Fondamenti di Fondamenti di spettrofotometriap

Spettroscopia UV/Visp p

SpettroscopiaSpettroscopiaDefinizione: Lo studio della struttura e della dinamicadella materia (in biologia delle molecole) attraversodella materia (in biologia delle molecole) attraverso

l’analisi dell’interazione con la luce

La lunghezza d’onda della luce (quindi la suaenergia) determina il modo in cui questa interagisce

con la materiacon la materia

Serve per:Serve per:Quantificare molecoleIdentificare molecoleAnalizzare cambiamenti dinamici nellacomposizione o nella struttura delle molecole(cinetica di reazioni …)(cinetica di reazioni …)………………………

Proprietà della luceProprietà della luce

La Radiazione Elettromagnetica• Secondo la meccanica quantistica laSecondo la meccanica quantistica la

radiazione elettromagnetica ha una doppia natura Essa possiede le proprietà dinatura. Essa possiede le proprietà di un’onda e di un corpuscolo

NATURA ONDULATORIAlunghezza d’onda (λ)

frequenza (ν) X

ν = c / λ λ

AZY

Parametri di un’onda:Lunghezza d’onda (λ): distanza tra due massimiFrequenza (ν): numero di oscillazioni in 1 secondo (Hz = 1 ciclo/s)nel vuoto c ≅ 3.108 m/s.

F l h d' d INVERSAMENTE PROPORZIONALIFrequenza e lunghezza d'onda sono INVERSAMENTE PROPORZIONALI:

NATURA CORPUSCOLARE

Una radiazione elettromagnetica consiste in “pacchetti discreti” di energia, chiamatiFOTONI l i i di d d ll f d l' iFOTONI, la cui energia dipende dalla frequenza, secondo l'equazione:

E = h . νdove h indica la costante di Planck: h = 6 63 . 10-34 J. sdove h indica la costante di Planck: h 6.63 10 J sL'energia di un fotone viene a volte espressa anche in elettron-volt (1eV=1.6 . 10-19 J).

Quindi: ENERGIA E FREQUENZA SONO DIRETTAMENTEPROPORZIONALI

Questa relazione ci indica l'energia associata a ciascun fotone per ogni fascio difrequenza ν; per cui un fascio di luce è più o meno intenso a seconda che porti più oq ; p p p pmeno fotoni nell'unità di tempo, ma l'energia di ciascun fotone (il quanto di energia), è sempre la stessa per una determinata frequenza della radiazione.

Che accade quando una radiazione colpisce un oggetto?

• L’energia da una sorgente luminosa interagisce con le proteine in diversi modi.

A li ll d i l i i i di l i di l i iù l i•A livello dei legami atomici vediamo la promozione di elettroni a più alti livelli energetici.

•A livello molecolare vediamo assorbimento ed emissione della luce.

•Le transizioni tra livelli energetici non sono limitate agli elettroni; I legami chimici possono andare incontro a una varietà di livelli energetici vibrazionalichimici possono andare incontro a una varietà di livelli energetici vibrazionali e atomi connessi da legami covalenti possono ruotare l’uno rispetto all’altro.

105 microonde10

104

microondeTransizioni rotazionali

104

Infrarosso Transizioni vibrazionali gi

a

103

visibile Transizioni ll’en

er

102ultravioletto

elettroniche

T i i i l tt i h ento

de

10

Transizioni elettroniche

Aum

e

1

Raggi-X Diffrazione

1

•Una transizione avviene quando l’energia di una molecola cambia daUna transizione avviene quando l energia di una molecola cambia da uno stato all’altro.

e•L’assorbimento avviene quando la radiazione causa e e

T i i

un aumento di energia nel sistema con cui interagisce.

e

Transizione•L’emissione avviene

e e

e quando la radiazione è prodotta da un sistema durante una transizione

ee

durante una transizione da un alto livello energetico a uno più bassobasso

si ottiene uno spettro di emissione quando si analizza unfascio di luce emesso in opportune condizioni da unafascio di luce emesso, in opportune condizioni, da unasostanza;

si ottiene uno spettro di assorbimento quando si analizzasi ottiene uno spettro di assorbimento quando si analizzaun fascio di luce dopo che ha attraversato una sostanza.

P t t l tt di i i diPer una stessa sostanza lo spettro di emissione e diassorbimento sono pressappoco come il positivo e ilnegativo di una fotografia nel senso che una radiazionenegativo di una fotografia, nel senso che una radiazionepresente nello spettro di emissione sarà mancante inquello di assorbimento.q

Quando una radiazione passa attraverso uno strato di sostanza solida, liquida o gassosa, alcuneQ p , q g ,frequenze possono essere rimosse selettivamente mediante assorbimento, cioè un processo in cuil’en. elettromagnetica viene trasferita agli atomi, ioni o molecole che costituiscono il campione.L’assorbimento di radiazione promuove queste particelle dal loro stato normale (fondamentale) atemperatura ambiente a uno o più stati eccitati ad energia più alta.Secondo la teoria quantistica, gli atomi, le molecole o gli ionipossiedono soltanto un numero limitato di livelli energetici

Stato eccitato (E )discreti; perché si abbia assorbimento della radiazione, l’energiadel fotone eccitante deve essere esattamente uguale alladifferenza di energia fra lo stato fondamentale ed uno degli

Stato eccitato (E1)

ΔE = hνstati eccitati della specie assorbente. Su questo principio sibasano sia la spettroscopia di assorbimento sia quella diemissione.

tt i di ASSORBIMENTO d t i l l

Stato fondamentale (E0)

• spettroscopia di ASSORBIMENTO: quando atomi o molecolevengono eccitati e passano a stati energetici maggiori• spettroscopia di EMISSIONE: dagli stati eccitati, ritornandoallo stato fondamentale le particelle riemettono energia sottoallo stato fondamentale, le particelle riemettono energia sottoforma di radiazioni elettromagnetiche (hν)

Spettro di assorbimentoSpettro di assorbimento

Gli elettroni sono distribuiti su diversi livelli energetici,ma tendono ad occupare i livelli energetici più bassi (stato f d l )fondamentale)Quando viene ceduta energia la sistema gli elettroni possono passare ad un livello energetico superiore (stato eccitato)possono passare ad un livello energetico superiore (stato eccitato)

Se l’energia deriva da una radiazione elettromagnetica, si avrà unog gspettro di assorbimento.

Vi bit l l tità di i i l t llViene assorbita solo la quantità di energia equivalente alla differenza tra i diversi livelli energetici, in accordo con leregole della meccanica quantistica La grandezza assoluta di ogniregole della meccanica quantistica. La grandezza assoluta di ogni quanto sarà diversa a seconda dei livelli energetici coinvolti

Stato fondamentaleStato fondamentale

Lo stato a più bassa energia possibile in un sistema fisico in termini di particelle elementari. E’ anche chiamato stato basale. Gli elettroni si trovano sugli orbitali a più bassa energia

Stato eccitato

Un livello energetico più alto di quello basale. GliUn livello energetico più alto di quello basale. Gli elettroni passano su orbitali ad energia più alta.

Spettro di assorbimentoSpettro di assorbimento

• Quando la luce colpisce un campione, le le lunghezze d’onda con energia idonea a g gpromuovere il salto degli elettroni dallo stato basale a quello eccitato sonostato basale a quello eccitato sono rimosse dallo spettro trasmesso

Energia delle radiazionigNella tecnica UV-vis si impiegano radiazioni nell’intervallo 200-800 nm, la cuienergia è sufficiente ad attivare transizioni elettroniche, che causano il passaggiog , p ggdi elettroni degli strati esterni a stati eccitati

UV (Ultravioletto) ⇒ 200-400 nm (lontano UV)

Visibile 400 800 nmVisibile ⇒ 400-800 nm

EnergiaEnergia

la radiazione visibile rappresenta solo una piccola parte dello spettrola radiazione visibile rappresenta solo una piccola parte dello spettroelettromagnetico:

Alle diverse radiazioni visibili che differiscono per la loro lunghezza d’onda(quindi per la loro diversa frequenza ed energia) corrispondono i diversi colori.

Colori della luce visibileCo o de a uce s b eLunghezza d’onda Assorbita Osservata380 420 violet green yellow380-420 violet green-yellow420-440 violet-blue yellow440 470 blue orange440-470 blue orange470-500 blue-green red500 520 l500-520 green purple520-550 yellow-green violet550 580 ll i l t bl550-580 yellow violet-blue580-620 orange blue620 680 d bl620-680 red blue-green680-780 purple green

Applicazioni degli spettri di assorbimento

•Misure Quantitative –determinazione di concentrazioni.

•Calcoli di velocità di reazioni

• Studi strutturali – folding, assemblaggio, denaturazione, cambiamenti di struttura, legame di ligandi, g g

•Enzimatici. Ad es. Analisi degli intermedi delle reazioni

•Identificatione di composti (vitamine, ormoni). Utile per identificare proteine con cromofori particolari

•Studi immunologici.– tramite kit commerciali

I cromofori nelle proteineI cromofori nelle proteine

The peptide bond

Chromophores in proteinsChromophores in proteinsthe important chromophores to remember are:p p

λmax(nm) ε(M-1cm-1)backbone: 195backbone: 195

220tryptophan: 280 5600tryptophan: 280 5600

219 47000tyrosine: 274 1400

both these both these peaks are peaks are very usefulvery usefultyrosine: 274 1400

222 8000193 48000

very usefulvery useful

193 48000phenylalanine: 257 200

206 9300206 9300188 60000

EmoglobinaEmoglobina

Hemoglobin (lysed blood)

20

25

15

20

)

Hemoglobin (lysed blood)

10

ua(c

m-1

)

5

0300 350 400 450 500 550 600 650

Wavelength (nm)

Cosa determina l’assorbanza di un cromoforo?

•I cromofori sono di solito caratterizzati da doppi legami e sistemi di risonanza•Lo spettro di assorbimento di un cromoforo è solo parzialmente determinato dalla sua natura chimica •L’ambiente del cromoforo influenza le proprietà dello spettro

pH• polarità del solvente• Effetti di orientamento

•I cromofori possono agire da molecole reporter che possono dare informazioni circa il loro ambientecirca il loro ambiente .

•Effetti di protonazione/deprotonazione dovuti a cambiamenti di pH o effetti di ossidazione/riduzione influenzano la distribuzione elettronica dei cromofori

• polarità del solvente. Gli spettri cambiano in differenti solventi.

• Effetti di orientamento derivano da molecole di cromofori vicini.. E.g. hyperchromicity degli acidi nucleicihyperchromicity degli acidi nucleici.

Un’estesa coniugazione ha un grande Un’estesa coniugazione ha un grande effetto sulla effetto sulla λλmaxmax; lo spostamento sarà a ; lo spostamento sarà a maxmaxlunghezze d’onda maggiorilunghezze d’onda maggiori

HH

CC CC

HH HH

CC CC

HHHH

HH

1,3-butadiene

CC CC

HH HHCC CC

HH CC CC

HH

CC CCHHHH

λλmaxmax 170 nm170 nm λλmaxmax 217 nm217 nm

HHHH

CC CC HHλλmaxmax 217 nm217 nm

(diene coniugato)(diene coniugato)HH CC CC ( g )( g )

HHHH

HHHH33CC HH

CC CC

HH33CC

HH λλmaxmax 263 nm263 nm

HHHH CC CC

λλmaxmax 263 nm263 nmtriene coniugatotriene coniugato

CC CCHH

HH CHCH33

LicopeneLicopene

È il i tÈ il i t i d l di d l dÈ il pigmento rossoÈ il pigmento rosso--arancio del pomodoroarancio del pomodoro

λλmaxmax 505 nm505 nm

Gli i di bi i i i f i•Gli spettri di assorbimento sono misurati tramite spettrofotometri

Io I

iLight source Monochromator Cuvette

containing Samplep

Detector

MONOCROMATORE

È noto che quando un raggio di luce bianca colpisce un prisma di vetro viene scomposto in

MONOCROMATORE

q gg p p pdiversi colori. Quello che accade è analogo a quanto si osserva nell'arcobaleno o guardandoobliquamente la superficie di un CD.

La scomposizione (dispersione) in diversi coloriLa scomposizione (dispersione) in diversi coloritramite un prisma si spiega in quanto:• la luce “bianca” è in realtà un miscuglio diradiazioni di diversa frequenza e quindiq qcorrispondenti a tutti i colori;• quando un raggio di luce passa da un mezzo adun altro viene deviato (fenomeno detto“rifrazione”): l'entità della deviazione dipende dallarifrazione ): l entità della deviazione dipende dallalunghezza d'onda del raggio incidente.

Una radiazione di un solo colore ottenuta tramite dispersione, caratterizzata da una benprecisa lunghezza d'onda e frequenza, viene detta fascio di luce MONOCROMATICA.Si parla invece di fascio di luce POLICROMATICA quando esso è costituito da radiazioni difrequenza e lunghezza d'onda diverse. La luce bianca proveniente dal sole è policromatica.Per sapere se un fascio di luce è monocromatico o policromatico è sufficiente farlo passarePer sapere se un fascio di luce è monocromatico o policromatico è sufficiente farlo passareattraverso un prisma: se il raggio rimane unico si può dire che è monocromatico; se inveceè policromatico, viene scomposto in diversi raggi.

Aspetti sperimentaliAspetti sperimentali

Schema di uno spettrofotometro a doppio raggio

Spettrofotometro a doppio raggioSpettrofotometro a doppio raggio

Aspetti sperimentaliAspetti sperimentali

MONOCROMATOREECCITAZIONE

λEXCEXCSORGENTE

ATO

RE

Schema a blocchi di uno

NO

CR

OM

A

ISS

ION

E

λ EM

Schema a blocchi di uno spettrofluorimetro

MO

EM

RIVELATORE (TUBO FOTOMOLTIPLICATORE)

T=I/I0

A=log1/T = log I0/I

A = ελcd

La legge di Lambert-BeerA = ελcd

Path length / cm 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 %T 100 50 25 12.5 6.25 3.125

Absorbance 0 0 3 0 6 0 9 1 2 1 5Absorbance 0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5

c

La legge di Lambert-BeerA = ελcd

Dipendenza dalla profondità, d

Assorbimento

0.82

Sorgente di luce

Rivelatore

La legge di Lambert-BeerA = ελcd

Dipendenza dalla profondità, d

0.62

Sorgente luminosab

Rivelatore Campione

La legge di Lambert-Beer A = ελcd

Dipendenza dalla profondità, d

Assorbimento

0.42

Sorgente

Rivelatore campioni

La legge di Lambert-BeerA = ελcd

Dipendenza dalla profondità, d

Assorbanza

0.22

Sorgente

Rivelatore Campioni

La legge di Lambert-BeerA = ελcd

Dipendenza dalla concentrazione, c

Assorbanza

0.82

Sorgente

Rivelatore

La legge di Lambert-BeerA = ελcd

Dipendenza dalla concentrazione, c

Assorbanza

0.62

Sorgenteb

Rivelatore Campione

La legge di Lambert-BeerA = ελcd

Dipendenza dalla concentrazione, c

Assorbanza

0.42

Sorgenteb

Rivelatore campione

La legge di Lambert-BeerA = ελcd

Dipendenza dalla lunghezza d’onda, λ

Assorbanza

0.82

Sorgente

Rivelatore

La legge di Lambert-BeerA = ελcd

Dipendenza dalla lunghezza d’onda, λ

Assorbanza

0.30

Sorgenteb

Rivelatore

La legge di Lambert-BeerA = ελcd

Dipendenza dalla lunghezza d’onda, λ

Assorbanza

0.80

Sorgenteb

Rivelatore

La legge di Lambert-BeerA = ελcd

Dipendenza dalla lunghezza d’onda, λ

Assorbanza

0.35

Sorgenteb

Rivelatore

Determinazione dei coefficienti di ti i lestinzione molare

Ι l i di d ll t i ti ti ll Ι valori di ε delle proteine possono essre stimati sulla base della composizione aminoacidica

(280 ) # f T ’ 5500 ε(280nm) = # of Trp’s x 5500 +# of Tyr’s x 1490 +# f di lfid 125 ( S S )# of disulfides x 125 (-S-S-)

predizioni:phttp://ca.expasy.org/tools/protparam.html

I valori teorici di ε sono accurati100000m

-1)

75000(M-1

c

50000

men

tal

25000

peri

m

00 50000 100000

ε ex

ε predicted (M-1cm-1)

PeròPerò…

• NADH libero o legato ha assorbimenti (ε) diversi(ε) diversi

• Si può “titolare” il sito dell’enzima i d ΔAmisurando ΔA

Spettri differenziali e perturbazioni del solvente

Cambiamenti nella lunghezza d’onda della banda di assorbimento possono essere indicativi di cambiamenti nella struttura.

L’uso di denaturanti o diversi solventi può essere utile per ottenereL uso di denaturanti o diversi solventi può essere utile per ottenere informazioni sulla struttura della proteina, e studiare i suoi cambiamenti conformazionali

Spettroscopia differenzialeSpettroscopia differenziale

GlycerolGlycerol

EDMSO

sucroseDMSOA

orE

λλ

Protein

nativaA

orE Urea

A29

2

temp30 40 50 60

λ •Spettri di proteine native o denaturate possono essere usati per studiare le cinetiche distudiare le cinetiche di denaturazione/rinaturazione0.01M

NaCl

•La stabilità delle proteine in diversi tamponi può essere studiata in diversi

A29

2 0.1M NaCl

NaCl

tamponi può essere studiata in diversi tamponi misurando il suo unfolding in funzione della temperatura

30 40 50 60temp

30 40 50 60

• Se il prodotto di una reazione è un cromoforo è possibile usare laSe il prodotto di una reazione è un cromoforo, è possibile usare la spettroscopia di assorbimento elettronico per studiare la cinetica enzimatica

A

tempo

pH 6OH O-

pH 6

CH2

pH 13 A

CH2

CH NH3+

CH2

CH NH2

250 270 290 310 330λ

250 270 290 310 330

• Effetti di protonazione deprotonazione• Effetti di protonazione deprotonazione

12 3

4 baα

ββ

N

Cm

NFe

5

678

NN

N N

67

c

d

OO

O O O

Denaturazione del DNADenaturazione del DNA

• È possibile seguire la denaturazione del DNA a 260 nm.

• Basi accoppiate ed impilate assorbono meno nell’UV di quelle• Basi accoppiate ed impilate assorbono meno nell UV di quelle“separate” - effetto ipercromico.

• La temperatura corrispondente a metà dell’aumento• La temperatura corrispondente a metà dell aumentoosservato nell’A260 è definita come “temperatura di melting”,Tm o temperatura di fusione del DNA.m p

• Il valore di Tm varia con il rapporto GC/AT - un maggiorcontenuto di GC conduce ad una Tm più alta.m p

• Una maggior forza ionica fa aumentare Tm, limitando larepulsione elettrostatica tra fosfatip

“Melting” del DNA:gAssorbanza relativa a 260 nm

• DNA doppio filamento 1.00pp

• DNA singolo filamento 1.37g

• Basi libere 1.67

Denaturazione del DNADenaturazione del DNA

Lodish

Temperatura diTemperatura di melting:

dipendenza dalladalla

composizione

Caratteristiche dei metodi analitici

• Intervallo analitico: campo in cui il metodo èapplicabile senza modificheapplicabile senza modifiche

• Sensibilità: capacità del metodo di deter-minare piccole quantità

• Limite di rivelabilità: minima osservazioneLimite di rivelabilità: minima osservazionedistinguibile statisticamente

S ifi ità ( l tti ità) ità di d t• Specificità (o selettività): capacità di deter-minare solamente il componente da misurare.E’ legata alla accuratezza

• Interferenza: effetto di un componente (che• Interferenza: effetto di un componente (che può non produrre lettura) sulla accuratezza di

’misura dell’analita• Precisione: concordanza tra misure ripetute:Precisione: concordanza tra misure ripetute:

esprime la dispersione delle misure attorno alla media; è correlata alla deviazionealla media; è correlata alla deviazione standard

• Accuratezza: concordanza tra il valore trovato e il valore “vero”; dipende da errori sistematici; p

Costruzione di curve di taratura

• La sensibilità è massima al picco di estinzione del fcromoforo

• A volte si preferisce un picco più “specifico”• Il “bianco” deve contenere tutti i reagenti, tranne la

sostanza da determinare• Occorrono possibilmente cinque punti, misurati in

doppiodoppio• Non si deve estrapolare la curva oltre il valore più

alto determinatoalto determinato

SommarioLa spettroscopia di assorbimento nel U.V/visibile absorption 210 – 900 nm.

L’energia luminosa promuove il trasferimento di elettroni dalo stato basale ad uno eccitato. g pQuesto avviene grazie a gruppi detti cromofori

•I cromofori delle proteine includono gli aminoacidi aromatici (Phe, Tyr, Trp), il legame peptidico, gruppi prostetici o cofattori (metalli). I cromofori sono caratterizzati da elettrini delocalizzati.

•Le frequenze a cui la luce è aasorbita sono influenzate dalla struttura e dall’ambiente del cromoforo.

• La spettroscopia di assorbimento ha diverse applicazioni

Problema n.1Il citocromo c è caratterizzato dai seguenti

coefficienti di estinzione molore:28500 96300 l 1 1ε280= 28500 e ε415= 96300 mol-1cm-1.

Una soluzione di citocromo c in una cuvetta da 1 ml assorbe 0.17 a 280 nm eda 1 ml assorbe 0.17 a 280 nm e

0.4 a 415 nm.

Calcolare la concentrazione della proteina

Perchè i valori ottenuti utilizzando i duePerchè i valori ottenuti utilizzando i due coefficienti non sono uguali?

Se il citocromo c pesa 12300 dalton, quanti mg sono presenti in 1 ml?

Problema n 2Problema n.2

• Trovare la concentrazione di NAD e NADH in una soluzione miscelata basandosi sui seguenti dati ottenuti in una cuvetta da 1 cm,

• I coefficienti di estinzione molare a 260 nm sono 1.5 x 10-4 per il NADH e 1.84 x 10-4 per il NAD. A 340 nm solo il NADH assorbe con ε di 6.22 x 10-3.

• La soluzione miscelata da assorbanze di 1.36La soluzione miscelata da assorbanze di 1.36 e 0,382 a 260 e 340 nm, rispettivamente.