FLUORIMETRIA E SPETTROFLUORIMETRIA

Si definisce fluorescenza la luminescenza di una sostanza in seguito ad assorbimento di radiazione elettromagnetica.

La luminescenza è un processo in cui un atomo od una molecola emette radiazione luminosa nel corso di una transizione da un livello elettronico di maggiore energia ad uno minore. Se la transizione dal livello fondamentale ad un livello superiore è dovuta ad assorbimento di radiazioni luminose, la successiva emissione di luce è detta fotoluminescenza o fluorescenza.

Se gli atomi e le molecole colpiti da radiazione elettromagnetica e passate ad un livello energetico eccitato, nel ritorno allo stato fondamentale disperdono l’energia acquisita per collisione con altri atomi o molecole, si ha soltanto il fenomeno dell’assorbimento della radiazione elettromagnetica.

Se l’energia acquisita viene in parte riemessa come

radiazione elettromagnetica si ha il fenomeno della

fluorescenza. Cioè, il ritorno di un elettrone dallo stato

eccitato allo stato fondamentale si accompagna

all’emissione di un fotone.

Poichè si perde energia nelle transizioni senza

radiazioni che sempre si accompagnano alla

transizione fluorescente, l’energia del fotone emesso è

sempre minore dell’energia del fotone assorbito, cioè la

della luce fluorescente è sempre maggiore della

lunghezza d’onda della luce eccitante.

RADIAZIONI ECCITANTI: UV E VISIBILE

Composti fluorescenti di interesse biologico:

Vitamine;

Ormoni;

Nucleotidi;

Amminoacidi aromatici (Trp);

Clorofille;

Proteine.

FLUOROFORI ESTRINSECI

Radamine

Fluoresceine

Cumarine

Carbocianine

Idrocarburi aromatici e derivati: pirene, perilene,

antracene.

L’emissione di fotoni in seguito all’assorbimento di radiazioni

elettromagnetiche può avvenire in un tempo più o meno breve:

Fluorescenza intervallo di tempo tra eccitazione ed

emissione dell’ordine di 10-9 – 10-3 secondi;

Fosforescenza intervallo di tempo tra eccitazione ed

emissione 10-3 secondi.

Nel fenomeno della fluorescenza si distingue una luce

eccitante ed una luce fluorescente, che sono caratteristiche di

ogni molecola fluorescente.

Dall’analisi delle radiazioni capaci di eccitare la fluorescenza

si ricava lo spettro di eccitazione, che è in pratica lo spettro di

assorbimento della sostanza; lo spettro di fluorescenza o di

emissione è l’analisi della luce emessa per fluorescenza.

La fluorescenza si può sfruttare sia per analisi qualitative che

quantitative fluorimetria e spettrofluorimetria.

FLUORIMETRIA

E’ la misura della fluorescenza finalizzata alla determinazione quantitativa di sostanze fluorescenti.

Trova larga applicazione in analisi quantitative perchè è una metodica di elevata sensibilità, che permette di rilevare quantità dell’ordine di un centinaio di pg (in fotometria l’ordine è dei g).

IF = 2,3 I0 l c (1)

IF = intensità della luce fluorescente;

I0 = intensità della luce incidente;

= coefficiente di estinzione molare che assorbe alla ;

l = cammino ottico, in cm;

c = concentrazione, in moli/litro;

= efficienza quantica della sostanza in esame, cioè il rapporto quanti emessi/quanti assorbiti.

La relazione (1) non è valida per soluzioni molto concentrate.

L’efficienza quantica è influenzata dal pH e dalla temperatura: diminuisce all’aumentare della temperatura in quanto aumentano le collisioni tra le molecole e quindi la dispersione dell’energia.

La concentrazione di una sostanza fluorescente può essere facilmente determinata per semplice comparazione dell’intensità della luce fluorescente con l’intensità di fluorescenza di una soluzione a concentrazione nota della stessa sostanza.

A differenza della fotometria nella quale si misura la frazione di potenza radiante che colpisce la fotocellula - cioè il rapporto tra la luce emergente e la luce incidente, I/I0, per ricavare l’assorbanza – in fluorimetria si misura l’intensità assoluta della luce fluorescente, IF. In altri termini in fluorescenza non si fa riferimento a specifici parametri di misura, come trasmissione od assorbanza, e IF viene comunemente espressa in unità arbitrarie.

FLUORIMETRO

Per la determinazione di IF ci si serve di un fluorimetro, le cui componenti essenziali sono:

Una sorgente luminosa stabile che fornisce l’energia eccitante;

Filtri od un monocromatore per selezionare la della luce eccitante;

Una cuvetta per la soluzione in esame;

Una fotocellula od un fotomoltiplicatore che riceve una frazione fissa della luce fluorescente, ed è connessa con un galvanometro molto sensibile, o con un sistema di amplificazione ed un display digitalico.

Il fotomoltiplicatore è in posizione tale da non ricevere le radiazioni della sorgente eccitante che attraversano la soluzione; comunemente è disposto a 90° rispetto alla direzione della luce eccitante.

FLUORIMETRO - SPETTROFLUORIMETRO

Soluzione Standard a concentrazione nota della

sostanza in esame (concentrazione leggermente

maggiore della concentrazione presunta nel campione

in esame). Letture in unità arbitrarie = unità di luce

relativa, RLU.

Soluzione in esame.

Per lo standard, Cn, nota, posta = 100 RLU per IFn;

Per il campione la fluorescenza, IFi, da qui si ricava Ci.

Ci = Cn IFi IFn

Ogni volta si deve calibrare il fluorimetro con lo

standard, perchè in fluorimetria a differenza della

spettrometria per assorbimento, si effettuano misure

assolute di intensità luminosa.

Nelle misure quantitative fluorimetriche si allestiscono due soluzioni standard a diversa concentrazione; si fissa a 100 la scala di registrazione con la soluzione più concentrata, e si verifica la linearità della risposta con la soluzione più diluita.

Si allestisce il bianco, rappresentato dal solvente e da tutte le altre sostanze eventualmente presenti in soluzione, ad eccezione della sostanza in esame.

Infatti in soluzione possono essere presenti: inibitori della fluorescenza, cioè sostanze che attenuano la fluorescenza (quenching della fluorescenza), od assorbono parte della luce eccitante o della luce fluorescente; potenziatori della fluorescenza; impurità fluorescenti; sostanze responsabili di fenomeni di light scattering, per cui parte della luce dispersa può raggiungere la fotocellula sommandosi alla luce fluorescente. Il light scattering può essere individuato in uno spettrofluorimetro.

SPETTROFLUORIMETRO

La spettrofluorimetria è una metodica di analisi

qualitativa altamente sensibile poichè ci permette di

disporrre di due parametri per l’identificazione di una

sostanza: lo spettro di eccitamento e lo spettro di

fluorescenza.

Lo spettrofluorimetro è uno strumento analogo al

fluorimetro, con la sola differenza che due

monocromatori, uno posto subito dopo la sorgente

luminosa ed uno prima del fotomoltiplicatore,

permettono di variare la della luce incidente sulla

soluzione, ed il secondo di analizzare la della luce

fluorescente.

Spettro di eccitamento = spettro di assorbimento

Spettro di fluorescenza = analisi qualitativa della

radiazione luminosa fluorescente.

La spettrofluorimetria come si è detto è una metodica di

elevata specificità: anche se due sostanze fluorescenti

possono mostrare spettri di eccitamento molto simili,

difficilmente avranno eguali spettri di fluorescenza; e

viceversa. Ciò è di particolare interesse per l’analisi

qualitativa.

Fluorimetria e spettrofluorimetria, per l’elevata sensibilità,

trovano applicazione principalmente per la determinazione

quantitativa di sostanze presenti in concentrazioni troppo

basse per essere rilevate con la spettrofotometria. Sono

comunemente usati metodi fluorescenti per il dosaggio di

ioni metallici, vitamine, ormoni, farmaci, pesticidi,

amminoacidi, quest’ultimi come dansil derivati.

E’ possibile ad es. determinare la concentrazione

intracellulare di ioni Ca2+ utilizzando vari chelanti

fluorescenti.

Si possono determinare attività enzimatiche , in

particolare quelle che implicano il NAD come

coenzima, per la fluorescenza della sua forma ridotta, o

che possono essere accoppiate a reazioni che utilizzano

questo coenzima. Altre attività enzimatiche possono

essere facilmente determinate utilizzando substrati

legati a molecole fluorescenti.

Con l’uso di anticorpi od antigeni marcati con molecole

fluorescenti vengono effettuati dosaggi immunologici.

L’analisi di spettri di fluorescenza permette di avere

informazioni sulla struttura di proteine, di catene

polinucleotidiche, di membrane cellulari. Lo spettro di

fluorescenza, sia quello intrinseco, dovuto agli

amminoacidi aromatici o di eventuali coenzimi, che

quello estrinseco, acquisito per aggiunta di derivati

fluoresenti, si modifica in presenza di ligandi fisiologici

o artificiali, e ciò consente anche lo studio di

modificazioni conformazionali delle proteine.

La fluorescenza intrinseca od estrinseca di una proteina può eccitare – mediante trasferimento di energia per risonanza – la fluorescenza di un altro fluoroforo aggiunto, spazialmente vicino; il fenomeno è indicato come FRET, Fluorescence Energy Transfer. Determinando le variazioni della fluorescenza del secondo fluoroforo a secondo che sia eccitato per irradiazionediretta o per FRET, si possono misurare con accuratezza le distanze tra residui amminoacidici e la localizzazione di metalli od altri ligandi.

Trovano largo uso come sonde fluorescenti proteine del tipo della Green Fluorescent Protein, GFP.

FRET

Donor Acceptor Förster Distance

(Nanometers)

Tryptophan Dansyl 2.1

IAEDANS (1) DDPM (2) 2.5 - 2.9

BFP DsRFP 3.1 - 3.3

Dansyl FITC 3.3 - 4.1

Dansyl Octadecylrhodamine 4.3

CFP GFP 4.7 - 4.9

CF (3) Texas Red 5.1

Fluorescein Tetramethylrhodamine 4.9 - 5.5

Cy3 Cy5 >5.0

GFP YFP 5.5 - 5.7

BODIPY FL (4) BODIPY FL (4) 5.7

Rhodamine 6G Malachite Green 6.1

FITC Eosin Thiosemicarbazide 6.1 - 6.4

B-Phycoerythrin Cy5 7.2

Cy5 Cy5.5 >8.0

Förster Critical Distance for common RET Donor-Acceptor Pairs

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluores

cence/fret/fretintro.html

http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-

Probes-The-Handbook/Technical-Notes-and-Product-

Highlights/Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer-FRET.html

CHEMILUMINESCENZA E BIOLUMINESCENZA

Luminescenza: emissioni di radiazioni luminose nel

ritorno di un atomo o di una molecola da un livello

energetico maggiore ad uno minore. La luminescenza

è un processo non accopagnato da apprezzabili

variazioni della temperatura della sostanza ed avviene

attraverso un meccanismo diverso dall’incandescenza.

La luminescenza viene classificata in base allo stimolo che

causa il passaggio dallo stato fontamentale a quello

eccitato:

Fotoluminescenza, cioè fluorescenza, se causata da

radiazioni luminose;

Chemiluminescenza, se causata da reazioni chimiche;

Bioluminescenza, se da reazioni enzimatiche;

Radioluminescenza, se da radiazioni ionizzanti;

Elettroluminescenza, se da campi elettrici;

Termoluminescenza, che viene attivata in certi materiali

solidi in seguito a riscaldamento a temperatura superiore a

quella ambientale per attivazione di uno stimolo latente, e

da non confondere con la fotometria di emissione che

avviene per incandescenza.

La chemiluminescanza ha una bassa efficienza quantica , che non supera 0,1, mentre con la bioluminescanza si possono raggiungere valori fino a 0,9.

Strumentazione: luminometro che non è altro che un fluorimetro nel quale manca la sorgente luminosa, e non necessita di un monocromatore. Può essere usato un comune fotometro senza attivare la sorgente luminosa. E’ chiaro che la reazione va fatta avvenire al buio.

Un’analisi quantitativa basata sulla luminescenza sfrutta una reazione chimica cui può andare incontro la sostanza in esame, generando essa stessa luminescenza, od un prodotto che può essere fatto reagire con una sostanza luminescente.

CHEMILUMINESCENZA

In diverse reazioni di interesse biologico, come quelle

catalizzate dalle ossidasi flaviniche si genera H2O2 che

può essere dosata facendola reagire con il luminol, una

molecola che in seguito ad ossidazione da luogo ad

emissione di luce bluastra di intorno a 430 nm.

Si fa avvenire la reazione in esame nella cuvetta del

luminometro in presenza di una soluzione di luminol, e

dalla quantià di luce misurata, in raffronto con

soluzioni standard di H2O2 fatte reagire nelle stesse

condizioni sperimentali, si risale alla quantità di H2O2

formatosi.

ac. 3-

aminoftalico

L’ossidazione del luminol ad opera di H2O2 può essere

catalizzata dall’emina, prodotto di ossidazione

dell’emoglobina, e viene correntemente sfruttata per la

ricerca di tracce di sangue nelle analisi investigative di

medicina forense. L’esame non necessita di un

luminometro: si tratta di un’analisi qualitativa che può

essere effettuata per reazione diretta sul campione

sospetto, osservando la comparsa della luminescenza

bluastra.

La luminescenza del luminol dura 30 sec e necessita,

per essere rilevata della quasi oscurità.

BIOLUMINESCENZA

Luciferasi: enzima responsabile della luminescenza

di alcuni organismi (1) luciferasi delle lucciole; (2)

luciferasi di alcuni batteri luminosi marini (genere

Photobacterium e Vibrio).

(1) La luciferasi catalizza l’ossidazione della

luciferina, un acido organico complesso presente nelle

lucciole, con emissione di luce fredda ed un efficienza

quantica molto elevata (0,88). Per la reazione è

necessario ATP: si forma prima luciferina-adenilato,

che in presenza di O2 da luogo ad ossiluciferina, CO2,

AMP e produzione di luce. Dall’ossiluciferina si

rigenera poi la luciferina.

In laboratorio luciferina e luciferasi da lucciola, reperibili in

commercio, sono utilizzate per la determinazione quantitativa

dell’ATP. Dall’intesità della luce che si genera si risale alla quantità

di ATP. Si tratta di un metodo altamente sensibile, che permette di

rilevare quantità di ATP dell’ordine delle fmoli.

Il sistema della luciferina luciferasi può ovviamente essere utilizzato

per la determinazione di tutte le attività enzimatiche che

coinvolgono ATP.

La luceferasi di origine batterica catalizza l’ossidazione

di aldeidi alifatiche a lunga catena e del

flavinmononucleotide ridotto, con produzione di luce:

FMNH2 + R-CHO + O2 FMN + R-COOH + H2O + h

La reazione può essere accoppiata ad una

NAD(P)H:FMN ossidoriduttasi, permettendo così il

dosaggio di una serie di metaboliti o di enzimi che

possono dar luogo a coenzimi piridinici ridotti.

Determinazione dell’acido lattico o della lattico

deidrogenasi:

Lattato + NAD+ piruvato + NADH + H+ (1)

NADH + H+ + FMN FMNH2 + NAD+ (2)

FMNH2 + R-CHO + O2 FMN + R-COOH + H2O

+ h (3)

(1) lattico deidrogenasi; (2) ossidoreduttasi; (3)

luciferasi.

BIOLUMINESCENZA

AequorinaAequorina, enzima presente nelle meduse come Aequorea victoria.

Negli organismi marini le proteine implicate nei fenomeni di luminescenza sono sia produttori primari, come l’aequorina, sia fotoproteine secondarie che, illuminate, generano per fenomeni di fluorescenza radiazioni a lunghezza d’onda maggiore.

AEQUOREA VICTORIA

L’aequorina è una proteina di 22 kDa che quando

lega selettivamente gli ioni Ca2+ emette luce blu. E’

stata definita un bioluminescent calcium indicator ed è

stata usata per misurare il calcio intracellulare. Nella

medusa la luce blu può eccitare una fotoproteina

secondaria, anch’essa presente nell’aequorea, la green

fluorescent protein, GFP, che a sua volta emette luce

verde.

La GFP, fortemente fluorescente in ambiente

riducente, è una proteina di 238 aa che presenta due

massimi nello spettro di eccitazione, a 395 e 475 nm,

ed un massimo di emissione a 509 nm.

Aequorina e GFP sono utilizzate nelle tecniche definite

di subcellular imaging.

STRUTTURA DELL’AEQUORINA

AEQUORINA - GFP

AEQUORINA - GFP

GFP

Contains a chromophore consisting of modified amino acid

residues. The chromophore is formed by autocatalytic backbone

condensation between Ser-65 and Gly-67, and oxidation of Tyr-66

to didehydrotyrosine. Maturation of the chromophore requires

nothing other than molecular oxygen.

Con tecniche di ingegneria genetica sono state create

diverse proteine mutanti che hanno fluorescenza di

diversi colori.

Si possono fondere i geni codificanti queste proteine

fluorescenti mutanti con geni per proteine specifiche

del citosol, nucleo, mitocondri, ed ottenere in cellule od

organismi transfettati proteine chimeriche che vanno a

localizzarsi nei rispettivi compartimenti cellulari e

sono riconoscibili al microscopio per la loro

luminescenza o fluorescenza.

PROTEINE FLUORESCENTI