm (lontano UV)
Visibile 400 800 nmVisibile ⇒ 400-800 nm
EnergiaEnergia
la radiazione visibile rappresenta solo una piccola parte dello spettrola radiazione visibile rappresenta solo una piccola parte dello spettroelettromagnetico:
Alle diverse radiazioni visibili che differiscono per la loro lunghezza d’onda(quindi per la loro diversa frequenza ed energia) corrispondono i diversi colori.
Colori della luce visibileCo o de a uce s b eLunghezza d’onda Assorbita Osservata380 420 violet green yellow380-420 violet green-yellow420-440 violet-blue yellow440 470 blue orange440-470 blue orange470-500 blue-green red500 520 l500-520 green purple520-550 yellow-green violet550 580 ll i l t bl550-580 yellow violet-blue580-620 orange blue620 680 d bl620-680 red blue-green680-780 purple green
Applicazioni degli spettri di assorbimento
•Misure Quantitative –determinazione di concentrazioni.
•Calcoli di velocità di reazioni
• Studi strutturali – folding, assemblaggio, denaturazione, cambiamenti di struttura, legame di ligandi, g g
•Enzimatici. Ad es. Analisi degli intermedi delle reazioni
•Identificatione di composti (vitamine, ormoni). Utile per identificare proteine con cromofori particolari
•Studi immunologici.– tramite kit commerciali
I cromofori nelle proteineI cromofori nelle proteine
The peptide bond
Chromophores in proteinsChromophores in proteinsthe important chromophores to remember are:p p
λmax(nm) ε(M-1cm-1)backbone: 195backbone: 195
220tryptophan: 280 5600tryptophan: 280 5600
219 47000tyrosine: 274 1400
both these both these peaks are peaks are very usefulvery usefultyrosine: 274 1400
222 8000193 48000
very usefulvery useful
193 48000phenylalanine: 257 200
206 9300206 9300188 60000
EmoglobinaEmoglobina
Hemoglobin (lysed blood)
20
25
15
20
)
Hemoglobin (lysed blood)
10
ua(c
m-1
)
5
0300 350 400 450 500 550 600 650
Wavelength (nm)
Cosa determina l’assorbanza di un cromoforo?
•I cromofori sono di solito caratterizzati da doppi legami e sistemi di risonanza•Lo spettro di assorbimento di un cromoforo è solo parzialmente determinato dalla sua natura chimica •L’ambiente del cromoforo influenza le proprietà dello spettro
pH• polarità del solvente• Effetti di orientamento
•I cromofori possono agire da molecole reporter che possono dare informazioni circa il loro ambientecirca il loro ambiente .
•Effetti di protonazione/deprotonazione dovuti a cambiamenti di pH o effetti di ossidazione/riduzione influenzano la distribuzione elettronica dei cromofori
• polarità del solvente. Gli spettri cambiano in differenti solventi.
• Effetti di orientamento derivano da molecole di cromofori vicini.. E.g. hyperchromicity degli acidi nucleicihyperchromicity degli acidi nucleici.
Un’estesa coniugazione ha un grande Un’estesa coniugazione ha un grande effetto sulla effetto sulla λλmaxmax; lo spostamento sarà a ; lo spostamento sarà a maxmaxlunghezze d’onda maggiorilunghezze d’onda maggiori
HH
CC CC
HH HH
CC CC
HHHH
HH
1,3-butadiene
CC CC
HH HHCC CC
HH CC CC
HH
CC CCHHHH
λλmaxmax 170 nm170 nm λλmaxmax 217 nm217 nm
HHHH
CC CC HHλλmaxmax 217 nm217 nm
(diene coniugato)(diene coniugato)HH CC CC ( g )( g )
HHHH
HHHH33CC HH
CC CC
HH33CC
HH λλmaxmax 263 nm263 nm
HHHH CC CC
λλmaxmax 263 nm263 nmtriene coniugatotriene coniugato
CC CCHH
HH CHCH33
LicopeneLicopene
È il i tÈ il i t i d l di d l dÈ il pigmento rossoÈ il pigmento rosso--arancio del pomodoroarancio del pomodoro
λλmaxmax 505 nm505 nm
Gli i di bi i i i f i•Gli spettri di assorbimento sono misurati tramite spettrofotometri
Io I
iLight source Monochromator Cuvette
containing Samplep
Detector
MONOCROMATORE
È noto che quando un raggio di luce bianca colpisce un prisma di vetro viene scomposto in
MONOCROMATORE
q gg p p pdiversi colori. Quello che accade è analogo a quanto si osserva nell'arcobaleno o guardandoobliquamente la superficie di un CD.
La scomposizione (dispersione) in diversi coloriLa scomposizione (dispersione) in diversi coloritramite un prisma si spiega in quanto:• la luce “bianca” è in realtà un miscuglio diradiazioni di diversa frequenza e quindiq qcorrispondenti a tutti i colori;• quando un raggio di luce passa da un mezzo adun altro viene deviato (fenomeno detto“rifrazione”): l'entità della deviazione dipende dallarifrazione ): l entità della deviazione dipende dallalunghezza d'onda del raggio incidente.
Una radiazione di un solo colore ottenuta tramite dispersione, caratterizzata da una benprecisa lunghezza d'onda e frequenza, viene detta fascio di luce MONOCROMATICA.Si parla invece di fascio di luce POLICROMATICA quando esso è costituito da radiazioni difrequenza e lunghezza d'onda diverse. La luce bianca proveniente dal sole è policromatica.Per sapere se un fascio di luce è monocromatico o policromatico è sufficiente farlo passarePer sapere se un fascio di luce è monocromatico o policromatico è sufficiente farlo passareattraverso un prisma: se il raggio rimane unico si può dire che è monocromatico; se inveceè policromatico, viene scomposto in diversi raggi.
Aspetti sperimentaliAspetti sperimentali
Schema di uno spettrofotometro a doppio raggio
Spettrofotometro a doppio raggioSpettrofotometro a doppio raggio
Aspetti sperimentaliAspetti sperimentali
MONOCROMATOREECCITAZIONE
λEXCEXCSORGENTE
ATO
RE
Schema a blocchi di uno
NO
CR
OM
A
ISS
ION
E
λ EM
Schema a blocchi di uno spettrofluorimetro
MO
EM
RIVELATORE (TUBO FOTOMOLTIPLICATORE)
T=I/I0
A=log1/T = log I0/I
A = ελcd
La legge di Lambert-BeerA = ελcd
Path length / cm 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 %T 100 50 25 12.5 6.25 3.125
Absorbance 0 0 3 0 6 0 9 1 2 1 5Absorbance 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5
c
La legge di Lambert-BeerA = ελcd
Dipendenza dalla profondità, d
Assorbimento
0.82
Sorgente di luce
Rivelatore
La legge di Lambert-BeerA = ελcd
Dipendenza dalla profondità, d
0.62
Sorgente luminosab
Rivelatore Campione
La legge di Lambert-Beer A = ελcd
Dipendenza dalla profondità, d
Assorbimento
0.42
Sorgente
Rivelatore campioni
La legge di Lambert-BeerA = ελcd
Dipendenza dalla profondità, d
Assorbanza
0.22
Sorgente
Rivelatore Campioni
La legge di Lambert-BeerA = ελcd
Dipendenza dalla concentrazione, c
Assorbanza
0.82
Sorgente
Rivelatore
La legge di Lambert-BeerA = ελcd
Dipendenza dalla concentrazione, c
Assorbanza
0.62
Sorgenteb
Rivelatore Campione
La legge di Lambert-BeerA = ελcd
Dipendenza dalla concentrazione, c
Assorbanza
0.42
Sorgenteb
Rivelatore campione
La legge di Lambert-BeerA = ελcd
Dipendenza dalla lunghezza d’onda, λ
Assorbanza
0.82
Sorgente
Rivelatore
La legge di Lambert-BeerA = ελcd
Dipendenza dalla lunghezza d’onda, λ
Assorbanza
0.30
Sorgenteb
Rivelatore
La legge di Lambert-BeerA = ελcd
Dipendenza dalla lunghezza d’onda, λ
Assorbanza
0.80
Sorgenteb
Rivelatore
La legge di Lambert-BeerA = ελcd
Dipendenza dalla lunghezza d’onda, λ
Assorbanza
0.35
Sorgenteb
Rivelatore
Determinazione dei coefficienti di ti i lestinzione molare
Ι l i di d ll t i ti ti ll Ι valori di ε delle proteine possono essre stimati sulla base della composizione aminoacidica
(280 ) # f T ’ 5500 ε(280nm) = # of Trp’s x 5500 +# of Tyr’s x 1490 +# f di lfid 125 ( S S )# of disulfides x 125 (-S-S-)
predizioni:phttp://ca.expasy.org/tools/protparam.html
I valori teorici di ε sono accurati100000m
-1)
75000(M-1
c
50000
men
tal
25000
peri
m
00 50000 100000
ε ex
ε predicted (M-1cm-1)
PeròPerò…
• NADH libero o legato ha assorbimenti (ε) diversi(ε) diversi
• Si può “titolare” il sito dell’enzima i d ΔAmisurando ΔA
Spettri differenziali e perturbazioni del solvente
Cambiamenti nella lunghezza d’onda della banda di assorbimento possono essere indicativi di cambiamenti nella struttura.
L’uso di denaturanti o diversi solventi può essere utile per ottenereL uso di denaturanti o diversi solventi può essere utile per ottenere informazioni sulla struttura della proteina, e studiare i suoi cambiamenti conformazionali
Spettroscopia differenzialeSpettroscopia differenziale
GlycerolGlycerol
EDMSO
sucroseDMSOA
orE
λλ
Protein
nativaA
orE Urea
A29
2
temp30 40 50 60
λ •Spettri di proteine native o denaturate possono essere usati per studiare le cinetiche distudiare le cinetiche di denaturazione/rinaturazione0.01M
NaCl
•La stabilità delle proteine in diversi tamponi può essere studiata in diversi
A29
2 0.1M NaCl
NaCl
tamponi può essere studiata in diversi tamponi misurando il suo unfolding in funzione della temperatura
30 40 50 60temp
30 40 50 60
• Se il prodotto di una reazione è un cromoforo è possibile usare laSe il prodotto di una reazione è un cromoforo, è possibile usare la spettroscopia di assorbimento elettronico per studiare la cinetica enzimatica
A
tempo
pH 6OH O-
pH 6
CH2
pH 13 A
CH2
CH NH3+
CH2
CH NH2
250 270 290 310 330λ
250 270 290 310 330
• Effetti di protonazione deprotonazione• Effetti di protonazione deprotonazione
12 3
4 baα
ββ
N
Cm
NFe
5
678
NN
N N
67
c
d
OO
O O O
Denaturazione del DNADenaturazione del DNA
• È possibile seguire la denaturazione del DNA a 260 nm.
• Basi accoppiate ed impilate assorbono meno nell’UV di quelle• Basi accoppiate ed impilate assorbono meno nell UV di quelle“separate” - effetto ipercromico.
• La temperatura corrispondente a metà dell’aumento• La temperatura corrispondente a metà dell aumentoosservato nell’A260 è definita come “temperatura di melting”,Tm o temperatura di fusione del DNA.m p
• Il valore di Tm varia con il rapporto GC/AT - un maggiorcontenuto di GC conduce ad una Tm più alta.m p
• Una maggior forza ionica fa aumentare Tm, limitando larepulsione elettrostatica tra fosfatip
“Melting” del DNA:gAssorbanza relativa a 260 nm
• DNA doppio filamento 1.00pp
• DNA singolo filamento 1.37g
• Basi libere 1.67
Denaturazione del DNADenaturazione del DNA
Lodish
Temperatura diTemperatura di melting:
dipendenza dalladalla
composizione
Caratteristiche dei metodi analitici
• Intervallo analitico: campo in cui il metodo èapplicabile senza modificheapplicabile senza modifiche
• Sensibilità: capacità del metodo di deter-minare piccole quantità
• Limite di rivelabilità: minima osservazioneLimite di rivelabilità: minima osservazionedistinguibile statisticamente
S ifi ità ( l tti ità) ità di d t• Specificità (o selettività): capacità di deter-minare solamente il componente da misurare.E’ legata alla accuratezza
• Interferenza: effetto di un componente (che• Interferenza: effetto di un componente (che può non produrre lettura) sulla accuratezza di
’misura dell’analita• Precisione: concordanza tra misure ripetute:Precisione: concordanza tra misure ripetute:
esprime la dispersione delle misure attorno alla media; è correlata alla deviazionealla media; è correlata alla deviazione standard
• Accuratezza: concordanza tra il valore trovato e il valore “vero”; dipende da errori sistematici; p
Costruzione di curve di taratura
• La sensibilità è massima al picco di estinzione del fcromoforo
• A volte si preferisce un picco più “specifico”• Il “bianco” deve contenere tutti i reagenti, tranne la
sostanza da determinare• Occorrono possibilmente cinque punti, misurati in
doppiodoppio• Non si deve estrapolare la curva oltre il valore più
alto determinatoalto determinato
SommarioLa spettroscopia di assorbimento nel U.V/visibile absorption 210 – 900 nm.
L’energia luminosa promuove il trasferimento di elettroni dalo stato basale ad uno eccitato. g pQuesto avviene grazie a gruppi detti cromofori
•I cromofori delle proteine includono gli aminoacidi aromatici (Phe, Tyr, Trp), il legame peptidico, gruppi prostetici o cofattori (metalli). I cromofori sono caratterizzati da elettrini delocalizzati.
•Le frequenze a cui la luce è aasorbita sono influenzate dalla struttura e dall’ambiente del cromoforo.
• La spettroscopia di assorbimento ha diverse applicazioni
Problema n.1Il citocromo c è caratterizzato dai seguenti
coefficienti di estinzione molore:28500 96300 l 1 1ε280= 28500 e ε415= 96300 mol-1cm-1.
Una soluzione di citocromo c in una cuvetta da 1 ml assorbe 0.17 a 280 nm eda 1 ml assorbe 0.17 a 280 nm e
0.4 a 415 nm.
Calcolare la concentrazione della proteina
Perchè i valori ottenuti utilizzando i duePerchè i valori ottenuti utilizzando i due coefficienti non sono uguali?
Se il citocromo c pesa 12300 dalton, quanti mg sono presenti in 1 ml?
Problema n 2Problema n.2
• Trovare la concentrazione di NAD e NADH in una soluzione miscelata basandosi sui seguenti dati ottenuti in una cuvetta da 1 cm,
• I coefficienti di estinzione molare a 260 nm sono 1.5 x 10-4 per il NADH e 1.84 x 10-4 per il NAD. A 340 nm solo il NADH assorbe con ε di 6.22 x 10-3.
• La soluzione miscelata da assorbanze di 1.36La soluzione miscelata da assorbanze di 1.36 e 0,382 a 260 e 340 nm, rispettivamente.