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Nel mondo delle molecole con la “macchina dell’ invisibile” di Stefano Antoniutti Identificare le molecole con l’NMR, la risonanza magnetica nucleare La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare è un metodo analitico ampiamente utilizzato nel laboratorio chimico, poiché permette di caratterizzare la maggior parte delle molecole organiche, basandosi sulle proprietà magnetiche dei nuclei di alcuni atomi - tra i quali l’idrogeno-1, il fluoro-19 e fosforo-31 - e isotopi in tracce - come il carbonio-13, l’ossigeno-17, l’azoto-15 - in esse naturalmente contenuti. 10

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Nel mondo delle molecole con la“macchina dell’ invisibile”di Stefano Antoniutti

Identificare le molecole con l’NMR,la risonanza magnetica nucleare

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare è un metodo analitico ampiamente utilizzato nel laboratorio chimico, poiché permette di caratterizzare la maggior parte delle molecole organiche, basandosi sulle proprietà magnetiche dei nuclei di alcuni atomi - tra i quali l’idrogeno-1, il fluoro-19 e fosforo-31 - e isotopi in tracce - come il carbonio-13, l’ossigeno-17, l’azoto-15 - in esse naturalmente contenuti.

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“Le molecole sono spiacevolmente piccole, e non possiamo vederle direttamente; per conoscerle abbiamo perciò bisogno di spie, capaci di raccogliere informazioni sulla loro struttura, i loro movimenti e le loro reazioni senza alterarne le proprietà, e tanto versatili da poter osservare vari tipi di molecole in svariate situazioni: queste spie sono i nuclei atomici, e la dote che li rende spie così efficienti è il loro magnetismo”.

In questo articolo vogliamo solamente in-trodurre i fondamenti e le potenzialità di questo metodo analitico, nel numero suc-cessivo di “Green” presenteremo maggiori dettagli. La spettroscopia NMR nasce nel 1945 negli Usa, poco dopo lo sviluppo del-la tecnologia radar, durante la quale i ricer-catori impararono ad usare un particolare range di frequenze della radiazione elettro-magnetica che va dal megahertz (MHz, 106 Hz, corrispondente a lunghezze d’onda, λ, di circa 10-100 m) al centinaio di gigahertz (GHz, 109 Hz, dove λ si aggira attorno ai 3-4 cm). Una siffatta variazione nel-le frequenze utilizzabili riflette le diverse applicazioni del radar, da quelli a lungo raggio con capaci-tà di penetrare nel suolo, che operano attorno ai 30-300 MHz, fino a quelli dei sistemi di guida di veicoli automatiz-zati e quelli usati per le previsioni meteorologiche, che operano a frequenze intorno ai 100 GHz. Molti di voi conosceranno quest’ultima applicazione del radar, sfrut-tata per verificare la probabilità dell’arrivo della pioggia durante le gare di Formula 1, di Moto GP e di altri sport motoristici e non.Come si evidenzia dallo spettro a pagina seguente, le frequenze usate per l’NMR si trovano nelle bande contigue delle onde ra-dio e delle microonde, che tutti noi usiamo a casa per ascoltare la musica o per cucinare i cibi. Come dice il nome stesso, trattandosi di spettrometria, nell’NMR un cam-pione contenente

Così descrive la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (RMN), più nota for-se come spettroscopia NMR (dall’inglese Nuclear Magnetic Resonance), il professor Ray Freeman (Università di Cambridge, UK), il quale pur essendo da qualche anno in pensione continua ad occuparsi attiva-mente di NMR. Perché? Uno dei motivi principali per molti degli “ennemmeristi” è semplicemente che con questa tecnica “ci si diverte”. È utilizzabile per molte mole-cole e alcune sue derivazioni possono es-sere usate anche per lo studio di biomole-cole assai complesse come le proteine, un tema di ricerca a cui si è dedicato per lungo tempo Kurt Wüthrich, premio Nobel per la chimica nel 2002, intervistato su questo numero di Green (pag. 4 e segg.).

SUMMARY

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy is a powerful analytical method widely used in chemical laboratories. It provides characterization of most organic molecules, based on the magnetic properties of the nuclei of certain atoms, such as hydrogen-1, fluorine-19 and phosphorous-31 and trace isotopes, like carbon-13, oxygen-17 and nitrogen-15 naturally present in the molecules under investigation.

In this introductory article we report about the principles and the potential of such a technique, detailed information will be provided in the forthcoming issue of our magazine.

Nella pagina precedente, particolare del contenitore schermato che ospita il magnete superconduttore di un NMR 300 MHz. Per mantenere le sue caratteristiche quest’ultimo deve essere raffreddato a temperature molto basse: è circondato da una prima camicia di elio liquido all’esterno della quale se ne trova un’altra di azoto liquido. Il campione viene inserito dall’alto e viene trasportato automaticamente nel sensore che si trova in basso sotto la campana. (Immagine: Fulvio Zecchini).

Radar della Nasa di recente installazione dedicato al controllo della rotta dei voli spaziali; ha un disco di circa 15 m di diametro e opera nella banda di frequenza C (4-8 GHz).(Immagine: Nasa).

Nel mondo delle molecole La “macchina dell’invisibile”

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una molecola ignota viene bersagliato da una radiazione elettromagnetica (di solito dell’ordine delle centinaia di megahertz, variabile da 30 a 900 MHz) e viene poi misurato un effetto dell’interazione tra materia e radiazione, in questo caso la/le frequenza/e di risonanza che esso emette in risposta alla sollecitazione. Discutere-mo meglio di questo più avanti e vedremo come i risultati delle indagini all’NMR si esprimano in ppm, cioè in parti per milio-ne, perché lo sviluppo di questa tecnica analitica fu possibile solo quando la risolu-zione dello strumento permise di discerne-re lunghezze d’onda che differivano tra di loro di meno di un milionesimo; in pratica è come se si dovesse misurare con precisio-ne al millimetro una distanza tra due luoghi con ordine di grandezza del chilometro.Nei 20-25 anni successivi questa tecnica e la strumentazione ad essa dedicata si dif-fonde a macchia d’olio nel campo della chimica e diventa un sostegno insostitui-bile per la identificazione e lo studio del-la struttura delle molecole, ma non solo. Alla fine degli anni Sessanta la tecnica è assolutamente matura, al punto che alcuni studiosi, non prevedendone alcun ulteriore sviluppo, preferiscono spostarsi in altri set-tori ritenendoli più promettenti. Niente di meno lungimirante: dall’inizio degli anni Settanta del secolo scorso si verifica una vera e propria esplosione delle applicazioni dell’NMR, grazie alla combinazione con i computer moderni e con la tecnologia digi-tale. Ciò ha permesso non solo l’espansio-ne con progressione esponenziale di questa tecnica nel campo chimico, ma anche in settori completamente nuovi e imprevedi-bili. Al giorno d’oggi le applicazioni vanno dalle analisi dei materiali alle indagini me-diche, nelle quali la risonanza magnetica nucleare può brillantemente sostituire la tomografia assiale computerizzata (TAC), evitando di esporre i pazienti ai dannosi raggi X. Possiamo inoltre prevedere che questa tecnologia troverà ulteriori e impor-tanti impieghi in futuro.Torniamo però al settore della chimica

analitica che rappresenta il nostro interesse principale. L’introduzione all’inizio degli anni Settanta della cosiddetta tecnica “a impulsi” o “a trasformata di Fourier” (FT-NMR) ha permesso di estendere l’utilizzo dell’NMR a molti nuclei di elementi diver-si, mentre originariamente si sfruttava pra-ticamente solo il protone, cioè l’atomo di idrogeno (1H). Ciò ha portato allo sviluppo di tecniche d’indagine sempre più com-plesse e potenti, al punto di permettere di “risolvere” la struttura tridimensionale di molecole estremamente complesse come le proteine, direttamente in soluzione, di cui si parla nella già citata intervista al premio Nobel Kurt Wüthrich.Pur essendo complessi alcuni aspetti del fenomeno e delle tecniche che lo sfruttano, essendo legati ad aspetti talvolta poco intu-itivi della meccanica quantistica, i principi e i meccanismi di base sono molto più sem-plici e comprensibili.Sgombriamo subito il campo da un possi-bile equivoco: l’appellativo “nucleare” non ha nulla a che fare con l’energia nucleare, con le reazioni nucleari o con la radioat-tività, ma indica solo la sede del fenome-no che avviene, appunto, nel nucleo degli atomi, che come sappiamo è composto da neutroni e protoni. In molti di questi, il nu-cleo risulta possedere un momento angola-re di spin (di solito indicato dalla lettera s), derivante dalla somma degli spin dei sin-goli protoni e neutroni (p ed n, ognuno ha s = 1/2), a cui invariabilmente si associa un momento magnetico (di solito indicato dal-la lettera greca μ, mu). Quest’ultimo misu-ra l’intensità del magnetismo di un dipolo (espressa nel SI in joule diviso tesla, J T-1).A seconda dei casi, si possono avere varie possibilità: lo spin nucleare può valere 0 (zero), se p ed n sono entrambi pari, op-pure un intero come 1, 2, 3 ecc., se sono entrambi dispari, o, ancora, una frazione come 1/2, 3/2, 5/2, se alcuni sono pari e altri dispari. Nella tabella che segue vedia-mo i valori di spin di alcuni nuclei, tra cui quelli più usati per l’NMR.

Spettro della radiazione elettromagnetica e ampiezza approssimativa della banda

di frequenze utilizzabili per la spettrometria NMR,

si tratta di una zona a cavallo tra le onde radio FM

e le microonde (30-900 MHz ca.)

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Nel mondo delle molecole La “macchina dell’invisibile”

Se lo spin è diverso da 0, il nucleo avrà un momento magnetico: in altre parole, ogni nucleo dotato di spin si comporterà come una microscopica bussola, con il suo nord e il suo sud. In assenza di campo magneti-co, ogni sua direzione sarà permessa, ma in presenza di un campo magnetico, come per una bussola nel campo magnetico terrestre, tutto cambia e si ha un orientamento secon-do le linee del campo. Riflettendoci oggi, dobbiamo dire che gli “ennemeristi” sono stati molto fortunati: il caso più semplice (s = 1/2) è proprio quello dell’idrogeno 1H, quasi sempre presente nelle molecole orga-

niche, il nucleo più sensibile della tavola periodica all’influenza del campo magne-tico. In questo caso, come per l’ago di una bussola, in un campo magnetico solo due orientazioni sono possibili, come vediamo nella figura qui sotto.Come per l’ago della bussola, l’orienta-zione parallela al campo è quella stabile, mentre quella antiparallela è la più insta-bile, esse corrispondono rispettivamente ad un contenuto energetico minore e mag-giore. Più intenso è il campo magnetico applicato, maggiore risulta la differenza di energia, associata ai due diversi stati, come rappresentato qui sotto.Si tratta di differenze decisamente piccole, per 1H immerso in un campo magnetico di 7,05 T (tesla, unità di misura derivata del SI utilizzata per esprimere la densità del flusso magnetico o l’induzione magnetica; 1 T = 1 V s m-2) δ vale circa 11,98 x 10-5 kilojoule per mole (kJ mol-1). Irradiando quindi il campione in analisi con una radia-zione elettromagnetica di pari energia, que-sta sarà assorbita dalle molecole, si inverti-rà l’orientazione degli spin dei nuclei degli atomi di H, e lo strumento NMR registrerà un segnale. Si tratta della cosiddetta “con-dizione di risonanza” in cui viene emessa una radiazione elettromagnetica in risposta all’eccitazione che si troverà nella banda delle onde radio, tipicamente attorno alle

VALORE DI SPIN NUCLEARE

DI ALCUNI ATOMI E ISOTOPI*

* quelli potenzialmente utilizzabili per l’NMR hanno spin diverso da zero.

Valore di spin Atomo/isotopo

s = 0 12C, 16O

s = 1/2 1H, 13C, 31P, 19F, 29Si, 15N

s = 1 2H (o deuterio, D), 14N

s = 3/2 11B, 23Na, 35Cl, 37Cl

s = 5/2 17O, 27Al

s = 3 10B

Nuclei di idrogeno in assenza (sinistra) e in presenza di campo magnetico (vettore B0)

Energia associata ai vari stati di spin (Immagine: per gentile concessione di Mauro Tonellato, www.pianetachimica.it )

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centinaia di megahertz, tanto che in gergo gli strumenti non vengono caratterizzati dai Tesla (il B0) del magnete che possiedo-no, che in genere ha natura di supercondut-tore (vedi “Green” n. 16, pag. 16), ma dalla frequenza di risonanza dell’1H, che negli strumenti moderni varia solitamente tra i 300 e gli 800-900 MHz.In realtà sarà un segnale estremamente debole, perché solo un irrisorio numero di nuclei in eccesso occuperà lo stato ener-geticamente più favorevole (5 su 200mila a 7,05 T, 300 MHz), anche se questo sarà sempre maggiore al crescere del campo B0, purtroppo per gli “ennemeristi” ciò com-porta che per creare campi sufficientemen-te potenti servono strumenti che sono e, probabilmente, saranno, sempre complessi e costosi (nell’ordine delle centinaia di mi-gliaia di euro!).Non entriamo qui nei complessi dettagli della realizzazione degli esperimenti e del-le misurazioni all’NMR, li vedremo sul prossimo numero della nostra rivista. Ci basterà qui fare qualche esempio di spet-

Per l’analisi all’NMR il campione ignoto (la polvere

scura nella fialetta) deve essere sciolto in soluzione con un

opportuno solvente (in questo caso cloruro di metilene) e posto in appositi tubi di

vetro che poi vengono inseriti nello strumento assieme ad un

particolare supporto e alloggiati automaticamente nel sensore grazie ad un cuscino ad aria.

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Nel mondo delle molecole La “macchina dell’invisibile”

tri NMR usando il nucleo 1H (vedi figura a lato) che caratterizza specifiche molecole, lo strumento li rappresenta in un grafico con l’intensità del segnale sulle ordinate e con il valore associato ai picchi sulle ascis-se. Come anticipato prima, questo valore esprime in ppm (o δ, delta) la differenza di frequenza tra la radiazione standard ot-tenuta da una molecola di riferimento - a tal scopo per le analisi 1H viene spesso usa-to il tetrametil silano (TMS), Si(CH3)4 - e quella/e di risonanza emessa/e in risposta dalla molecola in esame. Tale valore viene diviso per la prima delle due frequenze in modo da normalizzare il risultato, che ri-sulta così adimensionale per far sì che esso sia uguale in ogni tipo di strumento NMR, indipendentemente dalla frequenza fonda-mentale a cui funziona. Se quest’ultima va-lesse 100 MHz, sarebbe comune avere un valore di risonanza di 100 Hz, un risultato pari quindi ad una parte per milione (ppm).Qui a lato potete vedere gli spettri di quat-tro semplici molecole dove posizione e “forma” dei segnali variano tra loro. Il confronto tra lo spettro dell’1-bromoetano e quello dell’etano evidenzia come anche piccole differenze nella molecola hanno effetti significativi sullo spettro NMR. Vedremo sul prossimo numero perché ciò avviene e come lo si possa sfruttare per ca-ratterizzare i composti, se siete interessati restate “sintonizzati su Green”.

Stefano AntoniuttiDipartimento di Chimica

Università Ca’ Foscari VeneziaAlcuni esempi esemplificativi di spettri NMR 1H. La taratura si esegue sul picco del tetrametil silano (TMS), Si(CH3)4, cui viene attribuito valore 0, zero. In prima approssimazione possiamo affermare che la posizione e la “struttura” dei picchi sull’asse x dipendono dalla simmetria molecolare e dalla densità elettronica degli atomi contenuti nelle molecole.

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