Ch

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Prof. Antonio Prof. Antonio Toffoletti Toffoletti

CHIMICAVenVen 15 novembre 201315 novembre 2013

Lezioni di Chimica FisicaLezioni di Chimica Fisica•• Spettroscopia Spettroscopia UUltraltra VViolettaioletta--VisVisibile (ibile (UVUV--visvis))

•• 2^ parte 2^ parte –– Fluorescenza e FosforescenzaFluorescenza e Fosforescenza

Laurea triennale in BIOLOGIALaurea triennale in BIOLOGIAA. A. 2013A. A. 2013--1414

2

Principali cromofori biologici e caratteristiche di assorbimentoC

him

ica Fisica p

er Bio

log

ia -A

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Esempio di spettro di assorbimento UV di una proteina

240nm<λ<300nmAssorbimento π-π* degli amminoacidi aromatici

190nm<λ<240nmAssorbimento π-π* dei legami peptidici

λ<190nmσ-σ* di tutti i

legami

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Spettri di assorbimento UV dei principali amminoacidi aromatici

Triptofano (Trp)

Fenilalanina (Phe)

Tirosina (Tyr)

Assorbimento π-π* aromatico

L’assorbimento a λ=280 nm viene talvolta usato per misurare la concentrazione di proteine

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Spettri di assorbimento UV dei principali amminoacidi aromatici

Triptofano (Trp)

Fenilalanina (Phe)

Tirosina (Tyr)ε280 (Trp) = 5690 l mol-1 cm-1

ε280 (Tyr) = 1280 l mol-1 cm-1

ε280 (Phe) = 160 l mol-1 cm-1

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Esempio di spettri di assorbimento UV delle basi del DNA, RNA

N N

N N

NH2

N N

N NH

O

N

N

NH

O

O

N

N

O

NH2

Adenina (A)

Guanina (G)

Timina (T)

Citosina (C)

N

N

O

O

Uracile (U)

Assorbimento π−π* tra 260-270 nm

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L’incolonnamento delle basi nella struttura del DNA induce una diminuzione di assorbimento (effetto “ipocromico”).Si utilizza questo effetto per misurare la denaturazione del DNA (“curva di fusione” del DNA)

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Fluorescenza

A

S0

S1

S2

S3

La fluorescenza avviene sempre a lunghezze d’onda uguali o maggiori dell’assorbimento.Si può osservare struttura vibronica anche nella fluorescenza

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Si definisce la resa quantica di fluorescenza come il rapporto tra il numero di fotoni emessi ed il numero di fotoni assorbiti

è un numero compreso tra 0 e 1assorbiti fotoni .

emessi fotoni .

nr

nrfl =Φ

H2O, pH = 7

I principali fluorofori biologici intrinseci sono gli amminoacidi aromatici, in particolare tirosina e triptofano. Le basi degli acidi nucleici sono pochissimo fluorescenti. Sono fluorescenti alcuni coenzimi come NADH, FAD e FMN.

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Schema semplificato della strumentazione per assorbimento / fluorescenza UV-VIS

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Sorgente

Campione

Riferimento

Schema di una spettrometro di assorbimento UV-VIS “a doppio raggio”

Monocromatore(prisma, reticolo)

Rivelatori di intensitàluminosa

(fotodiodi o tubi fotomoltiplicatori)

fenditura

specchi

I0(λλλλ)

I(λλλλ)

( ) ( )( )

( ) ( )λλ

λλλ

TLogA

I

IT

110

0

=

=

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Sorgente

Campione

Schema di una spettrometro di fluorescenza UV-VIS (fluorimetro)

Monocromatore di eccitazione (prisma, reticolo)

Rivelatore di intensitàluminosa (tubo fotomoltiplicatore)

Monocromatore di emissione(prisma, reticolo)

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Esercizi di spettroscopia

1) La radiazione elettromagnetica con numero d’onda 20000 cm-1 appartieneal campo a) dell’infrarossob) del visibilec) dell’ultravioletto

2) Se una radiazione elettromagnetica ha una frequenza ν = 1014 Hz, quant’è il periodo dell’oscillazione del campo elettrico?

a) T=1014 secondib) T=10-2 millisecondic) T=10-2 picosecondi

3) Il coefficiente di assorbimento (o estinzione) molare (εεεε) nella legge di Lambert-Beer dipende : a) dalla lunghezza d’ondab) dalla concentrazionec) dal percorso ottico

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4) Quale delle seguenti componenti di un spettrofotometro sono utilizzate per separare le diverse componenti in frequenza della radiazione

a) la lampadab) prisma o reticolo di diffrazionec) rivelatore

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7) Se una soluzione di triptofano a concentrazione 2×10-4 M ha assorbanza 1.1 a λ=280nm in una cella con cammino ottico di 1 cm , quanto vale εεεε (λ=280) ?

1-1-14

cm moli l 5500cm1lmoli102

1.1 =

⋅×==⇒= −−cl

AεclA εεεε

6) Il fenomeno della fluorescenza si riferisce a: a) assorbimento di un fotone da parte di un cromoforob) emissione di un fotone da parte di un cromoforo dopo l’eccitazionec) assenza di eccitazioni elettroniche in un cromoforo

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