Fattori genetici di resistenza/suscettibilitàalla scrapie nella capra · Resistenza genetica alle...

Resistenza genetica alle malattie negli animali da reddito: presente e futuro

Fattori genetici di Fattori genetici di resistenza/suscettibilitresistenza/suscettibilitàà alla scrapie alla scrapie

nella capranella capra

Simone Peletto

Torino – 16 maggio 2013

La suscettibilità alla TSE è influenzata dai polimorfismi del gene PRNP

Polimorfismo: presenza di diverse forme (alleli) di uno stesso gene all’interno di una specie o razza

IZSTO

Istituto Zooprofilattico

Sperimentale del Piemonte,

Liguria e Valle d’Aosta

Polimorfismi del gene PRNP

I142MI142M

Associato con un allungamento del periodo di incubazione in capre inoculate con scrapie e BSE e con aumento di resistenza alla scrapie naturale in uno studio caso-controllo francese

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R154HR154H

Associato con moderata protezione nei confronti della scrapie classica in studi caso-controllo in Grecia, Italia, Cipro e Francia.Associato con elevata suscettibilità alla scrapie atipica in uno studio caso-controllo italiano

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R211QR211QAssociato con resistenza in studi caso-controllo francesi e in Spagna

N146S/D N146S/D Associato con resistenza in studi caso-controllo a Cipro

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Q222KQ222KAnalizzati 177 capre di cui 25 positive, da 6 focolai: il polimorfismo K222 è risultato statisticamente associato ai controlli, assente in tutti i casi (P-value: 0.029)

La Lisina al codone 222 sembra quindi agire quale fattore di resistenza verso la scrapie classica

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Stessa associazione trovata da:

• Vaccari in Italia

• Barillet e Corbiere in Francia

• Bouzalas in Grecia

• Indagare l’effetto del polimorfismo al codone 222 sulla suscettibilità alla scrapie classica nella capra tramite infezione sperimentale

• Studio della sintomatologia clinica e della distribuzione della PrPSc nell’organismo nella scrapie classica

Scopo del lavoroScopo del lavoro

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Materiali e MetodiMateriali e Metodi

• Selezione dei soggetti con genotipo adeguato per le prove di infezione sperimentale (10 caprini di cui 5 di genotipo 222 Q/Q e 5 222 Q/K).

Scrapie classica i.c. (0.5 ml)

Q/Q Q/K

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• Gli animali sono stati trasportati allo stabulario dell’IZS di Brescia, in cui sono state condotte le prove sperimentali, ed inoculati a 5 mesi di età.

• Registrazione dei segni clinici giornaliera, visita clinica mensile

• Esame autoptico sugli animali deceduti e prelievo di campioni di tessuto.

• Diagnosi di scrapie mediante test rapido (TeSeE Sheep and goat; BIORAD) esame istologico, immunoistochimico e Wb

Materiali e MetodiMateriali e Metodi

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RisultatiRisultati

GenotipoGenotipo Animali Animali decedutideceduti

Animali Animali positivipositivi

Tempo medio di Tempo medio di sopravvivenzasopravvivenza

Durata Durata sintomisintomi

222Q/Q222Q/Q 5/55/5 5/55/5 569 giorni569 giorni 33--20 20 giornigiorni

222Q/K222Q/K 1/51/5 0/50/5 1458 giorni1458 giorni ------

IZSTO




IZSTO




L’analisi statistica ha dimostrato che la probabilità di sopravvivenzadelle capre Q/K 222 versus le capre Q/Q 222 è significativamentemaggiore (χ2= 9.34, p = 0.002).

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

0 500 1000 1500giorni di sopravvivenza

Q/K Q/Q

Curve di sopravvivenza Kaplan-Meier

La prova sperimentale conferma l’associazione di K222 con resistenza

alla scrapie

K222 candidato a costituire il fattore genetico da utilizzare per il controllo

della scrapie caprina

ConclusioniConclusioni

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Elementi necessari per stabilire

l’applicabilità della selezione genetica

• Identificazione di polimorfismi associati a resistenza e valutazione del loro grado di protezione

• Correlazione polimorfismi-ceppi di EST

• Frequenza dei polimorfismi nelle diverse popolazioni e razze

• Possibili effetti sui caratteri produttivi

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Frequenza dei polimorfismi nelle diverse popolazioni e razze

SNPSNP BreedBreedCA CA

(n=84)(n=84)SASA

(n=69)(n=69)RORO

(n=70)(n=70)VAVA

(n=77)(n=77)GAGA

(n=58)(n=58)MAMA

(n=25)(n=25)IOIO

(n=27)(n=27)RMRM

(n=28)(n=28)

I142MI142M 8.98.9(4.6(4.6--13.2)13.2)

7.27.2(2.9(2.9--11.5)11.5)

5.75.7(1.9(1.9--9.5)9.5)

28.228.2(20.9(20.9--35.1)35.1)

2.62.6(0.0(0.0--5.5)5.5)

0.00.0 0.00.0 0.00.0

N146S/DN146S/D 0.00.0 0.00.0 0.00.0 0.00.0 0.00.0 0.00.0 0.00.0 0.00.0

R154HR154H 11.311.3(6.3(6.3--15.7)15.7)

0.00.0 3.63.6(0.5(0.5--6.7)6.7)

0.00.0 11.211.2(5.3(5.3--16.7)16.7)

6.06.0(0.0(0.0--12.6)12.6)

7.47.4(0.0(0.0--14.4)14.4)

5.35.3(0.0(0.0--11.2)11.2)

R211QR211Q 13.713.7(8.7(8.7--19.2)19.2)

10.210.2(5.0(5.0--15.0)15.0)

13.613.6(8.2(8.2--19.8)19.8)

9.69.6(4.9(4.9--14.2)14.2)

0.00.0 0.00.0 0.00.0 0.00.0

Q222KQ222K 2.42.4(0.1(0.1--4.7)4.7)

3.03.0(0.1(0.1--5.8)5.8)

4.34.3(0.9(0.9--7.7)7.7)

1.31.3(0.0(0.0--3.1)3.1)

17.217.2(10.2(10.2--23.8)23.8)

12.012.0(3.0(3.0--21.0)21.0)

7.37.3(0.4(0.4--14.2)14.2)

5.45.4(0.0(0.0--11.3)11.3)

*CA= Camosciata delle Alpi; *CA= Camosciata delle Alpi; SA=SA= SaanenSaanen ; ; RO=RO= RoccaveranoRoccaverano ; ; VA=VA= Valdostana; Valdostana; GA=GA= GarganicaGarganica ; ; MA=MA= Maltese; Maltese; IO=IO= Ionica; Ionica; RM=RM= Red Red MediterraneanMediterranean

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Effetti sui caratteri produttivi?Effetti sui caratteri produttivi?

Un notevole numero di studi e dataset è oggi disponibile per valutare effetti della selezione sui caratteri produttivi nelle pecore, ma non vi sono dati relativi alle capre.

La probabilità che vi siano effetti collaterali associati alla selezione di alcune varianti alleliche nelle capre èconsiderata in generale bassa.

Rimane comunque il rischio di un “effetto fondatore”.

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AIMS:

Provide scientific support for genetic selection to control goatTSEs & mobilize goat sector to implement genetics-basedresistance breeding programs, focusing on three issues:

1) Strengthening scientific data on link between TSE resistance & candidate PrP alleles.

2) Involving goat sector in participating countries to generate a reservoir of resistance allele carriers & recording production trait information.

3) Providing information towards policy makers & goat sectorabout strategies to control TSEs in goat herds at European, national or regional scale.

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Progetto GOAT-TSE-FREE EMIDA National Working Document – Italia

Livello Nazionale

• Obiettivo: identificare becchi resistenti alla scrapie classica nel gruppo di becchi controllato da ASSONAPA e valutarne il possibile impiego come diffusori dell’allele di resistenza.

• Azioni: ASSONAPA produrrà un elenco di becchi da genotipizzare. I campioni verranno inviati a IZSTO che effettuerà l’analisi al codone 222, al fine della ricerca di becchi portatori dell’allele di resistenza K222.

• I risultati ottenuti verranno valutati collegialmente ai fini diindagare la fattibilità di un piano di selezione genetica in Italia.

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Regione Sardegna

Sono stati presi contatti con l’associazione provinciale allevatori (APA) della provincia di Nuoro ed Ogliastra. Nella razza Sarda la frequenza dell’allele K222 è stata stimata intorno al 4%.

• Obiettivo: Esistendo una banca dati delle produzioni, il lavoro sarà principalmente orientato a stabilire correlazioni tra K222 e produzioni.

Regione Sicilia

Sono stati presi contatti con allevatori interessati e con i responsabili regionali Agricoltura. E’ stato fatto un piano di campionamento su razze autoctone, anche se non iscritte ai libri: Maltese, Girgentana, Rossa Mediterranea, Argentata dell’Etna e Messinese.

• Obiettivo: stimare la frequenza dell’allele di resistenza e la variabilità genetica nelle razze siciliane.

• Nuovo gene riportato da Premzl et al. (2003) in zebrafish

• Comprende due esoni, con l’intera open reading frame (ORF)

contenuta nell’esone 2

• Codifica per una proteina di 130-150 aminoacidi (Shadoo)

• Il gene è stato chiamato SPRN (Shadow of Prion Protein)

• Il gene SPRN è stato identificato in pesci (zebrafish, fugu) e

mammiferi

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PRND

PRNP

SPRN

La glicoproteina Shadoo ha proprietàprotettive PrPC-like e mostra livelli ridottinelle infezioni prionicheWatts et al., EMBO J (2007) 26, 4038–4050

Approfondire la variabilità del gene SPRN nella capra e di

effettuare uno studio caso-controllo per individuare

un’eventuale associazione tra mutazioni e

suscettibilità/resistenza alla malattia

Approfondire la variabilità del gene SPRN nella capra e di

effettuare uno studio caso-controllo per individuare

un’eventuale associazione tra mutazioni e

suscettibilità/resistenza alla malattia

Scopo del lavoroScopo del lavoro

Materiali e Metodi• 21 capre scrapie POSITIVE

• 403 controlli NEGATIVI da focolaio

• PCR dell’intera ORF e frammento della 3’UTR

� Analisi statistica:

• Test del chi-quadro

• Analisi multivariata

• Modello di simulazione (Monte Carlo)

gene SPRN

IZSTO




Nella ORF, la maggior parte dei polimorfismi identificati risultano

essere mutazioni sinonime

Nella ORF, la maggior parte dei polimorfismi identificati risultano

essere mutazioni sinonime

Analisi multivariata ha escluso confondenti (età, focolaio).Possibile bias effetto prevalente del gene PRNP

(esclusi 49 controlli 222K, modello di simulazione per allele 154H)

Human precursor miR-149

stem-loop is processed into

two miRNAs, miR-149 and

miR-149*(adapted from the miRBase;

http://microrna.sanger.ac.uk/sequence

s/index.shtml)

L’analisi in silico per la ricerca di siti target di microRNA effettuata con il

programma Patrocles (http://www.patrocles.org) ha predetto multipli siti di

legame putativi per miR-149* in questa regione specifica del gene SPRN

L’analisi in silico per la ricerca di siti target di microRNA effettuata con il

programma Patrocles (http://www.patrocles.org) ha predetto multipli siti di

legame putativi per miR-149* in questa regione specifica del gene SPRN

miR-149 expression levels at various tissues

(www.microrna.org)

Midbrain

Frontal cortex

miR-149* has been demonstrated to be involved in apoptosis inductionin neuroblastoma, Be2C and HeLa cells (Lin et al., 2010)

------------AGCCCCGA-TCGCCC-TCCCCTCCCCTCCCCTCCCC-----ACAGCCAGGAGCCTAGAACAACG sheep ------------AGCCCCGA-TCGCCC-TCCCCTCCCCTCCCTTCCCCTCCCCGCAGCCAGGAGCCTAGAGCAACG goat -----------AGCCCTGA-TCGCCCCTCCCCGCCCCTCCCC----------ACAGCCAGGAGCCTGGAGCAACG oryx ------------AGCCCTGA-TCGCCCCTCCCCGCCCCTCCCC----------ACAGCCAGGAGCCTGGAGCAACG gems ------------GGCCCCGA-TCGCCCCTCCCCTCCCCTGCCC----------ACAGCCAGGAGCCTAGAGCAGTG cattle ------------GGCCCCGA-TCGCCCCTCCCCTCCCCTGCCC----------ACAGCCAGGA lechwe ------------GGCCC-GATT-GCCCCTCCCCTCCCCTGCCC----------ACAGCCACGGGCCTAGAGCAGCG kudu ------------GGCCC-GACT-GCCCCGCCCCTCCCCTCCCCTGCCC-----ACAGCCACGGGCCTAGAGCAGTG nyala TAGAGGCTACCCAGCCCTGA-TCGCCCCTTCCCTCCCCTGCCC----------ACAGCCAGGAGCCTAGA deer ------------GGCCCCGA-TCGCCCCTCCCCTCCCCTGCCC----------ACAGCCAGGAGCCTAGAGCAGTG |--1--||-2-||-3-||-4-||-5-||-6-|

Conservazione evolutiva del sito target putativo nei

ruminanti

Conservazione evolutiva del sito target putativo nei

ruminanti

Associazione confermata anche in uno studio in UK

Associazione confermata anche in uno studio in UK

Genetic approaches in TSE control for goats from the United KingdomStewart et al.

POSTER – 175Prion 2012Amsterdam

ConclusioniConclusioni

1. Lo studio fornisce nuovi dati sulla variabilità genetica del gene SPRN

caprino mettendo in evidenza che Shadoo è altamente conservata

nella capra.

2. I risultati ottenuti suggeriscono un ruolo del polimorfismo indel 602

nella modulazione della suscettibilità alla scrapie classica nella

capra, ipoteticamente attraverso un meccanismo post-trascrizionale

di regolazione dell’espressione genica mediato da microRNA.

3. Un meccanismo d’azione alternativo potrebbe essere il legame

differenziale delle sequenza 3’UTR a proteine regolatorie.

4. L’identificazione di un target genetico al di fuori del gene PRNP

potrebbe essere utile per migliorare futuri piano di selezione

genetica nella capra

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