Spettrofotometria Fluorescenza

5/9/2018 Spettrofotometria Fluorescenza - slidepdf.com

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SPETTROFOTOMETRIA DIFLUORESCENZA E FOSFORESCENZA

Quando gli elettroni passano da uno stato energetico superiore ad uno stato di energetico inferiore,

l'energia recuperata può venire emessa sotto forma di radiazione elettromagnetica; infatti, una volta chela molecola ha assorbito la radiazione incidente può andare incontro a due tipi di processo:

la maggior parte delle molecole trasferisce l'eccesso di energia all'intorno con un processo nonradiativo: l'energia emessa, sotto forma di calore, permette alle molecole circostanti di compierevibrazioni, rotazioni e traslazioni.

una piccola parte delle molecole, invece, subisce un decadimento radiativo dove l'energia ineccesso viene liberata sotto forma di fotoni.

Una molecola eccitata si trova in uno degli stati vibrazionali di un livello energetico superiore; essendo

soggetta a collisioni con le molecole circostanti rilascia parte della sua energia sotto forma nonradiativa e scende nella scala dei livelli vibrazionali.

Il comportamento delle molecole fino a questo punto è indistinto; la prima differenza dipende dallemolecole circostanti: se queste sono in grado di assorbire la restante energia in eccesso della molecolaeccitata questa completa il suo rilassamento in modo non radiativo, altrimenti si possono avere i processi di fluorescenza o di fosforescenza.

La fluorescenza è uno dei due processi radiativi con cui si può verificare il rilassamento di unamolecola eccitata, l'altro è la fosforescenza.

La distinzione tra i due processi fu originariamente fatta in base al tempo di vita della radiazione: nellafluorescenza la luminescenza cessa quasi subito dopo aver eliminato la radiazione eccitante, mentrenella fosforescenza la radiazione continua ad essere emessa, almeno per un breve lasso di tempo, anchedopo aver eliminato la sorgente eccitante.

Ora, invece, si possono distinguere i due processi sulla base della natura degli stati elettronici

coinvolti nelle transizioni responsabili dell'emissione di radiazione.

Le transizioni elettroniche che si possono verificare in una molecola organica a seguitodell’assorbimento di luce sono rappresentate nella Tabella 2.

http://it.wikipedia.org/wiki/Due

http://it.wikipedia.org/w/index.php?title=Radiazione&action=edit

http://it.wikipedia.org/wiki/Molecola

http://it.wikipedia.org/w/index.php?title=Fosforescenza&action=edit

http://it.wikipedia.org/wiki/Tempo

http://it.wikipedia.org/w/index.php?title=Luminescenza&action=edit

http://it.wikipedia.org/w/index.php?title=Transizione_%28fisica%29&action=edit

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http://it.wikipedia.org/wiki/Due



Le energie associate ai differenti tipi di transizione sono riportate in Figura 1

Quando un elettrone viene promosso da uno stato fondamentale ad uno di eccitato, esso puòmantenere lo spin originario oppure invertirlo.

Se l’eccitazione avviene con ritenzione dello spin

, si parla di stato di singoletto e gli spin degli elettroninello stato eccitato sono appaiati come nello stato fondamentale.

io allo stato attivato avviene con inversione dello Se, invece, il passagg spin, si parla di stato di tripletto.

Allo stato di singoletto compete una energia più alta e una vita media che va da 10--11 a 10-9

lo stato di tripletto ha una energia inferiore e una vita media da 10-3 a 101 sec.

Lo stato di tripletto è di fondamentale importanza per la fotochimica dei composti organici.

FLUORESCENZA la radiazione è generata in virtù di transizioni tra stati con la stessalicità di spin (per esempio S1 → S0).

FOSFORESCENZA, invece, la transizione coinvolta comporta variazione della molteppiù frequente sono transizioni tripletto-singoletto.

122

sec, mentre

Nellamoltep Nella licità dispin: il caso



123

Il diagramma di Jablonski

ergetiche che si verificano per assorbimento di unaradiazione di sufficienteenergia in una molecola.

bdei suoi stati elettronici di singoletto (S1, S2, …).

Quello che si genera in un primo momento è dunque uno STATO DI

riassume le trasformazionien

imento di luce, viene eccitata a uno

SINGOLETTO

Una molecola nello stato fondamentale (S0), a seguito dell’assor

in quanto le molecole a legge dellanello stato fondamentale sono quasi tutte dei singoletto e l’eccitazione segue l

conservazione dello spin, cioè le transizioni tra stati a diverse mo eplicità sono proibite.

Pertanto, la transizione di uno stato fondamentale di singoletto S0) al primo stat triplettoeccitato (T1) ha una scarsissima probabilità di avvenire in quanto è una transizi ne proibita.

Cosa accade ora?

1) la molecola eccitata nello stato di singoletto S2, a più alta energia, può ricadere nello stato di

a

lt( o di

o

minor energia S1, senza emettere radiazioni, mediante una serie di transizioni, chiamateconversioni interne: in una conversione interna l’energia accumulata viene dissipata sotto formdi calore.

2) la molecola eccitata nello stato di singoletto S1 può ricadere nello stato fondamentale S senzaemettere radiazione

0

eccitata nello stato di singoletto S2 o S1, può sottostare a un interscambio senzail disaccoppiamento di spin, passando allo stato di tripletto T1 in un

processo chiamato incrocio intersistema.

3) la molecola eccitata nello stato di singoletto S1 può ricadere nello stato fondamentale S0,emettendo una radiazione in un processo che viene chiamato fluorescenza

4) la molecolaradiazioni che richiede



124

La

a) si chiama fosforescenza. Questa conversione tripletto-singoletto analogamente a

quella singoletto-tripletto ha una bassa probabilità.

b) tare a un interscambio senza radiazioni che richiede il disaccoppiamento dispin, passando nuovamente allo stato di singoletto in un processo di decadimento vibrazionale,

co S;e radiazioni.

molecola dallo stato eccitato T1 può a sua volta:

ricadere allo stato fondamentale con emissione di energia; l’energia associata alla conversionedi T1 in S0

lo stato T1 può sottos

che porta la molecola eccitata al più basso livello vibrazionale del rispettivo stato elettronisuccessivamente può ricadere nello stato di minor energia S0, senza emetter

FLUORESCENZA

Nella fluorescenza un elettrone molecolare viene

investito da un'onda elettromagnetica della radiazioneultravioletta ed assorbendone l'energia si sposta suun'orbitale più esterno, ma l'eccessiva energia

infinitesima di secondo.

e due curve rappresentano l'energia dell'elettrone in

nzione della distanza tra gli atomi della molecola,entre le linee orizzontali all'interno delle curve sono i

i.

diazione

di

Ma questo è uno stato instabile, perciò l'elettrone ricade nell'orbitale iniziale, provocando un'ondaelettromagnetica che sarà visibile come luce blsalto è piccolo. Infatti la lunghezza d'onda dellaenergetico.Le radiazioni emesse possiedono, in generale, a

In pratica la radiazione emessa ha un’ene

radiazione incidente (la cui ener

vibrazionale improvvisamente acquisita dalla molecolaviene dispersa in brevissimo tempo nell'ambiente,lasciando l'elettrone in un particolare stato instabile dalquale tornerà nella posizione originaria, emettendo unfotone di luce visibile, nel giro di una frazione

L

fumlivelli di energia corrispondenti alle loro vibrazion Un elettrone, situato nel primo livello di vibrazionedell'orbitale di partenza, viene colpito da una raelettromagnetica e ne assorbe l'energia grazie alla qualeviene spinto su un orbitale più esterno, in un livellovibrazione elevato; da qui, come indicato dalle frecce piccole, perde energia fino a raggiungere lo stato divibrazione più bassa.

u, se il salto è elevato, o come luce verde o rossa, se ilradiazione è tanto più corta quanto più alto è il salto

frequenze ν' minori di ν.

rgia inferiore (e frequenza maggiore) rispetto allagia è maggiore ma la frequenza minore).



FOSFORESCENZA

In questo caso un elettrone, che si trovainizialmente nel primo livello di vibrazione

dell'orbitale in basso, viene colpito dai raggi

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ultravioletti e, grazie alspinto su un orbitale

l'energia assorbita, viene più energetico, in un livello

ne più

a la struttura molecolare del materiale

più

a;è il motivo per cui la luce di fosforescenza

uò essere emessa anche molto tempo dopo la

ecasuale durante un tempo ben più lungo.Poiché l'energia dell'orbitale intermedio può variare anche di molto, a secondo della struttura cristallinadel materiale, anche la luce di fosforescenza può aver abbiamo visto per la fluorescenza.

Secondo l’interpretazione basata sulla natura degli st

processo di fosforescenza, invece, la molecola deve i dellivello energetico fondamentale. Una volta assorbita l' e atrovare in uno stato singoletto di un livello energetico

stesso livello energetico. Le curve dell'energia potenziale di

" che permette la conversione da singoletto a tripletto e la molecolaa incontro ad un Intersystem crossing. Una volta avvenuto lo scambio la molecola cede energiall'intorno in maniera non radiativa fino allo stato vibrazionale fondamentale dello stato elettronico

di vibrazione più elevato; da qui, come indicatodalle frecce piccole della figura, perde energiafino a raggiungere lo stato di vibrazio bassa.

Mfosforescente è tale che la stessa energiacorrisponde anche ad un orbitale intermedio

stabile, e quindi l'elettrone sarà costretto aspostarsi su quest'ultimo.

Tale orbitale intermedio è molto stabile, e ciò permette all'elettrone di rimanervi per parecchiotempo, prima di ricadere nell'orbitale partenzquesto pfine dell'eccitazione. Inoltre, essendo la probabilità che ha l’elettrone di ricaderesull'orbitale di partenza estremamente bassa (si

cadano tutti nello stesso istante, ma in mododice che la transizione è proibita), gli elettroni non d

e un qualsiasi colore dello spettro visibile, come

ati elettronici coinvolti, affinché avvenga unnizialmente essere in uno stato singolettoenergia della radiazione incidente, si viensuperiore e in uno dei livelli vibrazionali. La

molecola ha anche uno stato tripletto nel livello elettronico superiore, che possiede un'energia un pòinferiore rispetto allo stato singoletto delloquesti due stati si intersecano e un livello vibrazionale dello stato tripletto e uno dello stato singolettoeccitati hanno la stessa energia.A questo punto c'è un "meccanismovaeccitato.



126

suato

o

SPETTRO DI LUMINESCENZA

Questo stato è più basso del corrispondente stato singoletto e la molecola non potrebbe emettere laenergia perché il suo ritorno allo stato fondamentale è proibito essendo un passaggio da uno statripletto ad uno singoletto; ma l'accoppiamento spin orbitale che è stato responsabile anchedell'intersistem crossing rompe di nuovo le regole di selezione e permette un passaggio, seppure moltlento.

Questo spiega facilmente anche il motivo per cui l'effetto della fosforescenza non termina con il cessaredella radiazione incidente.

anto osservato per la fluorescenza; infatti l'energia dello stato diipletto T1 è in genere più bassa di quella dello stato di singoletto S1

Per i fenomeni di fluorescenza

Poichè la fluorescenza trae origine dalla caduta dell'elettrone dal più basso livello vibrazionale del primo stato elettronico eccitato a uno dei livelli vibrazionali dello stato fondamentale, lo spettro di

fluorescenza, è in genere simile allo spettro di assorbimento ma spostato a lunghezze d'onda

maggiori.

Anche gli spettri di fosforescenza sono spostati batocromicamente rispetto agli spettri diassorbimento ma più di qutr

o la fosforescenza, infatti, vale la seguente legge:

L EGGE DI STOKES

L'energia del fotone emesso appartiene ad una regione dello spettro spostata verso

lunghezze d' onda maggiori rispetto alla lunghezza d' onda del fotone.

a

i assorbimento (l' intera

tica assorbita

appartenente alla banda illuminante).

La banda di luminescenza è indipendente dalla radiazione monocromatic

eccitatrice purché appartenente a una medesima banda d

banda di emissione è presente per ogni radiazione monocroma

La banda di assorbimento è ottenuta come inviluppo delle righe di eccitazione.



SPETTROFLUORIMETRO

Diagramma di uno spettrofluorimetro.

La luce prodotta dalla lampada (L) viene focalizzata sull'ingresso di un monocromatore (M1) cheseleziona la lunghezza d'onda desiderata. Il fascio monocromatico colpisce il campione (S). Lacomposizione cromatica della luce emessa viene analizzata dal secondo monocromatore (M2) eintensità dal fotomoltiplicatore (PM). Notare la posizione del secondo monocromatore per evitare di

raccogliere la luce trasmessa.

Il secondo monocromatore è infatti necessario per evitare che alcune radiazioni eccitanti arrivino alrivelatore, e questo può accadere nonostante la radiazione emessa venga misurata perpendicolarmente

l'

rispetto a quella eccitante, a causa di fenomeni di diffusione, in particolare a causa della diffusione diRayleight e della diffusione di Tyndall.

DIFFUSIONE DI R AYLEIGHT: si verifica quando la radiazione attraversa un mezzo trasparente in cuincontra particelle con diametro molto inferiore (inferiore a 1/10) de

illa

atico le radiazioni a bassa a bassa

propria lunghezza d’onda.La luce che diffonde ha la stessa lunghezza d’onda di quella incidente eun’intensità proporzionale alla quarta potenza della frequenza della luceincidente. In un fascio policromlunghezza d’onda sono quelle che vengono diffuse più efficacemente.

127



128

DIFFUSIONE DI TYNDALL: si verifica in presenza di sistemi colloidali nei quali le particelle hanno undiametro confrontabile con la lunghezza d’onda della luce visibile.L’intensità della luce diffusa è proporzionale alla seconda potenza della

Il secondo monocromatore sp di 20 nm oltre quella di eccitazione, perchéla lettura della fluorescenza a Vi è però un altro tipo di inter

frequenza della radiazione incidente

osta la banda di fluorescenzavvenga senza interferenze dovute a questi fenomeni di diffusione.

ferenza che può insorgere, e questa è la DIFFUSIONE R AMAN: illvente, si verifica quando viene diffusa solo una piccolissima frazionefenomeno, che dipende dal so

ella luce che incide su un mezzo trasparente.i.

Se si usa MeOH è spostata

Riassumendo, la diffusione della sua interazione con la materia,uò essere definita elastica (Rayleigh o Tyndall scattering) o anelastica (Raman scattering). Nel primo

enti vibrazionali e/o rotazionali delle molecole con

anno uno scambionergetico con le molecole, le quali possono perdere o acquistare energia, sempre rispettando le leggi

a radiazione diffusa con una frequenza più bassa di quella del raggio incidente si definisce radiazioneStokes, mentre quella a più alta freq anti-Stokes. Poiché la prima èaccompagnata da un aumento dell'energia molecolare (avvenimento frequente, soprattutto a

può solo avvenire se la molecola, al momento della collisione, era in

di uno strumento molto sensibile.

effettoaman: affinchè ciò accada occorre, innanzitutto, che le molecole siano polarizzabili. Quando una

izzata.n

dIn questo caso la lunghezza d’onda della radiazione può essere spostata verso valori minori o maggior

a λ maggiori di +30 nm, con CHCl3 di +10 nm.

(scattering) della luce, come risultato p

caso, la luce diffusa mantiene la stessa frequenza del raggio incidente, mentre nel caso dello scatteringanelastico, le frequenze sono diverse e costituiscono lo spettro del campione.

♥♥♥♥♥♥♥♥♥♥♥♥♥♥♥♥♥

L'effetto Raman risulta dall'interazione dei movimuna radiazione elettromagnetica.Come già accennato, tale effetto è di tipo anelastico, ovvero i fotoni che collidono hedella meccanica quantistica.Se la molecola guadagna energia, il fotone verrà riemesso con una frequenza inferiore di quella

iniziale, al contrario, se la molecola cede energia, la nuova frequenza del fotone sarà maggiore.

Luenza viene chiamata radiazione

temperatura ambiente, anche se soggetto a certe regole di selezione), mentre l'altra consegue da una perdita di energia molecolare (cheun uno stato vibrazionale o rotazionale eccitato), la radiazione Stokes è generalmente più intensadell'anti Stokes. In ogni caso, comunque, la quantità di energia scambiata è molto piccola: per poterlastudiare è necessario l'utilizzo

Purtroppo, non tutte le rotazioni o vibrazioni molecolari sono Raman attive, ovvero generano unR molecola viene introdotta in un campo elettrico subisce una distorsione, in quanto la carica positiva delnucleo viene attratta dal polo negativo e la carica negativa degli elettroni dal polo positivo. Questaseparazione di carica comporta un momento di dipolo indotto e la molecola si definisce polar L'entità del dipolo indotto dipende dalle dimensioni del campo e dalla geometria della molecola. Se iqueste condizioni la molecola è soggetta ad una radiazione di una certa frequenza, il campo subito daogni molecola varierà creando delle oscillazioni nel dipolo della stessa frequenza della radiazione,sicchè abbiamo subito evidenza dell'effetto Rayleigh.



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e, e solo se, le molecole subiscono anche dei movimenti interni, come rotazione o vibrazione, che

ione

,

queste sostanze e sono molto ben riproducibili:erciò, uno spettro Raman è come l’impronta digitale della sostanza in questione, che è riconoscibile

Scambiano la polarizzabilità periodicamente, all'oscillazione del dipolo si abbinerà l'oscillazionerotazionale o vibrazionale, e la sua frequenza di oscillazione non sarà più uguale a quella dellaradiazione incidente, ma sarà incrementata o decrementata della frequenza di vibrazione (o rotazione).Pertanto, affinché una sostanza possa essere Raman attiva, occorre che ci sia una vibrazione o rotaz

molecolare che modifichi una componente della polarizzabilità molecolare.

L'analisi di sostanze Raman-emittenti è, quindi, possibile perché esse vengono eccitate dal raggio laser producendo uno spettro che viene visualizzato sul computer. I picchi che si rilevano sonocorrispondenti alle energie di vibrazione dei legami di panche se presente in minima quantità.

ESEMPI DI SPETTRI DI EMISSIONE

Gli spettri di fluorescenza si ottengono con lo spettrofluorimetro.

La figura sottostante mostra lo spettro di assorbimento e quello di fluorescenza dell’antracene discioltoin cicloesano.

Lo spettro di assorbimento è compreso tra 2900 e 3800 Å e corrisponde alle transizioni tra lo statofondamentale e il primo stato eccitato. I picchi (bande), spesso chiamate strutture vibrazionali,orrispondono a transizioni tra il livello vibrazionale più basso dello stato fondamentale e differenti

livelli vibrazionali del primo stato elettronico eccitato. La banda centrata a 3780 Å corrisponde allatransizione tra il più basso livello v e e il più basso livellovibrazionale dello stato eccitato ed è chiamata transizione 0-0.

o spettro di fluorescenza è compreso tra 3700 e 5000 Å. Le bande corrispondono a transizioni tra il

asi si sovrappone alla banda di assorbimento centrata a 3780 Å corrispondente allaansizione 0-0 inversa. Notare come gli spettri di assorbimento e di fluorescenza siano simmetrici

e

n unasoluzione di cicloesano.

Å,to è

2800 Å.

c

ibrazionale del livello fondamental

Llivello vibrazionale più basso dello stato eccitato e i vari livelli vibrazionali dello stato fondamentale.La banda che qutr rispetto alla transizione 0-0.

Spettri di fluorescenzadi assorbimento diantracene i

Lo spettro di emissione(fluorescenza) è quello

compreso tra 5000 e 3700lo spettro di assorbimenquello compreso tra 3800 e



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cala esono riportati, a destra, l'intensità di fluorescenza in una scala che prende come valor intensità massima e, a sinistra, il coefficiente di estinzione molare.

Lo spettro di emissione è stato ottenuto eccitando con una lunghezza d'onda di 2537 ÅLe caratteristiche di uno spettro di fluorescenza sono:

1) Una sostanza fluorescente in un solvente omogeneo ha un solo spettroindipendente dalla lunghezza d’onda di eccitazione. Questo è dovuto al fatto ch roforoha soltanto un livello che emette radiazioni.

2) Lo spettro di fluorescenza è sempre a lunghezze d’onda maggiori dello spettro di assorbimento,eccetto per la transizione 0-0 per cui le transizioni hanno la stessa energia.

3) L’interazione con il solvente può impedire questa sovrapposizione degli spettri. La forma e la

.ento e di

Sulle ascisse sono riportati la lunghezza d'onda (scala in alto) e il numero d'onda (s in basso). Sulle ordinate unitario il valore della

.

di fluorescenzae un fluo

posizione dei massimi sono sensibili alle proprietà molecolari del solvente (o in generale delmezzo). Questo è dovuto alla perturbazione di livelli energetici del fluoroforo dovuti adinterazioni dipolo-dipolo o a interazioni tra cariche nel caso v i siano presenti cariche spazialiQueste interazioni sono maggiori in solventi polari e spostano i picchi di assorbimemissione verso lunghezze d’onda maggiori.

TIPO DI TRANSIZIONI CHE AVVENGONO NEL PROCESSO DI FLUORESCENZA

che si osservano sono transizioni a bassa ener Quelle gia, la lunghezza d’onda è inferiore ai 250 nm (al

di sopra si ha fotolisi dei legami).

La fluo hé i processi cheompetono con la fluorescenza avvengono con minore facilità.

Le tran a100 a 1

FLUORESCENZA

rescenza è legata a transizioni π → π* , sia perché hanno vita breve, sia percc

sizioni n → π* non danno il fenomeno della fluorescenza perché la loro assorbività molare è d000 volte più piccola di quella della transizione π → π*.

RESA QUANTICA DI

utte le molecole che assorbono nel visibile/UV sono quindi potenzialmente fluorescenti, ma ilfenomeno è in ssipativi nondiativi che competono con l’emissione di radiazione.

T realtà rilevante solo per alcune di esse, a causa dell’esistenza di fenomeni dira Questi comprendono:

la conversione interna, cioè la perdita di energia in maniera non radiativa, soprattutto a causa durti con le molecole di solvente o con le pareti del conten

iitore, che sono pure alla base del

fenomeno di rilassamento vibrazionale, cioè del decadimento da un livello vibrazionale



all’altro, che spiega perché le frequenze di emissione sono più basse di quelle di assorbimento;

l’intersystem crossing, in cui si ha una transizione tra uno stato di singoletto e uno di tripletto lecui curve di potenziale si incontrano in un punto, a cui generalmente fa seguito il fenomenodella fosforescenza (emiss );ione di radiazione ritardata nel tempo

il quenching, dovuto alle collisioni con molecole di soluto capaci di interagire con lo statoelettronico eccitato, come O

oiché questi fenomeni sono tutti del primo ordine o pseudo-prim’ordine (nel caso del quenching), sintica di fluorescenza f F, come:

2 e I-.

P può definire la resa qua

quencingingcrossntersystemiternaineconversion za fluorescen

za fluorescen

zaescenK K K K

K

+++

= fluor f

Si può za si può anche esprimereome:

dove le k rappresentano le costanti cinetiche dei fenomeni descritti.

dimostrare che il rendimento quantico del processo di fluorescenc

assorbiti fotonidi

osì sostanze chiaramente fluorescenti, comela fluorescina hanno un rendimento pari a 1.

VARIA E LA

numero

emessi fotonidinumero f za fluorescen

La resa quantica è quindi un numero compreso tra 0 e 1: c

Ricordiamo infine che la resa quantica del processo influisce sulla sensibilità del metodo, poichél’intensità della radiazione emessa ad una certa lunghezza d’onda è proporzionale ad essa.

BILI CHE INFLUENZANO LA FLUORESCENZA

FOSFORESCENZA

Sono diversi i fattori che possono influenzare il o della fosforescenza.Consideriamo uno ad uno.

FFETTO DELLA STRUTTURA MOLECOLARE

fenomeno della fluorescenza

E

è favorito se nella molecola sono presenti gruppili

numeroegli anelli ed il grado di condensazione.

Sappiamo che il fenomeno della fluorescenzafunzionali aromatici con bassi livelli di energia necessari per e transizioni π → π*. Così tutti gidrocarburi non aromatici non sostituiti danno fluorescenza, e la resa quantica aumenta cold

131



132

etipo

→ π*, l’elettrone passarapidamente allo stato di tripletto,

Qui invece la transizione più facile èdel tipo π → π*, e questi prodotti

i un gruppo carbossilico o carbonilico riduce la fluorescenza, perché la transizione n → π* ha un’energia minore della π → π*, e la resa quantitativa diminuisce.

r

fluorescenza meno accentuato a causa delle frequenti conversione La presenza di gruppi carbonilici o doppi legami a elevata coniug ealiciclici favoriscono la fluorescenza.La presenza in soluzione di molecole paramagnetiche (ad esempio O2), invece, determina unadiminuzione del fenomeno.

COMPOSTO FORMULA IRELATIVA

In questi casi la transizione chrichiede minore energia è deln

N O S N

impedendo la fluorescenza

emettono fluorescenza.

Invece, la presenza sull’anello benzenico d

Ricordiamo che le molecole che contengono atomi pesanti (Cl, B , F, I) danno il fenomeno della

intersistema.azione in composti alifatici

NTENSITÀ

Benzene C6H6 10

Fluorobenzene C6H5F 10

Clorobenzene C H Cl 76 5

Bromobenzene C6H5Br 5Iodobenzene C6H5I 0

Fenolo C H OH 186 5

Anilina C6H5 NH2 20

Acido benzoico C6H5COOH 3

EFFETTO DELLA RIGIDITÀ STRUTTURALE

Molti composti organici flu o cara una c nella loro struttura per

cui l'energia degli stati eccitati a per vibrazion della molecola. Per esempio la fluorescina è alta rescente possiede un ponte etereo fra gli anelliaromatici, mentre la fenol poic a energia per conversioneinterna.

orescenti son tterizzati da erta rigidità

e torsionalenon viene persmente fluo perchè

ftaleina non lo è hé lo stato eccitato perde la su

N

N

N

H



posti rigidi sono anche quelli adsorbiti su superfici solide o che formano chelati particolarm

lecole non rigide c’è maggiore probabilità di conversione interna e conseguentemdisattivazione del processo di emissione di energia radiante.

pH

Com enterigidi.

Nelle mo ente

EFFETTO DEL

tto interessa soprattutto composti aromatici contenenti sostituenti acidi o basici; laatti, che questi esistano in più forme di risonanza rende più stabile il primo stato e

Questo effe possibilità, inf ccitato,

INTENSITÀ

e aumenta la fluorescenza

COMPOSTO FORMULA RELATIVA

Benzene C6H6 10Anilina C6H5 NH2 20

Ione anilinio C H NH - --6 5 3

ORME DI RISONANZADELL’ANILINA

Questo effetto può essere sfruttato per la rivelazione del punto finale delle titolazioni: questo perchéento della

ne aniliinvece nel visibile ( la radiazione non viene rivelata dallo spettrofluorimetro).

In questo caso però il pH al quale si raggiunge il punto finale della titolazione è diverso

133

F

quando la molecola passa dalla forma indissociata a quella dissociata si ha uno spostam

lunghezza d’onda di fluorescenza dall’UV al visibile.

Così se l’anilina emette una radiazione nell’UV (λ = 310 – 405), lo io nio emette

da quello teorico che si ricava dalla Ka dell’elettrolita; questo perché la Ka per lamolecola eccitata è diversa (fino a 4 – 5 ordini di grandezza) da quella allo statofondamentale.

N

H H

N +

-

H H

-

N +

H H

N

H H

+

H



134

FFETTO DELLA TEMPERATURA E DELLA VISCOSITÀ DEL SOLVENTEE

Questo perché si verifica una conversione esterna, cioè il trasferimento dell’energia per collisione

iolto nelina comunque una diminuzione della fluorescenza.

Un aumento della temperatura del solvente determina una diminuzione della sua viscosità,influisce sulla fluorescenza dell’analita in maniera negativa.

e questo

dall’analita al solvente o ad altri soluti in soluzione.

Ricordiamo che la presenza di atomi pesanti (CBr 4 , EtI) o di ossigeno molecolare (O2) discsolvente determ

EFFETTO DELLA CONCENTRAZIONE

L’intensità della radiazione fluorescente If ci è data dalla relazione:

diazione incidente sul campione

Iuscente = intensità della radiazione uscente dal campione

costante che dipende dal rendimento quantico del processo di fluorescenza

If = intensità della radiazione fluorescenteIincidente = intensità della ra

K =

Dalla legge di Lambert – Beer, però, noi sappiamo che:

cd I incidente

⋅⋅=−= ε I uscente

A log

cd uscente

I

I ⋅⋅−

=ε 10

cd I

⋅⋅

Sostituendo nell’espressione iniziale abbiamo che l’intensità della radiazione fluorescente è datadall’espressione:

cd

f I

⋅⋅−

⋅⋅−

−⋅⋅=

⋅−⋅=

incidente

incidenteuscente I −

⋅=ε 10

( )( )cd

I K

K I K

I K I K ⋅−⋅=

ε

ε

101

10

0

0

( )uscenteincidente f I I K −⋅=

0

I



135

nsità della fluorescenza sia direttamente proporzionale alla concentrazionedell’analita:

Facendo quindi l’espansione in serie di Mc Laurin dell’esponenziale otteniamo una relazione chemostra come l’inte

( )c I f d I K ⋅⋅⋅⋅= ε

303,20

olto diluite, la cui concentrazione sia inferiore a 10-5 M

k e d = 1, a valori così bassi di concentrazione il termine (2,303 · ε ) < 0,05 e quindiascurabile. La relazion

Questa relazione vale però solo per soluzioni m(quindi parliamo di soluzioni da 10 a 100 volte più diluite di quelle che si usano per unadeterminazione UV): per questo la spettroscopia di fluorescenza è adatta per la determinazione dianaliti in tracce!Se infatti I0 =tr e si riduce a:

cK I f ⋅=

A concentrazioni maggiori il termine non è più trascurabile, e la linearità viene meno, essenzialme per due fattori che sono:

nte

l’autoassorbimento, per cui la lung a della radiazione emessa si sovrappone aquella di assorbimento. Il risu iminuisce man mano che il fascioattraversa la soluzione.

l’autoestinzione, cioè la collisione fra molecole eccitate

hezza d’ondltato è che la fluorescenza d

Spettrofotometria Fluorescenza

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