Facoltà di Medicina e Chirurgia Scuola di Specializzazione in Genetica Medica Dottorato di Ricerca...

Facoltà di Medicina e ChirurgiaFacoltà di Medicina e ChirurgiaScuola di Specializzazione in GenScuola di Specializzazione in Geneticaetica Medica Medica

Dottorato di Ricerca in Malattie Genetiche dell’EtàDottorato di Ricerca in Malattie Genetiche dell’Età

Centro di Riferimento Regionale per la Diagnosi e Cura delle Malattie Genetiche

Teresa MattinaTeresa Mattina

Università degli Studi di CataniaUniversità degli Studi di Catania

Integrità del genoma

L’integrità del genoma è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione e la riproduzione cellulare.

Anche una singola mutazione può impedire o danneggiare gravemente lo sviluppo di un organismo

Nuove mutazioniNuove mutazioni

Frequenza proporzionale alla gravità della patologia

Un terzo delle DMD sono nuove mutazioni

La cellula possiede meccanismi intrinseci, codificati nel DNA, che le garantiscano la capacità di mantenere l’integrità del genoma riparando i danni del DNA.

Integrità del genomaIntegrità del genoma

Integrità del genoma

Plasticità del genoma


Un sistema rigido nel mantenimento della sequenza

del DNA non permette l’evoluzione.

La sopravvivenza delle specie nel lungo periodo

richiede la possibilità di adattamento a nuove

condizioni fisiche e biologiche dell’ambiente

La cellula possiede meccanismi intrinseci al DNA, che le garantiscano la capacità di adattarsi ai cambiamenti ambientali.


Mutazioni e selezioneMutazioni e selezione

Il DNA è soggetto fisiologicamente al verificarsi continuo di rimaneggiamenti casuali.

I rimaneggiamenti del DNA vengono continuamente corretti: ciò tutela dell’integrità del genoma, ma consente l’evoluzione.

Le Mutazioni- la selezioneLe Mutazioni- la selezione

I rimaneggiamenti del DNA che si integrano nel genoma cellulare: mutazioni

comportano danno cellulare vengono selettivamente perduti nelle successive generazioni cellulari.

conferiscono vantaggio cellulare vengono mantenuti nelle successive generazioni cellulari.


Mutazioni che causano danno cellulare

•Ridotta o anomala funzione cellulare•Ridotta velocità di replicazione cellulare

•Alterazione delle caratteristiche antigeniche•Generazione di anticorpi•Attivazione dei macrofagi

Morte cellulareInvecchiamento tissutale


•Ridotta o anomala funzione cellulare•Aumentata velocità di replicazione cellulare

Mutazioni che conferiscono vantaggio cellulare

•Alterazione delle caratteristiche antigeniche•Generazione di anticorpi•Attivazione dei macrofagi

IperplasiaNeoplasia

Danno sul DNADanno sul DNA

MetabolismoCellulare

UV IRAgenti Chimici

Errori diReplicazione

Attivazione dei fattori

trascrizionali

Sistemi di riparo:BER, NER, MMR, HER

Apoptosi

Attivazione dei

Checkpoints


UV IRAgenti Chimici



trascrizionali


Apoptosi

Attivazione dei

Checkpoints


UV IRAgenti Chimici



UV IRAgenti Chimici


1.1 Danni al genoma umano e attivazione di sistemi di riparo


trascrizionali


Apoptosi

Attivazione dei

Checkpoints


trascrizionali


Apoptosi


UV IRAgenti Chimici



UV IRAgenti Chimici



UV IRAgenti Chimici

Virus


trascrizionali


Apoptosi

Attivazione dei

Checkpoints

Induzione di APOPTOSIInduzione di APOPTOSI

Attivazione sistemi di riparoAttivazione sistemi di riparo

DNA RIPARODNA RIPARO

Arresto ai checkpointsArresto ai checkpoints

G1 S

G2

M p21ATM

p16ARFpRbp53p21ATM


UV IRAgenti Chimici



trascrizionali


Apoptosi

Attivazione dei

Checkpoints


UV IRAgenti Chimici



trascrizionali


Apoptosi

Attivazione dei

Checkpoints


UV IRAgenti Chimici



UV IRAgenti Chimici




trascrizionali


Apoptosi

Attivazione dei

Checkpoints


trascrizionali


Apoptosi


UV IRAgenti Chimici



UV IRAgenti Chimici



UV IRAgenti Chimici

Virus


trascrizionali


Apoptosi

Attivazione dei

Checkpoints


UV IRAgenti Chimici



trascrizionali


Apoptosi

Attivazione dei

Checkpoints


UV IRAgenti Chimici



trascrizionali


Apoptosi

Attivazione dei

Checkpoints


UV IRAgenti Chimici



UV IRAgenti Chimici




trascrizionali


Apoptosi

Attivazione dei

Checkpoints


trascrizionali


Apoptosi


UV IRAgenti Chimici



UV IRAgenti Chimici



UV IRAgenti Chimici

Virus


trascrizionali


Apoptosi

Attivazione dei

CheckpointsAnomalie della riparazione del DNA

Esposizione ad agenti mutageni

DNA RIPARODNA RIPARO

Difetti del DNA RIPARODifetti del DNA RIPARO

Invecchiamento precoce dei tessuti a rapida proliferazione – Cute– Mucose– Linfociti

Degenerazione tessuti – SNC

Neoplasie

Difetti del DNA RIPARO Difetti del DNA RIPARO S. BloomS. Bloom

Acrosteolisi?Acrosteolisi?

Atassia telangectasiaAtassia telangectasia

Metodi di studioMetodi di studio

Studio di crescita clonale

Studio dei cromosomi

Studio dei micronuclei

COMET

Metodi di studio cromosomicoMetodi di studio cromosomico

Ricerca delle rotture cromosomiche/cromatidiche spontanee

Ricerca delle rotture cromosomiche/cromatidiche indotte

Analisi degli scambi fra cromatidi fratelli SCE

Analisi citogenetica costituzionale Studio cromosomico del tessuto neoplastico


Ricerca delle rotture cromosomiche/cromatidiche spontanee o indotte su 100 metafasi

Indice mitoticoPercentuale di cellule con rotture Numero di rotture per cellula


Ricerca delle rotture cromosomiche/cromatidiche spontanee o indotte su 100 metafasi

Conta delle rotture per cellulaNumero di rotture/100

Conta delle rotture per cellulaConta delle rotture per cellulaPercentuale di cellule con rotturePercentuale di cellule con rotture

Tipo di danno cellulareTipo di danno cellulare

25

CGG-CGG-CGG-CGG

CGG-CGG-CGG-CGGCGG-CGG-CGG

CGG-CGG- CGG-CGG-CGG

SCESCE

SCE Ciclo cellulare SCE Ciclo cellulare

I divisione II divisione III divisione

SCESCE

Tipo di danno cellulare

25

Metodi di studio cromosomico

SCE normali

SCE aumentati

Rotture normali

Rotture aumentate

Analisi degli scambi fra cromatidi fratelli SCE

Metodi di studio cromosomico

Analisi citogenetica costituzionale Studio cromosomico del tessuto

neoplastico

Cariotipo standard

Riarrangiamenti clonali clonali

FISHFISH

•Denaturazione

•Scelta della sonda

•Ibridazione

•Lettura

SONDE FISHSONDE FISH

YacYac: 100-150kb-2Mb BacBac: fino a 330kb di DNA CosmidiCosmidi: fino a 40kb di DNA FagiFagi: fino a 14-15kb di DNA PlasmidiPlasmidi: fino a 4-5kb di DNA

Painting:identificare

materiale da uno specifico cromosoma

Sonde per FISHSonde per FISH

FISHFISH

M-FISH• Immagini catturate separatamente per

ciascun fluorocromo utilizzando filtri ottici modificati

• Immagini elaborate da uno specifico software

SKY• Acquisizione delle

immagini: microscopio ad epifluorescenza, immagini charge-coupled device (CCD) e spettroscopio Fourier

• Misurazione dell’intera emissione dello spettro con una singola esposizione di tutte le immagini

SKY-M-FISHSono particolarmente utili per:

• Evidenziare traslocazioni

• Identificare marker cromosomici, regioni colorate in modo omogeneo, duplicazioni cromosomiche

• Individuare alcuni riarrangiamenti complessi

Array CGH

M-CGH

Array-CGH

Metodi di studioMetodi di studio

Studio dei micronuclei


COMET

Cellule inglobate in agarosio su vetrino

Lisi delle cellule in situ

Elettroforesi su vetrini

Colorazione del DNA

Analisi con microscopio a fluorescenza

Diametro della testa circa 40 m

Strumentazione per l’analisi del danno al Strumentazione per l’analisi del danno al DNA medianteDNA mediante

COMET ASSAYCOMET ASSAY

Microscopio a fluorescenzacollegato con il computer

che analizza i risultati tramite software opportuno

A: Esempio di “cometa”B: Cellula con DNA integro

A

B

Studi genotossiciRiparazione del DNAAnalisi di apoptosiBiologia dei radicali liberiTossicologia alimentareBiomonitoraggiIndagini clinicheAnalisi del ciclo cellulare

VERSIONE ALCALINA

VERSIONE NEUTRA

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

TEMPO 0 TEMPO 1 TEMPO 2 TEMPO 3 TEMPO 4

A

B

C

D

CTRL

DNA in equilibrioDNA in equilibrio

Predisposizione Genetica

• Checkpoint• Enzimi del DNA riparo• Metabolismo

Fattori ambientali

• Metabolismo cellulare• Agenti fisici UV, RI, • Agenti chimici: ossidanti,

benzene, fumo di sigaretta, caffè, farmaci

• Virus• Carenze vitaminiche (vit. C,

acido folico)

Genotipo

Fenotipo

DNAReplicazio

neTrascrizione

Traduzione

Riparo

Recettori

Proteine

RNA

ROMA (ANSA 11.05.06) - Sono circa 14.000 l'anno i casi stimati di tumore tra gli adolescenti e i giovani adulti (tra 15 e 39 anni) in Italia, ……..………….crescono i tumori in qualche modo legati ai cattivi stili di vita, a partire dal fumo di sigaretta e la mania per l'abbronzatura.

Fattori ambientaliFattori ambientali

Facoltà di Medicina e Chirurgia Scuola di Specializzazione in Genetica Medica Dottorato di Ricerca...

Documents

Transcript of Facoltà di Medicina e Chirurgia Scuola di Specializzazione in Genetica Medica Dottorato di Ricerca...