[enologia] Biotecnologia del Vino e Laboratorio - Zambonelli ed REDA

A. Cavazza - V. Tini - C. Zambonelli

11rREDAedizioni per l'agl~ric~ol~tu~ra~ ~ _

\

•

edizioni per l'agricoltura

1tREDA

f------ A Cavalla V Tini C Zambonel i -----

Direzione editoriale:Domenico Ugulini

Progetto grafico, impaginazione e copertina:Caterina Marcucci

Ricerca iconografica e illustrazioni:- A. Cavazza, V. Tini, C. Zambonelli- Archivio Iconografico Istituto Agrario S. Michele All'Adige- Dottoressa Lorena Castellari (CATEV Tebano - Faenza)- Le fotografie al microscopio elettronico sono state eseguite da Marzia Benevelli- CRPV (Centro Ricerche Produzioni Vegetali)- TRACE Snc

Redazione:Reda Edizioni - Gianni D'ArcoCaterina Marcucci

Realizzazione lastre CTP:Fotoincisa EFFEGI, Savigliano (CN)

Stampa:Reda Edizioni Torino

Proprietà letteraria e artistica riservata.

L'Editore, nell'ambito delle leggi internazionali sul copyright, è a disposizione degli aventi diritto non potutirintracciare.

1a edizione: gennaio 2006Ristampa:

52010

42009

32008

22007

12006

© Reda EdizioniVia Sansovino, 243/22/R - 10151 TorinoTelefono 01114513611 - fax 01114513612internet: www.redaedizioni.itE-mail: [email protected]

III •

Presentazione

La Microbiologia è scienza giovane, nata (guarda caso) come Microbiologia Enologica poco più di 150anni fa con i primi studi sul vino eseguiti da Pasteur. Per moltissimo tempo nel mondo universitario laMicrobiologia è stata considerata materia marginale e poco importante, tanto che solo le Facoltà di Agraria

la comprendevano nel loro piano di studi con l'insegnamento fondamentale di 'iMicrobiologia Agraria e

Tecnicà' (Microbiologia del Terreno e Microbiologia Tecnologica, collegata alle Industrie Agrarie). Nelle

Facoltà di Medicina era considerata una appendice del corso di Igiene e solamente negli anni '50 del secolo scorso ha assunto la propria dignità d'insegnamento fondamentale. Nelle Facoltà di Scienze l'insegna

mento della Microbiologia poteva essere complementare e veniva mutuato, appunto, dalle Facoltà di

Agraria.

Negli ultimi 30 anni la considerazione verso questa materia è radicalmente cambiata ed attualmente

occupa e svolge un ruolo di primissimo piano interessando, a 360 gradi, tutti i rami della biologia enon solo. Molto intensa è stata l'attività di ricerca riguardante il settore alimentare verso il quale è

stata rivolta un'attenzione del tutto particolare, prendendone in esame vari aspetti come quello della

sicurezza igienico-sanitaria e quello della stabilità dei prodotti. Va infatti considerato che gli alimenti, dalle materie"'prime ai prodotti pronti per il consumo, sono potenziali vettori di batteri patogeni

o di tossine di origine microbica, oltre che di svariati microrganismi che ne possono comprometterela commestibilità. I metodi per la ricerca di singole specie o di gruppi microbici sono stati messi a

punto e ben codificati per ogni singolo alimento e per ogni possibile situazione e hanno carattere di

ufficialità. Sull'argomento sono stati pubblicati numerose opere e prontuari in grado di rispondere a

qualunque domanda degli analisti.

Il settore della Microbiologia Enologica, dal punto di vista analitico, non è altrettanto esauriente, forse

perché il vino, per la sua composizione, non può essere vettore di batteri patogeni o tossigeni e non presenta alcun problema sotto l'aspetto igienico-sanitario: la peggior cosa che può accadere a un vino è

quella di diventare aceto, magari un buon aceto. Tuttavia spesso si richiede, agli enologi e ai

produttori/trasformatori vitivinicoli, anche di presentare una certificazione microbiologica (che riguar

da prevalentemente la stabilità dei prodotti) come di eseguire dettagliate analisi di laboratorio per le

quali manca una metodologia consolidata.

[organismo internazionale al quale è affidato il compito di regolamentare tutto il settore della vite e delvino è l'OIV (Organisation InternationaL de La Vigne et du Vin) con sede a Parigi e a cui aderiscono, con

parità di voto, tutti gli stati nazionali interessati alla produzione del vino con l'obbligo di introdurre

nella propria legislazione tutto ciò che viene deciso. Ovviamente l'OIV si occupa anche della partemicrobiologica, ma quanto ha finora stabilito in materia analitica si limita a pochissimi argomenti, non

certo in grado di rispondere alle attuali domande degli enologi.

III

______ 11

Il motivo che ci ha indotto a preparare la presente Opera è proprio questa pressante richiesta degliaddetti al settore, di un "prontuario" (compatto, immediato e di facile lettura) che li metta in condizione di eseguire, secondo standard consolidati, le analisi microbiologiche di varia natura. In mancanza di metodologie "ufficiali" si è deciso di privilegiare e sviluppare quei procedimenti proposti oadottati dai vari Autori che, nel corso del tempo, hanno indagato ed eseguito studi sperimentali nelsettore microbiologico applicato alle trasformazioni enologiche.

L:augurio, così come l'obiettivo che ci siamo dati insieme all'Editore, è che questa "MicrobiologiaEnologica in Laboratorio" possa facilitare il lavoro dei professionisti che operano nella splendida realtàenologica italiana e possa contribuire positivamente alla preparazione professionale degli studenti chefrequentano i corsi di enologia.

Per me, personalmente, è risultato molto gradevole e facile lavorare con persone competenti e correttequali sono i più giovani colleghi Cavazza e Tini ai quali va attribuito quanto di meglio si può trovare inquest'Opera. È poi motivo di grande soddisfazione che la Casa Editrice "Redà' abbia accolto con favorela nostra richiesta di pubblicazione del volume: fin da quando ero studente, negli anni '40 del secolo scorso (talvolta mi sembra impossibile che sia passato tanto tempo ... ) settimanalmente mi recavo presso lalibreria Galleri, in via Indipendenza a Bologna, che in una vetrinetta esterna esponeva tutti le novità librarie edite dalla Reda. In quelle circostanze, ho più volte immaginato e sognato che fra quei libri ce ne fosseanche uno col mio nome. Poi le cose sono andate come sono andate sia per la Reda di. quei tempi cheper la libreria Galleri (che ha chiuso). Ora che vedo anche soddisfatto quel mio sogno 'giovanile, sonograto alla nuova Reda e spero che questo volume contribuisca alla sua fortuna editoriale.

Carlo Zambonelli

IV

Indice

I Il I

PARTE PRIMA GENERALE 03_1 mezzi nutritivi 23

A I microrganismi:3.1Junzioni e classificazioni 23

3.2_1 preparati del commercio 24

determinazione e controllo 1 3.3_Mezzi e terreni per lieviti 25

- Mezzo di Sabouraud 25

01_1 microrganismi degli alimenti 2 - Mezzo YPG

1.1_Generalità 2 (Yeast Extract, Peptone, Glucose) 26

1.2_1 microrganismi del vino 4 _Malto (YM) 26

l.3_le analisi microbiologiche _WL Nutrient Medium (WL Nutrient Agar) 26

degli alimenti 5 _Agar-lisina 27

Il caso del vino 6 _Agar-acetato 27-

I metodi di analisi 6 - Mezzo sintetico 28-

_Gorodkowa-agar 29

02_1 laboratori di microbiologia 9 _Terreno BiGGY 29

2.1 Il laboratorio. Caratteristiche _Antibiotici 30

e funzioni 9 3.4_1 terreni per batteri lattici 30

2.2_Gli ambienti e gli arredi fissi 11 _Terreno ATB 31

2.3_Gli attrezzi 12_Terreno per Leuconostoc oenos

-'I microscopio ottico 12(Oenococcus oem) 31

I termostati 13_Terreno di Weiller e Radler 31

- _Terreno SL 32-'I frigorifero 14

_Terreno MRS 32-'I congelatore 14

3.5_Mezzi e terreni per batteri acetici 32- Il forno a microonde 14

_Terreno all'etanolo 33_Lapparato filtrante 14

_Terreno GYC 33_La centrifuga 15 _Terreno al mannitolo (MYP) 34- La cucina 16 _Terreno di Lafon-Lafourcade e Joyeux 34

- Lautoclave 16 3.6_Terreni per enterobatteri 342.4_Altre attrezzature 18 _Violet Red Bile Agar (VRBA) 35

_La cappa a flusso laminare 18 _Le. Broth (per Escherichia coli) 35_II microscopio a epifluorescenza 20 _MacConkey Sorbitol agar-'I microscopio stereoscopico 21 (per enterobatteri) 35

_Gli agitatori 22 3.7_Terreni per microrganismi generici 36

_La vetreria e gli attrezzi minori 22 _Plate Count Agar 36

-'I materiale "usa e getta" 22 3.8_Mezzi di arricchimento 36

V

... 11

3.9_1 diluenti

_Soluzione fisiologica

_Acqua peptonata

04_la sterilizzazione4.1_Definizione

4.2_la sterilizzazione a caldo

36 4.3_la filtrazione 39

37 4.4_la sterilizzazione chimica 4037

4.5_le radiazioni ionizzanti 40

38 4.6_1 raggi ultravioletti 41

38 4.7_le alte pressioni meccaniche 41

38 4.8_la pasteurizzazione 41

PARTE SECONDA SPECIALE

BCriteri e metodi 3.5_Determinazione del carico microbico 60

di microbiologia analitica 43 Premessa 60

01 le colture microbiche 44 04_11 campionamento 611.1_lo stato delle cellule 44 4.1_Definizione e procedura 61

_La moltiplicazione delle cellule 44 _Prelievo dei campioni 611.2_la coltura pura microbica 45 _Piani di campionamento 63

_Ottenimento delle colture pure 45 _Trasporto e conservazione dei campioni 631.3_Esame delle colonie 47 4.2_Preparazione del campione 64

_Esame microscopico fresco 47_Diluizione dei campioni 64

1.4_Trasferimento delle colonie 494.3_Conteggio diretto 66

1.5_1 ceppi microbici 50_" contaglobuli BLirker 66

Le collezioni 51_" contaglobuli di Thoma 67

Il mantenimento delle collezioni 524.4_Conteggio indiretto 69

02_lo sviluppo nei mezzi liquidi 53 _La centrifugazione 71

2.1Jasi dello sviluppo 53 La filtrazione 71

2.2_l'accumulo dei prodotti 4.5_Concentrazione del campione 71

di fermentazione 54

2.3_Curve di sviluppoApplicazioni 72

54CAnalisi microbiologica dell'aria 72

03 Il carico microbico 57 2_Analisi microbiologiche

3.1_Definizioni 57 di superfici 73

3.2_le unità facenti colonia (ufc) 58 3_1/ sistema HACCP

3.3_Significato del carico microbico 58 Approfondimento - Shelf-/ife 74

3.4_11 caso del vino 59 4_La colimetria 74

VI

I I I I

PARTE TERZA ApPLICATlVA3.1_1 microrganismi dell'uva 94

CAnalisi di microbiologiaenologica 77 3.2_la contaminazione casuale 94

3.3_Analisi dell'uva sana 9401 Caratterizzazione ed identificazione 3.4_Analisi di singoli acini 95-

dei lieviti 78 3.5_Analisi di grappoli 961.1_Generalità 78 3.G_Analisi della carposfera 961.2_ldentificazione delle specie 3.7_Analisi dell'uva danneggiata 97

più importanti 80

_Riconoscimento di Saccharomyces cerevisiae 80 04_Analisi microbiologiche dei mosti

_Riconoscimento dei Saccharomyces e delle fecce 99

freddo-fermentanti 81 4.1_Controllo del mosto 99

_Riconoscimento dei lieviti apiculati 4.2_Controllo del mosto non ancora

(Kloeckera apiculata ed altre specie) 81 in fermentazione 100

_Riconoscimento di Saccharomycodes ludwigii 82 Applicazioni 101Riconoscimento di Metschnikowia CMetodi microscopici 101pulcherrima 82 2_Conta su piastra 101

_Riconoscimento di Schizosaccharomyces 3_Ricerca di lieviti e batteri acetici 101pombe 83 4_Ricerca di batteri lattici 102Riconoscimento di Pichia membranifaciens 83-

4.3 Determinazione della carica_Riconoscimento di Torulaspora delbrueckiie Zygosaccharomyces spp. 84 batterica totale e dei mosti 102

_Riconoscimento dei lieviti dei generi Dekkera 4.4_Analisi microbiologiche delle fecce 102

e Brettanomyces 85 OS_Analisi microbiologiche del vinoRiconoscimento di Pichia anomala 86 in bottiglia 104Riconoscimento di altri lieviti 86

5.1_" metodo standard 104

02 Caratterizzazione delle colture 87 5.2_Vino filtrato o pasteurizzato in bottiglia 105

2.1_Caratteristiche enologiche 87_Conteggio dei lieviti 105

_Determinazione della capacità fermentativa 87_Campionamento 105

_Conteggio dei batteri lattici 107_Determinazione dei caratteri di competitività 88

Determinazione dell'alcol-tolleranza 90 06_Le analisi microbiologiche dei_Detrminazione della capacità di flocculazione 90 coadiuvanti enologici 108_Determinazione della capacità schiumogena 90 G.1_Analisi microbiologiche del lievito_Determinazione della temperatura ottimale 91 disidratato (l5A) 108_Determinazione della capacità fermentativa _Conteggio dei lieviti 108

a basse temperature 91 _Conteggio dei batteri 109_Formazione di composti secondari G.2_Analisi microbiologica del Mosto

della fermentazione 92 Concentrato Rettificato (MCR) 110_Produzione di composti solforati 92

J ceppi di riferimento 93 Approfondimento 1 - Espressione dei risultatidei conteggi di microrganismi 111

03_Analisi microbiologica dell'uva 94 Approfondimento 2 - Incertezza di misura 112

VII

..-- 11

Gli Autori

Agostino Cavazza

Nato a Bologna nel 1959, si è laureato in Scienze Agrarie nel 1983. Dal 1986 è responsabile dellaboratorio di microbiologia dell'Istituto Agrario di S. Michele All'Adige. Ha pubblicato diversi lavori scientifici sul metabolismo dei lieviti enologici e sui metodi di controllo della qualità in enologia. Dal 1994è in possesso del titolo di Enologo e nel 1995 ha superato l'esame come valutatore di sistemi qualità.Dal 1997 al 2000 è stato docente incaricato di Microbiologia Generale e di Microbiologia Enologicapresso la sede italiana della Fachhochschule "Diplom-Ingenieur (FH) Weinbau und Oenologie"; dal2001 è docente incaricato presso l'Università di Trento.Dal 2004 fa parte del comitato tecnico di coordinamento OIV italiano, è esperto tecnico della commissione di microbiologia dell'OIV ed è a capo del gruppo di lavoro incaricato dall'OIV di aggiornare imetodi di analisi microbiologica di mosti e vini.

Vincenzo Tini

Nato a Brisighella (RA) nel 1944, si è laureato in Scienze Agrarie a Bologna e dal 1976 è responsabiledel Centro Lieviti di Tebano (Faenza).Dal 1988 al 1991 è stato docente di Microbiologia Agraria e Tecnica presso l'Università di ReggioCalabria. Dal 1991 a tute'oggi è titolare dei corsi di Microbiologia Applicata alle Produzioni Animali edi Tecniche Microbiologiche nei rispettivi corsi di laurea di Produzioni Animali e di Viticoltura edEnologia dell'Università degli Studi di Bologna.

Carlo Zambonelli

È nato a Bologna nel 1926 dove si è laureato in Scienze Agrarie nell'a.a. 1948/49. Ha svolto tutta la suaintensa attività di ricerca e didattica nel settore della Microbiologia agraria. È autore di numerosi scritti earticoli scientifici sui lieviti del vino ed altri alimenti fermentati, pubblicati su riviste nazionali e internazionali. È autore di diversi volumi riguardanti la microbiologia del vino.Dal 2001, dopo aver raggiunto i limiti di età per l'attività accademica, ha continuato ad operare nelsettore collaborando con numerose istituzioni italiane e straniere (Sud Africa, Giappone, NuovaZelanda).

VIII

I I I I

Introduzione

Spesso, nello sviluppare i contenuti della Microbiologia Enologica, che si collocano nei corsi di indirizzo degli Istituti Tecnici Superiori ed ancor più nelle Università, vengono approfonditi gli aspettibiochimici, metabolici, tassonomici ed ecologici dei lieviti e dei batteri che interessano il settore enologico. Tante di queste informazioni sono importanti perché vanno a costituire e consolidare quelbagaglio teorico che permette al tecnico (enologo) di avere la piena padronanza del suo operare in cantina e di giustificare le proprie scelte operative nella produzione di vini di qualità. Inoltre, è risaputoche la valorizzazione delle peculiarità enologiche di alcuni vitigni può realizzarsi anche attraverso laconoscenza del metabolismo e dell'attività dei lieviti e dei batteri.Tutte queste informazioni non sono però di per sé sufficienti a garantire un elevato standard produttivo intermini qualitativi: la sicutezza di ottenere e mantenere una qualità costante e duratura nel tempo si puògarantire solo attraverso un attento controllo di tutte le fasi di produzione, ed in tal senso il controllomicrobiologico dei fattori e dei processi non può e non deve essere trascurato.

Il consumatore che sceglie di acquistare un determinato vino in bottiglia, così come quando sceglie unqualsiasi altro prodotto alimentare magari in funzione anche delle "armonie culturali" ad esso associate, siaspetta non solo di trovarvi alcune caratteristiche legate a fattori chimico-fisici e sensoriali, cioè che "quelvino scelto" sia ~iconoscibile e soddisfi appieno le sue aspettative, ma si aspetta che le qualità ad esso associate siano presenti in tutte le bottiglie che acquista, anche in tempi e occasioni diverse. In altre parole, unvino deve essere sempre impeccabile quando viene consumato, indipendentemente dal momento e dall'occasione. In questo senso, non è sufficiente che una buona materia prima (l'uva) sia trasformata secondo imigliori standard tecnologici, se ciò non avviene sotto un attento e rigoroso controllo dei processi e deimateriali impiegati, il tutto garantito anche dal punto di vista del controllo microbiologico.

La globalizzazione dei mercati è un fenomeno di cui si parla molto: anche il mercato del vino è semprepiù internazionale, sia con nuovi paesi produttori sia con nuovi paesi propensi al consumo, e la ricercadi nuovi mercati fa sì che le bottiglie prodotte nel luogo d'origine vengano poi commercializzate in paesitalvolta lontanissimi. In questo caso la comparsa di eventuali difetti nel vino diventa ancora più grave,perché se da un lato comporta costi proibitivi per richiamare o sostituire il prodotto da mercati moltolontani, dall'altro, in un contesto di fortissima concorrenza è un evento disastroso che nella maggiorparte dei casi non lascia una seconda chance al produttore e può mettere in crisi in quel contesto ancheil tipo di vino promosso. I..:introduzione sul mercato di vini che possano manifestare anche lievi difettiè pertanto un rischio non più trascurabile e non facilmente rimediabile.

Da quanto sopra deriva che la Microbiologia Enologica non può più permettersi di restare circoscrittanelle aule universitarie o scolastiche o nei laboratori di ricerca, ma deve entrare nelle cantine. Eseguirecontrolli microbiologici, oggi, non significa necessariamente dedicarsi ad attività laboriose che richiedono lunghi periodi di formazione e costosi materiali, ma (salvo i casi più particolari) eseguire analisi e

IX

-----_11determinazioni che, anche grazie alla disponibilità dei nuovi materiali manouso, sono veloci nella tempistica ed efficaci nei risultati e non richiedono più apparecchiature costose o lunghi tempi di sterilizzazione. I controlli microbiologici non possono e non devono essere più saltuari e affidati a pochi laboratorispecializzati, ma devono essere (e lo stanno già diventando) sempre più un'attività interna di cantina, ancheper quelle medio-piccole, come uno dei tanti servizi forniti dai numerosi laboratori che fino a poco tempofa eseguivano solamente le analisi chimiche.

Per tutti questi motivi, nella realizzazione del volume abbiamo cercato di proporci non solo nelle vestidi chi opera in un laboratorio di ricerca specifico, ma anche di tutti coloro che lavorano in un contestoaziendale in cui la microbiologia non è l'attività principale, ma strumento di controllo della qualità delprodotto, e quindi di chi si aspetta da tale strumento risposte rapide, ma allo stesso tempo affidabili.

Con questo lavoro crediamo di avere colmato una lacuna nel contesto editoriale di questa disciplina.È vero, sono presenti sul mercato ottimi trattati e diversi testi che illustrano estesamente l'argomento,ma crediamo mancasse finora un "prontuario" di agile e pronta consultazione, che possa guidare il tecnico durante la sua formazione per poi accompagnarlo anche nell'attività quotidiana o di laboratorista o di tecnico-enologo di settore.In questo senso speriamo e crediamo di essere riusciti nell'intento: sicuramente quest'Opera conterràmolti di quei difetti riscontrabili in ogni prima edizione, ma la necessità di affrontare un argomento coslimportante sviluppandolo in un'ottica in qualche modo nuova pareva, a noi come all'Editore, uno sforzo degno di essere affrontato. È per questo che, confidando nel fatto che ogni nostra azione può esseremigliorata, saremo grati a tutti coloro che attraverso appunti, critiche e considerazioni ci daranno lostimolo a migliorare il lavoro nelle future edizioni.

Agostino Cavazza

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x

Vincenzo Tini

Parte Prima Generale

AI microrganismi: determinazione e controllo

01_1 microrganismi degli alimenti1.1_Generalità

1.2_1 microrganismi del vino

1.3_le analisi microbiologiche

degli alimenti

02_1 laboratori di microbiologia2.CII laboratorio.

Caratteristiche e funzioni

2.2_Gli ambienti e gli arredi fissi

2.3_Gli attrezzi

2.4_Altre attrezzature

03_1 mezzi nutritivi3.1_Funzioni e classificazioni

3.2_1 preparati del commercio

3.3_Mezzi e terreni per lieviti

3.4_1 terreni per batteri lattici

3.5_Mezzi e terreni per batteri acetici

3.6_Terreni per enterobatteri

3.7_Terreni per microrganismi generici

3.8_ Mezzi di arricchimento

3.9_1 diluenti

04_la sterilizzazione4.1_Definizione

4.2_la sterilizzazione a caldo

4.3_la filtrazione

4.4_la sterilizzazione chimica

4.5_le radiazioni ionizzanti

4.6_1 raggi ultravioletti

4.7_le alte pressioni meccaniche4.8_la pasteurizzazione

(o pastorizzazione)

o1 I microrganismi degli alimenti

1.1_Generalità<materie prime Tutte le materie prime alimentari ed i loro derivati costituiscono un mezzo

nutritivo a spese del quale si possono moltiplicare numerosi microrganismi,dotati delle più differenti attività. Gli effetti dello sviluppo ,microbico nonsono costanti e dipendono dalla natura e dalla composizione delle materie

Ir! prime, dallo stato in cui queste si trovano, dalle condizioni (soprattutto dallar~ temperatura) alle quali sono mantenute, dal tipo di contaminazione che le

caratterizza e da altri fattori. In base all'azione che svolgono e alle conseguenze del loro sviluppo, i microrganismi possono essere suddivisi in quattro gran-di gruppi.I primi due gruppi, quello dei patogeni e quello dei tossigeni, sono rappresentati da microrganismi la cui azione è univoca. I gruppi degli alteranti e dei virtuosi, invece, comprendono microrganismi la cui azione è

non costante. I lieviti, adesempio, rientrano certamente nel gruppo dei virtuosi, perché è alla loro attivitàfermentativa che si deve laproduzione di tutte le bevande alcoliche; tuttavia, inmolti casi, possono esserecausa di alterazioni di variprodotti, fra i quali le stessebevande alcoliche. Analoghe

~' , . considerazioni valgono, poi,

anche per l'altro grandegruppo di batteri virtuosi,cioè i batteri lattici.

Il Il 2

• Parte Prima Generale I I I •

I batteri patogeni

I batteri patogeni possono contaminare numerosi alimenti nei quali non hanno possibilità di sviluppo. I piùcomuni sono costituiti da varie specie e ceppi del genere Salmonella (agenti delle salmonellosi, cioè tifo e paratifo), da Vibrio cholerae (agente del colera), da Mycobacterium tubercolosis (agente della tubercolosi), daBrucella abortus (agente della brucellosi nota anche col nome di "febbre maltese"), da Listeria monocytogenes(agente della listeriosi, malattia molto insidiosa).Sono numerosi gli alimenti, sia di origine vegetale sia di origine animale, che possono essere portatori di batteripatogeni. Non il vino ed i prodotti enologici in genere, a causa del basso valore di pH che li caratterizza.

I microrganismi tossigeni

I microrganismi tossigeni hanno possibilità di sviluppo in numerosi prodotti alimentari, sia di origine animale siadi origine vegetale. Le loro cellule, dopo lo sviluppo, possono anche morire e, quindi, possono non essere trovateper via analitica. Rimangono però i composti tossici, i quali sono generalmente sensibili alle alte temperature (100CC). Di conseguenza, gli alimenti a maggiore rischio sono quelli crudi ed anche quelli cotti conservati in frigoriferoe consumati dopo blando riscaldamento. Nel vino i batteri tossigeni non hanno possibilità di sviluppo a causa delbasso valore di pH.I microrganismi agenti di tossinfezioni o intossicazione rilasciano le tossine in seguito a sviluppo nell'alimento.Essi possono già essere presenti nella materia prima oppure possono contaminare il prodotto in un momentosuccessivo; inoltre, molti sono in grado di tollerare il sale, altri sono sporigeni e sopravvivono alla pasteurizzazione, altri ancora sviluppano bene alla temperatura di frigorifero (+4 °C). Questi microrganismi sono assainumerosi; i più noti sono:., Staphylococcus aureus;., Clostridium botulinum;., Clostridium perfringens;., Bacillus cereus;., Yersinia enterocolitica;., i campilobatteri e numerose muffe, soprattutto quelle del genere Aspergillus (ma non solo).

I microrganismi alteranti

I microrganismi alteranti sono quelli che, sviluppandosi negli alimenti, ne compromettono le caratteristiche sensoriali o commerciali, senza però provocare alcun rischio dal punto di vista igienico-sanitario per il consumatore.I microrganismi potenzialmente alteranti sono numerosissimi e sono riferibili ai più differenti raggruppamenti dibatteri e di funghi.

I microrganismi virtuosi

Sono definiti utili o virtuosi quei microrganismi che, sviluppando in un alimento di base opportunamente preparato, lo trasformano, ne cambiano la composizione e lo rendono più gradevole e più serbevole: sono quelli allacui attività si deve la produzione degli alimenti fermentati. I microrganismi virtuosi sono pochi e tutti riferibili aigruppi dei batteri lattici e dei lieviti. In alcuni casi sono considerati virtuosi anche i batteri propionici (formaggitipo Emmentaler) e le muffe (salumi e particolari formaggi).Nella Tabella 1.1, a pagina seguente, sono riportati i microrganismi virtuosi dei più comuni alimenti fermentati.

3 Il Il

- 1 101

Materiaprima

Animale

Originedella MateriaPrima

Vegetale

Prodotto

~arne

~atte

Cereali

Vite

Cavolo

Olive

Foraggi

[salumi

[

Latti fermentati

Formaggi

Gane

Prodotti da forno

Birra

Vino

Crauti

Olive fermentate

Insilati

Microrganismi virtuosi

Batteri lattici

Batteri lattici(talvolta con lieviti)

Batteri lattici

Lieviti

Batteri lattici e lieviti

Lieviti

Lieviti (e batteri lattici)

Batteri lattici

Batteri lattici

Batteri lattici

[Tabella 1]I microrganismi virtuosi che intervengono nella produzione deglialimenti fermentati.

<etanolo e microrganismi

I batteri acetici

I lieviti

I batteri lattici

1.2_' microrganismi del vino

Il mosto d'uva ed il vino sono alimenti nei quali i batteri patogeni o tossigeni ed i batteri di origine fecale non hanno possibilità di sviluppo o di sopravvivenza. Il fattore che rende i prodotti enologici sicuri sotto l'aspetto igienico-sanitario è il valore di pH, sempre inferiore al valore 4.0, più spesso prossimo a 3.0. Letanolo, anche alle concentrazioni presenti nei vini a gradazione alcolica più alta, non è di per sé sufficiente ad. inibire la crescita deimicrorganismi, ma ha solamente un'azione sinergica che rafforza quelladovuta ai bassi valori di pH. Nei distillati, che hanno concentrazioni alcoliche elevate, ma non sono acidi, sono stati trovati batteri appartenenti ai generi Bacillus e, raramente, anche coliformi: si tratta di forme sopravviventi inun ambiente ostile che non sono in grado di crescere e moltiplicarsi, macomunque non muoiono. Dunque gli unici microrganismi capaci di sviluppo nei mosti e nei vini sono i batteri acetici, i lieviti e alcuni batteri lattici.Questi gruppi di microrganismi non hanno sempre importanza univoca.

Sono sempre alteranti.

Sono utili in quanto agenti della fermentazione alcolica.Sono spesso alteranti. Tali sono gli agenti della fioretta, alcune specie che impartisconogusti non graditi e gli stessi agenti principali della fermentazione alcolica, perché possonodeterminare torbidità o rifermentazioni indesiderate.

Sono utili in quanto agenti della fermentazione malolattica, quando gradita.Sono alteranti perché agenti della fermentazione malolattica, quando non gradita,e perché agenti di malattie del vino.

Il Il 4

• Parte Prima Generale I I I I

1.3_Le analisi microbiologiche degli alimenti

I controlli e le analisi microbiologiche hanno un'importanza primaria nel settore alimentare. Di conseguenza, sono state formulate alcune norme legislative internazionali che riguardano tutti gli aspetti analitici, a partire dal campionamento fino alla descrizione dei metodi da seguire per la ricerca dei singolimicrorganismi o dei composti tossici. Tutti i procedimenti ed i metodi aventicarattere di ufficialità sono formulati da varie commissioni internazionali,ciascuna delle quali ha competenza su un argomento specifico.I gruppi di microrganismi, che di norma sono fatti oggetto di controlli eanalisi, sono quattro.• Microbi potenzialmente nocivi per i consumatori perché patogeni o tos- "sigeni. La loro presenza e attività negli alimenti vanno tassativamente escluse,e per fare ciò è stato creato il sistema HACCP (Hazard Analysis and CriticaIControl Point). Questo sistema richiede che ogni produttore di alimenti sia ingrado di valutare tutti i fattori di rischio, non solo microbiologici, per il consumatore finale e di mettere in opera gli accorgimenti necessari a ridurre alminimo tali rischi. Si sottolinea che il sistema HACCP è rivolto a minimizza-re i rischi per la salute del consumatore e non per la qualità del prodotto; pertanto le alterazioni alimentari che determinano, ad esempio, le alterazioni sensoriali del vino dovute a batteri acetici o a lieviti Brettanomyces, non rientranonei piani HACCP. La ricerca dei microrganismi potenzialmente nocivi per iconsumatori può essere comunque eseguita in tutte la fasi della lavorazione,dalla materia prima al prodotto finito, per valutare le condizioni igienichedella produzione. Le analisi sono eséguite da laboratori pubblici oppute dalaboratori accr~ditati per la certificazione della qualità.• Microbi indicatori di contaminazione fecale. La loro ricerca è fattasugli alimenti, sulle acque e su altre sostanze e materiali che vengono acontatto con gli alimenti, da laboratori pubblici o certificatori delle qualità.• Microbi in grado di alterare le caratteristiche sensoriali o la qualitàcommerciale del prodotto. La loro ricerca rientra nei piani di controllo qualità, perché consente di monitorare 1'andamento della produzione e di prendere decisioni importanti per mantenere le condizioni ottimali di produzione.

<microbi nocivi

<HACCP

<microbi indicatori

<

microbi alteranti

Controllo qualità

Controllare non significa semplicemente"esaminare ciò che sta succedendo in un processo", ma significa"gestire,governare, tenere sotto controllo il processo" .Si possono fare analisi durante la produzione per avere un'idea di quanto sta accadendo o per controllare che ciò che sta accadendo sia effettivamente quanto è stato pianificato o checomunque deve accadere: solo in questo caso si può parlare di controllo qualità. Per sapere se una certa analisi rientra nel controllo qualità di un prodotto, èsufficiente seguire la seguente regola: prima di richiedere un'analisi, pensate che cosa farete in caso di risultato positivo (cioè che rientra nei valori desiderati o tollerati) e cosa farete in casodi risultato negativo. Se il vostro comportamento sarà uguale nei due casi, quell'analisi non è un controllo qualità:può essere utile per conoscere le caratteristiche del prodotto, ma non è un controllo qualità.

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<microbi utili

<metodi ufficiali

<metodi interni

<OIV

<stati membri

Queste analisi vengono eseguite nei momenti della lavorazione consideraticritici, quasi sempre ad opera di laboratori interni all'industria oppure daparte di laboratori privati o di ricerca.• Microbi cosiddetti utili o virtuosi che intervengono positivamentenel processo di fermentazione. Queste analisi, fatte di solito in laboratoriinterni oppure privati o di ricerca, sono una forma di monitoraggio delprocesso e non sempre un controllo qualità.

Il caso del vino

Le analisi microbiologiche dei mosti e dei vini sono sempre eseguite pressolaboratori interni (se esistenti), laboratori pubblici (NAS) o privati omologati, oppure di ricerca; non sono mai eseguite presso i laboratori ufficialidelle AUSL. Di fatto, esse si prefiggono finalità differenti da quelle riguardanti altri alimenti a rischio; tali finalità riguardano l'individuazione dei lieviti presenti sull'uva, nei mosti e nei vini, la selezione di ceppi, il reperimento di specie non idonee, l'accertamento dell'efficacia degli starter, il controllo dell'efficacia della pasteurizzazione, della filtrazione ed altre finalità, tuttelegate alla determinazione dello stato microbiologico dei prodotti e dellaloro stabilità. Le analisi ed i controlli riguardano i lieviti, i batteri lattici, ibatteri acetici e, solo in casi particolari, altri microrganismi.

I metodi di analisi

r metodi ufficiali di analisi valgono per tutte le materie prime alimentari e pertutti i prodotti che ne derivano. Come già si è detto, il caso del vino è del tuttoparticolare perché non richiede l'esecuzione dei controlli di natura igienicosanitaria, per i quali quei metodi sono stati formulati. Restano pur sempre deivalidi punti di riferimento, relativi in particolar modo ai principi generali e adalcuni procedimenti (ad esempio il campionamento).Per quanto riguarda la gerarchia del valore giuridico dei metodi analitici, imetodi pubblicati nella Gazzetta Ufficiale della Comunità Europea sono riconosciuti universalmente; poi seguono i metodi nazionali, quelli pubblicati daorganizzazioni di categoria e, infine, i cosiddetti metodi interni, che per essere riconosciuti devono essere sottoposti a lunghe procedure di validazione.Con il regolamento europeo 1433/99, è l'ON l'Ente internazionale al qualeè devoluto il compito di mettere a punto i metodi di analisi microbiologica(validi ai fini di molte certificazioni) riguardanti il settore enologico: il significato dell'acronimo è "Organisation International de la Vigne e du Vin" ecorrisponde a quello che, fino al 2000, era chiamato "Office International dela Vigne et du Vin".LOrV è una struttura della quale fanno parte tutti gli Stati interessati allaproduzione del vino e quelle organizzazioni intergovernative che dispongono di prerogative, trasferite loro dagli stati membri, relative a una gamma diargomenti di competenza dell'OrV, tra cui il potere di prendere decisionivincolanti.Gli stati membri nominano un proprio capo-delegazione che, in sede diAssemblea Generale, dispone di un solo voto. La votazione viene fatta a

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maggioranza qualificata ponderata, ossia i due terzi più uno dei voti ponderati dei membri presenti o rappresentati. L'organo di governo è il ComitatoEsecutivo, costituito dal presidente e dal vicepresidente dell'OIV, dal presidente e dal vicepresidente del Comitato Esecutivo, dal presidente delComitato Tecnico-Scientifico e da un delegato per ogni paese membro.Esiste poi un Comitato Tecnico-Scientifico e un Direttorio, con funzionedi intermediazione fra Comitato Tecnico-Scientifico e Direzione Generale.

Gu ARGOMENTI TECNICI VENGONO DISCUSSI DALLE SEGUENTI COMMISSIONI E SOTTOCOMMISSIONI:

1. Viticoltura;2. Enologia;

., unificazione dei metodi di analisi e di valutazione dei vini;3. Diritto ed Economia del settore vitivinicolo;

., vino, alimentazione e salute.

Argomenti specifici di carattere scientifico o tecnico, che fanno parte delpiano strategico approvato dall'Assemblea Generale, vengono studiati dagruppi di esperti, che in seguito propongono i loro risultati al ComitatoTecnico-Scientifico.Il settore viticolo e quello enologico dell'OIV sono suddivisi in sezioni; ilsettore enologico comprende le tre sezioni di chimica, tecnologia e microbiologia. Quest'ultima sezione si occupa di tutte le questioni e i problemiche riguardano la microbiologia enologica, fra i quali i metodi per i controlli e le analisi microbiologiche. La messa a punto dei metodi è affidataad una commissione, nominata dalla Presidenza, della quale fanno parteesperti di diversi Paesi; i metodi adottati sono pubblicati sul Bollettinodell'OIV e sono quelli che devono essere seguiti in caso di contestazioni odi certificazione della qualità.

Allo stato attuale, i metodi adottati dall'OIV sono riportati nella Recueil desméthodes internationales d'analyses.Tale raccolta è stata pubblicata per la prima volta nel 1962 ed attualmentevige la sesta edizione, pubblicata nel 2003.

<Comitato Esecutivo

<Comitato

Tecnico-Scientifico

I METODI DI ANALISI MICROBIOLOGICI SONO DUE:

1. l'analisi microbiologica (risoluzione oeno/95), che prevede la rilevazione, il riconoscimento ed il conteggio deimicrorganismi;2. la ricerca degli antisettici e degli inibitori della fermentazione: la prima parte di questa metodica prevede laricerca della presenza eventuale di una o più sostanze antifermentative, senza però precisarne la natura, attraverso un test di fermentescibilità di un vino. Trattandosi di un test aspecifico, laborioso, i cui risultati sono spesso didifficile interpretazione, l'opportunità di mantenerlo è attualmente oggetto di discussione presso la commissionemicrobiologia dell'DIV.

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Anche il metodo delle analisi microbiologiche dei mosti e dei vini è attualmente oggetto di revisione da parte di una commissione, alla quale è statoaffidato il compito di aggiornarle armonizzandole con le norme ISO.

ISO

ISO =International Standard Organization. Ha sede a Ginevra e persegue lo scopo della standardizzazione, stabilendo norme comuni per la costruzione e le caratteristiche qualitative delle merci, riconosciute da tutte leorganizzazioni industriali ed economiche, da enti governativi e di normazione. Gli standard ISO sono adottati ericonosciuti negli scambi commerciali, nelle certificazioni di conformità di merci e servizi nei settori pubblico eprivato.

L'aggiornamento prevede una loro semplificazione favorendo, quando èpossibile, il ricorso a materiali, mezzi colturali e attrezzature facilmentereperibili in commercio, in modo da facilitare la loro esecuzione anche neilaboratori che non siano dotati di molte attrezzature, ma che intendano fareil più ampio ricorso a materiali monouso e già sterilizzati (cioè materiali usae getta).

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02 I laboratori di microbiologia

2.1 Il laboratorio. Caratteristiche e funzioni

I laboratori di microbiologia che interessano il settore enologico possonoessere suddivisi in quattro diverse tipologie:

1. laboratori di ricerca;2. laboratori per il controllo ufficiale facenti parte di strutture nazionali direttamente o.indirettamente collegate conil SSN (Servizio Sanitario Nazionale);3. laboratori privati (spesso facenti parte di strutture pubbliche), accreditati alla certificazione, che svolgono serviziopubblico e i cui certificati sono riconosciuti in sede internazionale;4. laboratori interni per i controlli della qualità.

È ovvio che questi tipi di laboratori hanno differente complessità: i primisono laboratori specializzati dotati di strumentazione sofisticata, spesso limitata ad ambiti ristretti; i secondi devono essere attrezzati in modo da copriretutto il settore delle analisi microbiologiche; i terzi e, soprattutto, i quarti(quelli interni), possono anche avere attrezzature ridotte ed essere in grado dieseguire soltanto le analisi più semplici. Quello che in questa sede viene presoin esame e descritto è un laboratorio di questo ultimo tipo, che consental'esecuzione dei controlli e delle analisi dei mosti, dei vini e in generale delmateriale di cantina.Il laboratorio di microbiologia deve prevedere almeno due locali o areefisicamente separate: il laboratorio vero e proprio, che è l'area in cui sisvolgono le attività analitiche, e la cucina, dove avviene la preparazione deiterreni di coltura e dei materiali impiegati in laboratorio. Quest'ultima

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<sicurezza

<legge 626/94

può essere in comune con altri laboratori non di microbiologia. Negli ultimi anni si è assistito a una notevole diffusione di materiali pronti all'impiego o monouso (terreni di coltura e attrezzature in plastica), il cui usopuò rendere superfluo, soprattutto per le cantine di piccole dimensioni,l'allestimento di una cucina.Come primo requisito, un laboratorio deve rispondere a precise misure disicurezza dettate dalla legge e deve avere quindi adeguate vie di accesso e difuga, rilevatori di gas, allarmi, docce lavaocchi, attrezzatura di pronto soccorso, ecc. Per quanto l'argomento sia regolato da un'apposita normativa, laLegge 626/94 con le successive modifiche, che non è il caso di approfondire in questa sede, il primo requisito che un laboratorio deve possedere èquello di essere organizzato in modo da garantire la massima sicurezza a chivi opera o a chi vi entra. Il principio che ha mosso il legislatore è quello delbuon senso ed è basato sulle cosiddette "buone pratiche di laboratorio";tuttavia, non bisogna dimenticare che è proprio l'eccessiva confidenza che sitende a prendere nell'adottare pratiche e procedure ripetitive che fa sì che,talvolta, si tenda ad abbassare la guardia nei confronti dei possibili rischi perla salute e per l'incolumità propria e altrui.Senza entrare nel dettaglio della normativa, cui si rimanda fermamentequalora si volesse allestire un laboratorio di microbiologia, si suggerisconoalcune norme di comportamento elementari.

Norme di comportamento in laboratorio

-, Osservare le disposizioni e le istruzioni date dal responsabile/referente, allo scopo di assicurare la protezionecollettiva ed individuale.-, Utilizzare correttamente le apparecchiature, le attrezzature, gli utensili, le sostanze ed i preparati pericolosi,nonché i dispositivi di sicurezza e di protezione.-, Segnalare con immediatezza al responsabile/referente i guasti dei mezzi e dei dispositivi e le altre eventualicondizioni di pericolo.-, Non rimuovere o modificare i dispositivi di sicurezza, di segnalazione e di controllo.-, Non compiere operazioni o manovre che non siano di propria competenza o che possano compromettere lasicurezza propria o quella degli altri.-, Accedere ai laboratori solo con espressa autorizzazione del responsabile/referente, specialmente in quelli doveè segnalata la presenza di particolari pericoli.-, Non lavorare mai da soli in laboratorio.-, Osservare le norme ope~ative di sicurezza vigenti in ciascun laboratorio e attenersi strettamente alle disposizioniimpartite dal responsabile/referente e dagli incaricati, ai fini della protezione collettiva ed individuale.-, Osservare il divieto di fumare, di conservare e assumere cibi e bevande nei laboratori.-, Astenersi dall'effettuare manovre che possano compromettere la sicurezza, per le quali non si è stati autorizzatied adeguatamente addestrati a cura del responsabile/referente.-, Segnalare immediatamente al responsabile/referente o agli addetti qualsiasi malfunzionamento dei presidiprotezionistici o situazioni di pericolo di cui si venga a conoscenza, adoperandosi direttamente, nell'ambitodelle proprie competenze, per eliminare o ridurre tali deficienze o pericoli.-, Collaborare attivamente con il responsabilelreferente e con gli addetti ai servizi sicurezza, al fine di mantenereefficiente il sistema della sicurezza predisposto.-, Contribuire insieme al responsabile/referente ad adempiere a tutti gli obblighi imposti dall'autorità competenteo comunque necessari per tutelare la sicurezza e la salute.

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2.2_Gli ambienti e gli arredi fissi

Il laboratorio di microbiologia deve essere costituito da ambienti preferibilmente di dimensioni ridotte, da 15 a 20 m2 [Figura 1]. Nel caso di soluzioneminima, il laboratorio in senso stretto può essere costituito anche da un soloambiente, arredato con un banco di lavoro a muro, munito di attacchi per ilgas e di almeno un rubinetto per l'acqua (con lavandino). Il condizionamento dell'aria può essere causa d'inquinamento delle colture o delle piastre acausa delle turbolenze e correnti d'aria (sia pure deboli) che provoca, e chepossono tenere in sospensione e trasportare spore di muffa, polveri ed altriinquinanti: l'atmosfera del laboratorio di microbiologia deve essere il più possibile ferma. Pertanto, se si vuole installare un impianto di condizionamentodell'aria, è importante dotarlo di fUtri adeguati ed eseguire una scrupolosa eregolare manutenzione.La dotazione di impianti di servizio deve prevedere gas e acqua (meglio seanche calda); possono poi essere presenti una linea centralizzata di acquademineralizzata (conduttanza <5 mW/cm) e una linea del vuoto per la filtrazione sterilizzante. Limpianto elettrico deve garantire una buona potenza, perché si impiegano molti apparecchi riscaldanti: l'autoclave (un'autoclave di grosse dimensioni consuma fino a 9 kwh), gli agitatori magneticiriscaldanti, i termostati. Lilluminazione del laboratorio deve essere appropriata: 700-1500 lux è un buon intervallo di riferimento.La luce deve essere diffusa e non creare ombre fastidiose quando si lavora.

<impianti di servizio

.....If------------- 5 metri ---------------ì.~

Note: ".",' ,".".', ' , .

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[Figura 1]Schema di una possibile sistema·zione di un laboratorio minimo,ma funzionale, di microbiologia di15 m2 di superficie (5 metri x 3metri).A - Tavolo con pompa da vuoto.B - Banco fisso di lavoro, sulquale trovano posto l'apparatoper filtrazione e la centrifuga.C- Lavello grande e profondo.D- Termostati.E- Frigorifero.F- Tavolo per microscopia.G-Armadio.H- Cappa.

w3tllS.

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<cucina

<

microscopio ottico

<ingrandimenti<oculari<obiettivi

<accessori utili

Il laboratorio deve avere un'ampia dotazione di armadi provvisti di chiusureche evitino l'ingresso della polvere su vetreria e materiali. I banconi devonoavere superficie liscia, facile da lavare e sterilizzare, capace di resistere alla flambatura. In questo laboratorio non dovrebbero essere presenti le attrezzaturepreposte alla preparazione e alla sterilizzazione di terreni e materiali, comel'autoclave, un tavolo di lavoro e un lavandino per il lavaggio della vetreria,perché generano vapore, polveri e rumore. Tali operazioni vanno possibilmente eseguite in altro ambiente, tradizionalmente chiamato cucina (perché è illuogo nel quale si preparano i brodi di coltura), che deve essereprogettato in modo da consentire l'eliminazione del vapore d'acqua che si produce prima e durante la sterilizzazione in autoclave. Molte autoclavi di nuovaprogettazione prevedono il riciclo e la condensazione dei vapori in un circuito chiuso, per cui non producono vapore all'esterno. Nel caso di laboratoriannessi a cantina, la cucina può non essere presente.

2.3_Gli attrezzi

Il microscopio ottico

Il microscopio ottico è un attrezzo fondamentale per ogni laboratorio dimicrobiologia. Le sue prestazioni devono essere di buon livello; preferibilmente deve avere illuminazione in contrasto di fase ed essere binoculare, perevitare affaticamento della vista. Il microscopio deve dare ingrandimenti X

150, x 400, x 1000 e, pertanto, deve essere corredato di oculari X lO eobiettivi X 15, X 40, X 100 (quest'ultimo ad immersione). Gli obiettividevono essere di ottima qualità: quelli che coniugano meglio le prestazionicon il costo non eccessivo sono gli acromatici o, meglio, i planacromatici,perché sono dotati di una buona correzione delle aberrazioni cromatiche sututto il piano focalizzato.Il microscopio va sistemato lontano da finestre o fonti di luce intensa su untavolo da lavoro antivibrante. Devono essere a portata di mano i vetriniporta- e copri-oggetto, i contaglobuli, una piccola spruzzetta contenenteacqua distillata, olio per immersione, bunsen (anche lampada ad alcol), ansae filo di platino e tutto quanto serve per rendere ben visibili le colonie dellepiastre. Nelle vicinanze deve essere disponibile un lavello per poter fare lecolorazioni delle cellule, ma il microscopio deve ovviamente essere protettoda schizzi e umidità.Accessori utili sono l'oculare micrometrico, al cui interno è incisa una scalagraduata da 1 a 100, e un vetrino graduato (nel tipo più comune vi è incisauna scala di 1 millimetro, suddiviso in 100 sezioni da lO micrometri). Unavolta tarato sulla scala del vetrino, con l'oculare micrometrico è possibile misurare le dimensioni dei campioni sotto osservazione, e quindi delle cellule, maanche di eventuali particelle come cristalli o precipitati di varia origine, che avolte si possono trovare nei vini.Una parte molto importante del microscopio è rappresentata dal condensatore, l'apparato ottico situato sotto il tavolino che serve per l'illuminazione dei preparati. I microscopi più antichi ricevevano la luce da una finestra

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oppure da una lampadina ed erano muniti di uno specchio (concavo opiano) che orientava la luce direttamente verso le lenti del condensatore. Ilcondensatore è munito I di un diaframma che serve a regolare l'intensitàluminosa. Con l'illuminazione in campo chiaro, i raggi luminosi sono ortogonali rispetto al preparato e permettono di vedere i corpi oscuri (cellule,particelle varie, piccoli cristalli ecc.) presenti nel preparato stesso.Con l'illuminazione in campo oscuro (non usata in microbiologia enologica)il condensatore è congegnato in modo tale da illuminare il preparato lateralmente; il campo (cioè il fondo) rimane oscuro (nero), mentre le particellesospese nel preparato sono illuminate e diventano visibili.Con il cosiddetto contrasto di fase, la luce arriva sul preparato obliquamente. Il contrasto di fase è ottenuto per azione di un disco nero al centrodel condensatore, cosicché la luce passa attraverso un anello che crea unfascio di luce di forma conica; le particelle del preparato vengono illuminate obliquamente e uniformemente da tutti i lati. Si tratta, in definitiva,di una via di mezzo fra campo chiaro e campo oscuro. Cill1uminazione incontrasto di fase realizza una visione molto buona delle cellule microbichee, per questo motivo, è consigliabile. Tuttavia il sistema è un po' complesso e richiede una maggiore attenzione da parte dell'operatore in fase diregistrazione del condensatore.

I termostati

I termostati servono per l'incubazione delle colture alla temperatura piùidonea per il loro sviluppo. Un laboratorio di microbiologia deve averealmeno due termostati di dimensioni tali da poter contenere molte piastre,numerose provette e le giare per anaerobiosi. Indicativamente, le misureutili minime sono le seguenti:• base 0.6 m X 0.6 m;• altezza 0.6 m.I due termostati vanno mantenuti a differenti temperature per consentire lo sviluppo di microrganismi con diverse esigenze; quello che serve perl'incubazione di lieviti deve essere impostato a 25 ± 1°C, come è previstodal metodo OIV; Analyse microbiologique des vins et des mouts. Questosignifica che deve essere anche refrigerato: infatti, se l'ambiente non è condizionato, d'estate la temperatura ambiente è superiore; inoltre la temperatura impostata viene garantita solo se è superiore di almeno 5 gradi aquella ambiente. Caltro termostato può essere impostato sui 28-30 cC,cioè la temperatura ottimale di crescita dei Saccharomyces, in modo tale darendere più rapida la crescita di questi ultimi, qualora non si ricerchinoaltri lieviti.

<contrasto di fase

<temperature

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Se il laboratorio è accreditato per le analisi microbiologiche o fa parte diun'azienda certificata, la taratura dei termostati prevede la registrazione giornaliera della temperatura: una procedura diffusa prevede l'utilizzo simultaneo di un termometro a minima e massima (quelli domestici da metterefuori dalle finestre sono perfettamente idonei, purché vengano tarati conuna periodicità almeno annuale), e di un termometro con scala di l/IO digrado, immerso in 100 mL di glicerina o acqua distillata.

Il frigorifero<conservazione

<riscaldamento rapido

<sterilizzazione a freddo<controlli microbiologici

La presenza di un frigorifero a 4 °c è necessaria per la conservazione dicampioni di vario tipo da sottoporre ad analisi, per il mantenimento deimezzi nurritivi disidratati e per il migliore mantenimento di colture.Dunque è consigliabile prevedere due frigoriferi:• uno per la conservazione dei campioni in analisi;• un altro per i mezzi nutritivi, reattivi e tutto il materiale "pulito".I frigoriferi domestici sono perfettamente idonei a questo uso, purché ilvolume sia adeguato alle necessità. La temperatura deve essere mantenuta aldi sotto degli 8 DC, ma senza scendere sotto lo Odc. Spesso i reattivi da conservare refrigerati riportano in etichetta, come temperatura di conservazione, 5 ± 3°C: questa può essere presa come temperatura di riferimento perla taratura giornaliera, che può essere effettuata come quella dei termostati.

I congelatori

Un congelatore (T -20 °C)può essere utile per conservare reattivi, campionio partite di mosto da utilizzare per prove di fermentazione in periodi lontanidalla vendemmia. Nei congelatori (T -80°C) si possono conservare colturebatteriche (in mezzo colturale liquido contenente il 20% di glicerolo), ma nondi lieviti, che hanno una mortalità elevatissima al congelamento.

Il forno a microonde

Un forno a microonde è utile per il riscaldamento rapido di terreni colturali solidi conservati, già sterilizzati in flaconi chiusi. A questo scoposono più indicate le bottiglie in pirex con l'imboccatura larga e il tappo inplastica. Il cotone grezzo non è idoneo, perché assorbe le microonde e sisurriscalda eccessivamente: al limite, se il riscaldamento è prolungato, puòaddirittura carbonizzarsi.

L'apparato filtrante

Un sistema di filtrazione per piccoli volumi di liquido (da pochi mL a llitro) serve sia per la sterilizzazione a freddo di mosti, vini e mezzi nutritivi sia per l'esecuzione di alcuni controlli microbiologici. In generale siusano a questo scopo pompe aspiranti che fanno il vuoto al di sotto di unamembrana sterilizzante.

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Lapparato filtrante è costituito:• da una pompa da vuoto: può essere da rubinetto (tubo Venturi) o amotore;• dall'apparato filtrante vero e proprio.La pompa ad acqua è economica, costa infatti poche decine di euro e, se nonci sono problemi di approvvigionamento idrico (infatti maggiore è la portatad'acqua, maggiore è l'effetto aspirante), è perfettamente appropriata. Se lapressione della rete idrica è scarsa, si allungano i tempi di filtrazione.La pompa aspirante a motore non ha questi problemi, ma richiede l'installazione di una trappola, vale a dire un recipiente in cui è raccolto il liquidofiltrato, per evitare che questo penetri all'interno della pompa aspirante amotore, danneggiandola seriamente. Se la trappola è di grandi dimensioni,consente una notevole autonomia di lavoro, ma il suo svuotamento può essere difficoltoso; se, al contrario, è di piccole dimensioni, va scaricata spesso ela filtrazione può essere interrotta frequentemente. La pompa da vuoto puòessere anche centralizzata e collegata ad un impianto che serve più utenze.Lapparato filtrante vero e proprio è costituito da un imbuto sterile che puòalloggiare una membrana, anch'essa sterile, di porosità 0,45 !lm, attraverso laquale si filtra il campione. Limbuto può essere in materiale plastico monouso(che si acquista già sterile) o autoclavabile, oppure in vetro o in acciaio.Lacciaio è più costoso, ma più comodo del vetro, perché è meno fragile e sipuò sterilizzare rapidamente per flambatura, mentre il vetro va sterilizzatoobbligatoriamente in autoclave.Limbuto viene posizionato su una rampa in acciaio, cioè un tubo nel qualesono alloggiati più supporti in cui infilare diversi imbuti per filtrazione, oppure su una beuta da vuoto in vetro. La rampa o la beuta da vuoto è collegataalla pompa aspirante con un tubo in gomma spessa, idonea a sopportare ilvuoto.Sono disponibili in commercio anche sistemi costituiti da una pompa elettrica, dotata di un alloggiamento specifico per imbuti in plastica monousocon membrana premontata, da staccare dopo la filtrazione e sistemare sucartoncini impregnati di terreno, da reidratare con 2-3 mL di acqua sterileimmediatamente prima dell'uso.

La centrifuga

La centrifuga, anche di piccole dimensioni e di prestazioni medie, serve perla chiarificazione di campioni, per la concentrazione di depositi cellularie numerosi altri fini. Una centrifuga da tavolo in grado di generare una gravità di 5000 g può essere sufficiente, mentre il rotore deve portare 6-8 tubida 50 mL di capacità; se possibile, i tubi devono essere termoresistenti perpermetterne la sterilizzazione in autoclave.

<pompe aspiranti

<apparato filtrante

<

chiarificazionedi campioni

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La cucina<brodi nutritivi La cosiddetta cucina è l'ambiente nel quale si preparano i brodi nutritivi

per i microrganismi. Essa deve presentare i seguenti requisiti:• essere progettata in modo da consentire l'eliminazione dell'umidità;• avere pavimentazione impermeabile con scarico centrale a terra;• essere corredata di almeno un ampio e capiente lavello, che consenta ilcomodo lavaggio della vetreria più voluminosa.

NELLA CUCINA DEVONO TROVARE POSTO:

1. un ampio tavolo o banco, sul quale si distribuiscono i mezzi nutritivi nelle provette, nei matracci ecc.;2. una bilancia tecnica;3. un armadio contenente il materiale che serve per la preparazione del materiale destinato a sterilizzazione.

La cucina può essere dotata anche di una lavatrice per vetreria. Ma l'attrezzopiù qualificante e importante della cucina è l'autoclave.

L'autoclave

<autoclavia parete singolao doppia

<

ciclodi sterilizzazione

Il termine autoclave definisce un apparecchio metallico cavo, a chiusuraermetica, che permette di compiere operazioni o reazioni chimiche o fermentazioni a pressione superiore a quella atmosferica. In cantina possonoessere presenti due tipi di autoclave: quelle di grandi dimensioni usate per laproduzione di vini spumanti e quelle usate per la sterilizzazione.Le autoclavi per sterilizzazione hanno una capacità compresa fra 1-2 e 150 litrie sono, praticamente, grandi pentoloni con coperchio a chiusura ermetica.Le autoclavi possono essere a parete singola o doppia: in quelle a paretesingola l'acqua deionizzata che genera il vapore è collocata nel fondo dellacamera di sterilizzazione. Al di sopra del livello dell'acqua vi è un pianoforato sul quale si appoggiano i cestelli con il materiale da sterilizzare. Nelleautoclavi a parete doppia l'acqua è contenuta in una camera distinta cheavvolge quella di sterilizzazione. Il vapore viene generato in questa precamera e solo quando ha raggiunto la pressione e la temperatura desiderataè immesso nella camera di sterilizzazione.Quest'ultima può essere dotata di una pompa a vuoto per una pre-evacuazione dell'aria prima della sterilizzazione e per l'allontanamento rapido del vapore e l'asciugatura dei materiali al termine della sterilizzazione. Lautoclave aparete doppia trova pertanto impiego nella sterilizzazione di camici e materiali che devono uscire asciutti dal ciclo di sterilizzazione. Per un laboratoriodi microbiologia annesso ad una cantina è più che sufficiente un'autoclave aparete singola.Il ciclo di sterilizzazione comunemente usato in microbiologia è di 121°Cper 15 o 20 minuti. Poiché l'acqua bolle a 100°C, per poter raggiungere unatemperatura più elevata è necessario che la pressione sia superiore a quellaatmosferica: i 121 ° C si raggiungono, in ambiente saturo di vapore, quando la sovrappressione all'interno dell'autoclave è di l atm. Lallontanamentodi tutta l'aria è indispensabile per eseguire correttamente una sterilizzazione.

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L'aria è una pessima conduttrice di calore e ha una capacità termica inferiorea quella del vapore: chi ha un minimo di pratica di autoclavi sa che, se la sterilizzazione viene avviata frettolosamente, senza lasciar sfiatare adeguatamente tutta l'aria, ci si accorge poi che la salita della temperatura, soprattuttodegli ultimi gradi prima di raggiungere i 121°C, può essere di esasperantelentezza e, al limite, non si raggiunge mai la temperatura di sterilizzazione.Ogni autoclave deve essere dotata di sistemi di sicurezza per evitare pericoli adanno degli operatori: quelle attualmente in commercio danno la massimagaranzia, ma chi opera con attrezzature antiquate deve predisporre tutti gliaccorgimenti necessari a evitare incidenti che possono essere anche moltopericolosi. Si raccomanda poi di curare la manutenzione dell'autoclaveseguendo le istruzioni del costruttore, per evitare possibili sanzioni e pericoliper gli operatori.Anche nella preparazione dei materiali da sterilizzare è necessario rispettare alcune misure precauzionali. Per quanto riguarda il riempimento deirecipienti contenenti i mezzi di coltura (che sono sempre liquidi almomento della sterilizzazione), va tenuto presente prima di tutto che questi sono costituiti da soluzioni dense, soprattutto se contengono agar-agar,che saranno portate ad ebollizione; poi che l'aria contenuta nello spazio ditesta dovrà poter uscire dal recipiente senza ostacoli e senza creare sovrappressioni; e infine che si potrà formare schiuma quando si farà sfiatare ilvapore al termine del ciclo di sterilizzazione.Una buona regola è quella di riempire i recipienti, soprattutto le beute, almassimo fino al 50% della loro capienza. Ad esempio, dovendo sterilizzare500 mL di mezzo colturale in beuta, è indispensabile utilizzare una beutaalmeno da 1000 mL (inutile sottolineare che il vetro deve essere di tipo pirexo comunque resistente al calore). Se si usano bottiglie con tappo a vite, questo deve essere mantenuto allentato durante la sterilizzazione e va serrato solamente dopo che il materiale è stato estratto dall'autoclave al termine dellasterilizzazione. Le beute vanno tappate con cotone grezzo (non idrofilo!) nontroppo compresso, al di sopra del quale si mette carta grezza, tenuta ferma conun elastico, sulla quale si può scrivere a matita il contenuto. In generale, suogni contenitore da sottoporre a sterilizzazione è indispensabile indicare ladata e il contenuto ed è utile apporre un nastro adesivo che indichi, poi,l'avvenuta sterilizzazione. Si tratta di un nastro adesivo in carta, sul quale sonoimpresse delle linee di materiale che diventa nero a temperatura superiore a100-110°C.Questo sistema consente di distinguere con sicurezza il materiale già sterilizzato da quello ancora da sterilizzare, soprattutto se non si tratta di mezzi colturali ma di vetreria, puntali o materiale non liquido. :L'indicazione delladata (o del numero di lotto se richiesto da un sistema qualità aziendale) è

<preparazionedei materiali

Note: . .__. ._ . . .__. . .__._.

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indispensabile perché il materiale sterile ha una conservazione definita, chedipende dalla composizione e dalle condizioni ambientali: di seguito siriporta, a titolo di suggerimento, la durata di conservazione in frigorifero dialcuni materiali di laboratorio dopo la sterilizzazione:

Mezzi colturali agarizzati (in beuta o bottiglia)

Mezzi colturali agarizzati (scatole Petri già preparate)

Diluenti (in beuta o bottiglia)

Diluenti (in provette da 9 mL)

20 giorni

10 giorni

30 giorni

10 giorni

<ambiente sterile

A questo punto va sottolineato un concetto importante: a parte qualche raraeccezione, tutto il materiale che entra in contatto con un campione da esaminare deve essere sterile. La preparazione di un mezzo colturale e la sua sterilizzazione richiedono tempi che in pratica non sono mai inferiori ad un'ora ma,una volta iniziata la preparazione, questa non va interrotta fino alla fme dellasterilizzazione. Se, ad esempio, qualche contrattempo o imprevisto impediscedi portare a termine la sterilizzazione entro la fine della giornata di lavoro, imezzi non sterilizzati vanno gettati e rifatti il giorno successivo. È sbagliatopensare di preparare un terreno in una giornata e sterilizzarlo il giorno dopo,anche se lo sj conserva in frigorifero per la notte. È importante tenere a menteche i microrganismi sono onnipresenti e crescono non appena le condizioni lopermettono: in un mezzo colturale preparato e non sterilizzato, i batteri e lemuffe presenti negli ingredienti, nell'aria, nell'acqua e sulle superfici dei recipienti utilizzati, trovano le condizioni per nutrirsi e moltiplicarsi, ed inizianoa crescere sottraendo o degradando nutrienti, vitamine e composti minerali.Anche se la loro crescita non è visibile a occhio nudo, la composizione del terreno, soprattutto se è interamente sintetico e contiene elementi dosati inquantità misurata, può essere stata alterata in modo rilevante.

2.4_Altre attrezzature

Attrezzature quali bilance analitiche, pHmetri, apparecchi per analisi chimiche ecc., sono comuni con altri laboratori e trovano sistemazione in questiultimi. Nel laboratorio di microbiologia possono trovare utile impiego, oltre aquelle minime, le seguenti attrezzature specialistiche.

La cappa a flusso laminare

La cappa a flusso laminare non va confusa con la cappa aspirante che siutilizza nei laboratori di chimica per evitare all'operatore di respirare vapori tossici. La cappa a flusso laminare è un'attrezzatura all'interno dellaquale l'ambiente è sterile. Per ottenere questo effetto l'aria soffiata all'interno della cappa attraversa dei filtri assoluti (solitamente hanno una porosità nominale di 1 Jlm), con una velocità sufficientemente bassa perché ilflusso sia laminare e non turbolento.

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Il moto dei fluidi

Il moto dei fluidi, e quindi anche quello dell'aria, può essere laminare o turbolento. Il primo consiste in un moto incui le particelle seguono percorsi paralleli e non si rimescolano tra loro, mentre se la velocità delle particelle in unpunto cambia nel tempo in modo casuale, il moto è turbolento. Se il moto dell'aria è turbolento, questa può mantenere in sospensione anche per lungo tempo delle particelle solide molto leggere, come le spore delle muffe. L'arianegli ambienti di lavoro ha continue turbolenze ed è generalmente ricca di polveri e spore; ma se quest'aria vienefiltrata, e dopo la filtrazione non raccoglie altre particelle ed il suo flusso non ha più turbolenze, si mantiene sterile.La cappa a flusso laminare realizza questo principio: l'aria al suo interno si muove di moto laminare e non contieneparticelle in sospensione, quindi è sterile.

Esistono due tipi di cappe a flusso laminare, quelle a flusso orizzontale equelle a flusso verticale. Nelle prime l'aria è aspirata dall'alto e viene soffiataattraverso un filtro posto nella parete di fondo situata di fronte all'operatore:questo viene investito dal flusso di aria sterile, che esce alle sue spalle. Il pianodi lavoro è liscio (di solito in acciaio) e continuo. Nelle cappe a flusso verticale il piano di lavoro è forato, l'aria viene aspirata al di sotto di esso, passa dietro la parete di fondo e viene soffiata dall'alto verso il basso passando attraverso un filtro posto sulla parte superiore della zona di lavoro: in questo modol'operatore non è investito dal flusso, che a lungo andare può essere anchefastidioso, e l'aria all'interno dell'ambiente di lavoro è sempre la stessa in continuo ricircolo. Il piano di lavoro è forato in modo omogeneo, ad eccezionedella zona frontale, le cui aperture sono molto più fitte, per catturare quell'aria che viene i~evitabilmente portata all'interno dalle turbolenze causate daimovimenti dell'operatore. Un'apertura dotata di filtro, posta sul lato superiore della cappa, consente lo sfiato dell'aria in eccesso determinata da questoingresso di aria nuova dalI'esterno. In pratica, dunque, non tutta l'aria è incontinuo ricircolo, ma il ricambio non supera il 30% dell'aria movimentata.La cappa a flusso laminare descritta è un'attrezzatura che protegge il campione, più che l'operatore; negli ospedali e nei laboratori in cui si manipolanomateriali contenenti microrganismi pericolosi si usano cappe "biohazard",cioè che proteggono l'operatore: queste hanno un doppio motore e lavoranoin leggera depressione per evitare che in caso di guasto l'aria interna fuoriesca,dando così all'operatore il tempo necessario a mettersi in sicurezza. Nel casoin cui anche in cantina si manipolino sostanze potenzialmente pericolose (adesempio acque di scarico), non si deve pensare che la cappa a flusso laminaresia una protezione di per sé sufficiente ad evitare rischi.Perché una cappa funzioni bene, è necessario che il piano di lavoro sia il piùpossibile sgombro di materiale che potrebbe causare turbolenze; anche imovimenti dell'operatore devono essere misurati e mai violenti o improvvisi.La cappa a flusso laminare va accesa 5-10 minuti prima di iniziare il lavoro,

<tipologie di cappa

<

piano di lavoro

<cappe "biohazard"

19 " Il

_______ 1 102

<pulizia, sanitizzazione

<protezioni

in modo che il flusso al suo interno si sia stabilizzato e tutta l'aria sia passataattraverso i filtri. Se si prevede una breve interruzione del lavoro, è megliolasciare acceso il motore per evitare che entri aria inquinata. A questo proposito, alcune cappe prevedono una posizione di pausa, in cui il flusso non èspento, ma è solo abbassato. La pulizia e la sanitizzazione del piano dilavoro, soprattutto se è forato, devono essere effettuate con massimo scrupolo e frequenza, per evitare che sporcizia e residui di mezzi colturali,fuoriusciti durante la preparazione delle scatole Petri, diventino nicchie diinsediamento e moltiplicazione di microrganismi.Tutte le cappe prevedono la presenza di una lampada a raggi UV per la disinfezione dell'aria, da accendersi quando la cappa è inutilizzata. È importantissimo evitare che questa lampada sia accesa quando l'operatore è al lavoro: iraggi UV sono pericolosissimi per gli occhi e la pelle e possono causare seridanni, che si manifestano qualche ora dopo l'esposizione. Infatti nei modellidi costruzione recente esistono accorgimenti che impediscono l'accensionedella lampada UV se la cappa è aperta, ma nei modelli meno recenti il rischiodi esposizione è ancora presente. La funzione dei raggi UV è quella di mantenere l'aria sterile quando non è tenuta in circolazione dal motore. Va ricordato che i raggi UV si propagano in direzione rettilinea e sterilizzano solo le zoneche colpiscono; quindi, tutto ciò che è in ombra non è sterilizzato. Si ribadisce di tenere sempre sgombro il piano di lavoro, anche quando la cappa nonè in funzione, per consentire la corretta uccisione delle forme microbiche inturte le superfici interne alla zona di lavoro. Non è necessario tenere la lampada accesa tutta la notte, perché dopo circa 2000 ore di funzionamento l'emissione di raggi UV si riduce drasticamente. I..:accensione può essere limitata a10-15 minuti alla fine della giornata di lavoro e ad altrettanti minuti all'iniziodi quella successiva, prima dell'avvio del motore.Riguardo all'abbigliamento, l'operatore deve indossare un camice di cotonecon polsini chiusi con elastico e deve lavorare in asepsi con le stesse accortezze che userebbe operando fuori cappa: quindi, deve avere le mani pulite(o disinfettate), posizionarsi ben vicino alla cappa con i gomiti all'altezza delbordo del piano di lavoro e fare movimenti lenti e diretti. Quanto al bunsen, sotto cappa a flusso laminare non bisognerebbe usare fiamme, perchécreano turbolenza. Se si vuole usare un bunsen, è indispensabile impiegareun modello esplicitamente costruito per funzionare sotto cappa a flussolaminare, dotato di protezioni per la fiamma e che consenta una buonacombustione; inoltre il bunsen deve essere dotato di temporizzatore per faresì che la fiamma si spenga da sé dopo qualche istante. Comoda, ma nonindispensabile, è l'accensione a pedale. Sono da evitare i tradizionali bunsenda laboratorio, perché con questi il gas non brucia correttamente sottocappa e la cattiva combustione genera cattivi odori e gas pericolosi.

Il microscopio a epifluorescenza

Il microscopio a epifluorescenza è un normale microscopio che, oltre alsistema tradizionale di illuminazione del campione, è dotato di una lampada a raggi ultravioletti. Questi ultimi, prodotti dietro al sistema ottico, lo

Il Il 20


attraversano, escono dall'obiettivo e vanno a colpire il campione (questotipo di illuminazione si chiama appunto epilluminazione). Lobiettivo perepifluorescenza deve essere apocromatico e deve essere costituito da materiali non fluorescenti: alcuni hanno addirittura lenti al quarzo. Se il campioneemette fluorescenza, cioè se le sue molecole colpite dai raggi UV si eccitanoe riemettono parte della radiazione assorbita sotto forma di luce visibile, cheha lunghezza d'onda inferiore, esso viene visto attraverso l'obiettivo ed appare del colore corrispondente alla lunghezza d'onda della radiazione emessasu fondo scuro.Come si può immaginare, la quantità di luce emessa è molto bassa (ciò spiega anche la cattiva qualità delle fotografie di cellule viste all'epifluorescenza): pertanto, un obiettivo apocromatico dotato di grande apertura è indispensabile per una corretta visione delle cellule (vedi quanto segue). Un filtro in vetro neutro o colorato è posto dietro l'obiettivo e assorbe eventualiraggi UV riflessi che potrebbero colpire l'operatore. Per rendere le celluledei lieviti visibili all'epifluorescenza, si trattano con sostanze intercalantiche si legano ai loro acidi nucleici, come l'arancio acridina o l'eucrisina, inmodo differente se le cellule sono vive o morte. In seguito a questo trattamento, le cellule vive emettono luce verde, mentre quelle morte emettonoluce arancione. Le cellule batteriche, al contrario, trattate con gli stessiagenti emettono luce arancione se sono vive, e luce verde se sono morte.Il microscopio ad epifluorescenza consente di distinguere le cellule vive daquelle morte, quindi trova impiego nel controllo di sterilità dell'imbottigliamento dei vini oppure nel controllo dell'efficacia di un trattamento termico ochimico di sterilizzazione. Attualmente il suo utilizzo è in diminuzione, perché richiede l'uso di sostanze molto pericolose, per le quali è obbligatorioosservare procedure di manipolazione e di smaltimento appropriate. Il suo utilizzo è tuttora diffuso per il controllo iniziale del corretto funzionamento degliimpianti di imbottigliamento, perché consente di vedere, in 5-10 minuti, seun campione di vino contiene cellule e se queste sono vive o morte.

Il microscopio stereoscopico

Il cosiddetto binoculare (Foto Appendice 6) può essere utile per osservaresoggetti che richiedono un ingrandimento limitato, come piccole colonie,muffe ed altro. In particolare, è comodo per il conteggio delle colonie in piastre particolarmente fitte, in cui le colonie possono essere puntiformi e moltonumerose. Questo caso si verifica quando, in un campione analizzato, anchele piastre inoculate con il campione più diluito contengono un numero elevatissimo di colonie. Non sempre è possibile ripetere un'analisi che richiedegiorni di incubazione prima di dare un risultato: pertanto, è meglio evitare di

<

epilluminazione

<sostanze intercalanti

<binoculare

21 Il Il

--- 1 102

<illuminatore

<diluizioni seria li

<agitatori a vortice

<agitatori orbitali

<vetreria

<materiali usa e getta

esprimere un risultato come "incontabile" se il problema è l'eccessivonumero di colonie. È possibile infatti contare le colonie presenti in un'arealimitata di una piastra (pochi cm2) o di una membrana per filtrazione(pochi quadratini, se si usano membrane dotate di griglia inchiostrata) edesprimere il risultato, una volta moltiplicato il valore trovato nell'areacontata per l'area della piastra o della membrana, come "valore stimato".Per agevolare questo conteggio è opportuno un microscopio stereoscopico.È utile integrare l'illuminazione del microscopio con un illuminatore a fibreottiche a bracci orientabili, che devono essere diretti in modo da colpire ilcampione con luce radente. Questa procedura rende visibili anche piccolecolonie traslucide che potrebbero sfuggire a un'osservazione affrettata.

Gli agitatori

Per la preparazione di diluizioni seriali (diluizioni decimali) necessarie allaconta su piastra, si usano provette contenenti 9 mL di diluente, come acquapeptonata o soluzione fisiologica, in cui si aggiunge 1 mL del campione (odella diluizione precedente) e da cui si preleva poi 1 mL per la diluizionesuccessiva. Ad ogni passaggio, la provetta contenente la sospensione cellulare va mescolata per almeno 20-30 secondi, al fine di assicurarne l'omogeneità. A questo scopo si usano gli agitatori a vortice, che hanno una coppettadi gomma che gira su se stessa con moto leggermente eccentrico: sulla coppetta si appoggia il fondo della provetta e, tenendola premuta, nel liquido sicrea un vortice che lo agita efficacemente. Agitatori orbitali, o meglio,alternativi si possono impiegare per preparare colture cellulari liquide.

La vetreria e gli attrezzi minoriIn un laboratorio di microbiologia enologica è necessaria la presenza di alcunipiccoli attrezzi: porta-anse e porta-aghi, spatole metalliche, lancette metalliche, agitatore a vortice per provette, forbici, bisturi, lente d'ingrandimento,vetrini per microscopia. Il termine vetreria definisce quel materiale, appuntodi vetro, che serve per l'ordinario lavoro di un laboratorio di microbiologia:provette, scatole Petri, pipette (graduate o non graduate), matracci conici ematracci sferici di diversa capacità, siringhe, cilindri graduati ecc.

Il materiale "usa e getta"

Il termine di vetreria oggi è diventato in gran parte improprio perché la plastica ha sostituito molti pezzi, disponibili già sterilizzati e pronti per l'uso("usa e getta"). Devono essere ancora di vetro tutti i recipienti per liquididestinati alla sterilizzazione in autoclave quali provette, matracci conici(beute) e sferici, fialoni vari, becker. Possono essere di plastica vari arnesipluriuso (ad esempio i cilindri graduati) e arnesi monouso disponibili giàsterilizzati (pipette di ogni capacità, scatole Petri, siringhe, imbuti ed altriancora). La consultazione dei cataloghi messi a disposizione da varie ditteè necessaria per eseguire le scelte più idonee.

Il Il 22

03 I mezzi nutritivi

3.1 Funzioni e classificazioni

Per l'isolamento, il conteggio, lo studio e la coltivazione dei microrganismisono impiegati i mezzi nutritivi; questi devono contenere, disciolti in acquae a pH adeguato, i gruppi di composti di cui i microbi in esame necessitanoper la loro moltiplicazione:

\

1. composti del carbonio;2. composti azotati;

3. sali minerali;4. fattori di accrescimento (vitamine).

I mezzi nutritivi possono essere classificati in diverse maniere.In funzione dello stato fisico possono essere classificati in:• liquidi: in questo caso è appropriato il termine "mezzo";• solidi: per questi è più appropriato il termine "terreno" o "substrato".Per rendere solidi i mezzi si usa agar-agar alla concentrazione dell'1,5% circa.In funzione della composizione possono essere classificati in:• naturali, quali il mosto d'uva, il latte, il succo di pomodoro, il brodo dicarote, il brodo di carne ecc.;• semisintetici, ottenuti miscelando in acqua sostanze di composizione econcentrazioni note, con altre complesse; ad esempio, è semisintetico unmezzo contenente glucosio (fonte di carbonio), peptone (fonte di azoto sottoforma di peptidi), sali minerali, estratto di lievito (contenente vitamine e varicomposti azotati);• sintetici, se i componenti e le loro concentrazioni sono perfettamente noti.

<stato fisico

<composizione

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_______ 1 103

I MEUI NUTRITIVI, IN FUNZIONE DEL LORO IMPIEGO, SONO CLASSIFICATI NEL SEGUENTE MODO•

.., Di arricchimento. Quando un microrganismo è presente in numero esiguo rispetto ad altri, l'isolamento diretto nonè possibile. Lo si fa sviluppare, allora, in un meuo che per la sua composizione ne favorisce lo sviluppo a scapito deglialtri. La coltura si arricchisce del microrganismo che interessa e quindi il meuo è detto "di arricchimenton •

I meui di arricchimento sono sempre liquidi.

.., Di isolamento. Servono a isolare, direttamente da un mezzo in fermentazione o da un mezzo di arricchimento, imicrorganismi che interessano. Sono sempre solidi e la loro composizione deve essere conforme alle esigenze delmicrorganismo da isolare.

.., Di mantenimento. Servono a mantenere le colture pure nelle collezioni. Generalmente sono solidi.

.., Minimi. Contengono tutto ciò che serve allo sviluppo di una certa specie microbica, ma niente di più. Servono allostudio delle esigenze nutritive e alla selezione di mutanti. I mezzi nutritivi minimi sono sempre sintetici.

.., Specifici o selettivi. Permettono lo sviluppo (o solamente il riconoscimento) e il conteggio di una certa speciemicrobica o di un determinato gruppo microbico, grazie alla presenza di indicatori di variazioni di pH o di agentiselettivi come antibiotici e sali biliari. I terreni selettivi consentono di rendere evidente e quantificare la presenza dimicrorganismi, anche quando questi costituiscono una frazione limitatissima rispetto alla microflora (microbiota)dominante di un certo ambiente. Sono dunque utilissimi anche per l'isolamento di questi organismi.

<terreni non selettivi

<forma disidratata

<prodotti commerciali

LUSO di terreni selettivi necessita di qualche precauzione, quando sivoglia eseguire un isolamento che prevede di ottenere una coltura puradiscendente da una singola colonia. Questo richiede almeno tre trapiantisuccessivi in terreno non selettivo. Se infatti, assieme alle cellule da isolare, viene raccolta una piccola quantità delle cellule dominanti e la colturasi trapianta sempre in terreno selettivo, le cellule dominanti possono continuare a contaminare la coltura in purificazione senza mai poter crescerein modo evidente.Al contrario, se le colture si trapiantano in terreni non selettivi (che anziconsentono il massimo sviluppo a tutti i microrganismi presenti), allora sipuò essere sicuri che gli organismi isolati non contengono contaminanti.

3.2_1 preparati del commercio

Molti mezzi e terreni nutritivi, almeno quelli d'impiego più comune, sonoprodotti industrialmente e commercializzati sotto forma disidratata inbarattoli di vetro o plastica; in etichetta sono elencati gli ingredienti, è precisata la finalità del prodotto, sono fornite le istruzioni per la sua preparazionee la sua sterilizzazione.I prodotti commerciali sono molto igroscopici, pertanto si reidratano confacilità e si impaccano. Al momento del loro acquisto è bene valutare attentamente le necessità del laboratorio e non esagerare in quantità, anche perché alcuni di essi hanno una scadenza molto breve. Questo a parte, essidevono essere mantenuti con alcuni accorgimenti: la cosa migliore è quindiconservarli in essiccatori oppure in frigorifero, mai in comuni armadi.Chi invece non intende preparare da sé i terreni, può trovare sul mercatopiastre pronte contenenti i terreni agarizzati oppure piastre contenenti un

Il Il 24


cartoncino impregnato di terreno, che va reidratato con pochi mL di acquasterile (si prepara con una siringa su cui si monta un filtrino sterilizzantemonouso) e sul quale si può mettere la membrana su cui si è filtrato il vino[FILTRAZIONE STERILIZZANTE, a p. 106].

3.3_Mezzi e terreni per lieviti

I lieviti per moltiplicarsi devono disporre dei seguenti composti.• Composti del carbonio, rappresentati da zuccheri. Il glucosio (cosìcome il fruttosio ed il mannosio) è utilizzato da tutti i lieviti. Il galattosio, idisaccaridi e i trisaccaridi sono utilizzati da alcune specie e non da altre.I pentosi non sono fermentati.• Composti azotati. I lieviti utilizzano tutti i composti azotati che, comegrado di complessità, sono compresi fra l'ammoniaca e i peptidi; non initrati (salvo eccezioni) e non le proteine.• Sali minerali. I lieviti richiedono la presenza di fosfati, solfati, sali dipotassio, calcio, magnesio e di altri elementi a bassa concentrazione.• Fattori di accrescimento (vitamine). Le vitamine richieste dai lieviti sonoquelle idrosolubili rappresentate da biotina, acido pantotenico, piridossina,niacina, tiamina, inositolo.• Sostanze tampone. Non sono nutrienti, ma servono ad evitare che lasottrazione di qualche composto basico (soprattutto l'ammonio) e l'escrezione di prodotti acidi da parte delle cellule in crescita, faccia diminuire eccessivamente il pH del mezzo. Gli estratti da prodotti naturali (di lievito, dicarne, di malto ... ) ed i peptoni ottenuti dall'idrolisi di proteine animali ovegetali sono di solito sufficientemente tamponati. Se questi sono fra gliingredienti principali, l'aggiunta di un sistema tampone non è necessaria. Seinvece i nutrienti forniti sono di natura inorganica, spesso è necessarioaggiungere un sistema tampone: questo deve essere costituito da compostinon tossici e non assimilabili dalle cellule in crescita; generalmente si usa untampone fosfato.

I PIÙ COMUNI MEZZI NUTRITM PER I LIEVITI

Mezzo di Sabouraud

<composti del carbonio

<composti azotati

<sali minerali

<vitamine

<sostanze tampone

<estratti naturali

Il mezzo di Sabouraud ha la composizione riportata in tabella.Il peptone (non purificato) serve anche -G-lu-c-o-si-o-----------------4-0-gcome fonte di vitamine e di sali minerali. Il Peptone 10 9Sabouraud, sia come brodo sia come terre-

Acqua distillata 1 litrono solido, è prodotto industrialmente ed è

Come terreno solido:reperibile in commercio allo stato disidrata-to. Esistono anche formulazioni nelle quali _+_A_ga_r 15_g_

25 Il Il

---- 1 103

20 920 910 91 litro

15 9

15 95g

3g3g

1 litro

15 9

Glucosio

Peptone

Estratto di lievito

Potassio fosfato monobasico (KHl04)

Potassio cloruro (KCI)

Calcio cloruro (CaCl2)

Magnesio solfato (MgS04) \

Cloruro ferrico (FeCl3)

Manganese solfato (MnS04)

Verde di bromocresolo1

Acqua distillata

(Agar)

50 95g

4g

0.55 9

0.425 9

0.125 90.125 9

0.0025 9

0.0025 90.0022 91 litro

15-20 9

<mantenimento

Glucosio

Peptone

Estratto di lievito

Acqua distillata(Agar)

Glucosio

Peptone

Estratto di lievito

Estratto di malto

Acqua distillata

(Agar)

I Il verde di bromocresolo' vasciolto in circa lO mL di etanolo e poi aggiunto al mezzo:l'eranolo si disperderà con lasrerilizzazione.

il glucosio è sostituito con altri zuccheri. Il Sabouraud è comunementeusato per il mantenimento delle colture di collezione, per gli isolamenti ei conteggi.

Mezzo YPG (Yeast Extract, Peptone, Glucose)

È molto simile al precedente,dal quale differisce sostanzialmente per la presenza diestratto di lievito, e vieneusato per gli stessi fini. Ha la

. . . .compOSlZiOne nportata III

tabella. Viene preparato in laboratorio miscelando i vari componenti, la cuiconcentrazione può subire variazioni in funzione di esigenze particolari.

Malto (YM)

Il malto rappresenta la materia prima per la produzione della birra ed il suoinfuso in acqua è usato per la preparazione di un mezzo nutritivo, anche aga

rizzato. Un tempo era molto impiegato pergli stessi fini dei precedenti, oggi lo è moltomeno. Il Malto-brodo e il Malto-agar sonopreparati allo stato disidratato e si trovano incommercio con la composizione esposta afianco. Il terreno al malto è comunementeusato per il mantenimento delle colture dicollezione, per gli isolamenti e per i conteggi.

WL Nutrient Medium (WL Nutrient Agar)

È un terreno messo a punto neglianni '50 per il controllo microbiologico della birra nei WallersteinLaboratories in Canada; pertanto, èun terreno di isolamento e non dimantenimento. Esso si trova in commercio in forma disidratata e ha lacomposizione presente in tabella.Il verde di bromocresolo è un indicatore di pH che ha un punto dì viraggio intorno a pH 5.0-5.5. Su questoterreno crescono praticamente tutti ilieviti enologici e molti batteri acetici,mentre la crescita dei batteri lattici èstentata. Le colonie di alcuni lieviti si

differenziano agevolmente: i lieviti apiculati danno colonie piatte di coloreverde intenso; i lieviti buoni fermentatori (Saccharomyces, Tòrulaspora,Zygosaccharomyces) , ma anche altre specie, danno colonie color crema,umbonate e di consistenza burrosa. Candida stellata cresce con colonie a

Il Il 26


cupolalumbonate di colore verde più chiaro rispetto ai lieviti apiculati;Pichia anomala dà colonie azzurrine o grigiastre, farinose o talvolta mucose;lieviti ossidativi (Pichia membranifaciens, Candida vini) danno colonie chiare o grigiastre, dall'aspetto rugoso; Brettanomyces/Dekkera danno coloniechiare a cupola a crescita lenta, ecc.Le colonie di alcuni lieviti che producono molto acido acetico, come iBrettanomyces/Dekkera o certi Zygosaccharomyces, si circondano di un evidentealone chiaro e tendono a perdere rapidamente vitalità per l'accumulo dell'acido. Per evitare questo problema si possono aggiungere al terreno 30 glI di calcio carbonato (CaC03) per neutralizzare l'eccesso di acidità. Il carbonato dicalcio, insolubile in acqua, mantiene opaco il terreno, mentre i lieviti forti produttori di acido acetico sono circondati da un alone trasparente, dovuto allareazione del carbonato di calcio con l'acido acetico, che dà acetato di calcio(solubile in acqua e quindi trasparente) e acido carbonico, che si allontana dalterreno come CO2, e le colonie possono crescere fino a maggiori dimensioni.raggiunta del carbonato di calcio al terreno richiede qualche accortezza,perché il terreno sterilizzato, ma ancora caldo (45-50 DC), va mantenuto incontinua agitazione per evitare che tutto il carbonato si depositi sul fondo;anche le piastre vanno agitate fino alla solidificazione dell'agar-agar.

Agar-lisina

Terreno selettivo che consente lo sviluppo di quasi tutti i lieviti con l'importante eccezione di quelli appartenenti al genere Saccharomyces. La composizione è complessa: è costituito da un Yeast Carbon Base [TERRENI SINTETICI, a p.28], in cui vanno aggiunti, come unica fonte di azoto, 0.5 glI di lisina cloridrato. Si trova in commercio già pronto. La via metabolica con cui i lievitiSaccharomyces assimilano la lisina, comporta l'accumulo di un intermediotossico, peculiarità che non hanno gli altri lieviti. Se la lisina costituisce unapiccola parte della frazione azotata disponibile, come normalmente avviene inun substrato complesso, il Saccharomyces non ha problemi di sorta; ma se èl'unica fonte di azoto disponibile, l'accumulo dell'intermedio tossico uccidela cellula. Se dunque un terreno colturale contiene lisina come unica fonte diazoto; esso non renderà possibile la crescita ai lieviti dominanti la fermentazione, ma consentirà quella dei contaminanti, permettendone il conteggioanche se sono presenti in quantità molto inferiore rispetto al Saccharomyces.ragar lisina è un terreno selettivo, ma è idoneo anche per gli isolamenti e peri conteggi. Questo terreno non va sterilizzato in autoclave, ma va portato adebollizione e versato nelle scatole Petri immediatamente prima dell'uso.

Agar-acetato

Terreno molto povero, impiegato per indurre la sporificazione, particolarmente nelle specie del genere Saccharomyces. Per sporificare, le cellule giovaninon devono moltiplicarsi, ma respirano intensamente e hanno bisogno

<acido acetico

<sporificazione

27 Il Il

_______ 1 103

Sodio acetato

Agar purificato

Acqua distillata

1 91.5-2.0 9

1 litro

di composti dai quali trarre energia (in questo caso,l'acetato di sodio). Questo terreno ha la composizione riportata in tabella. Inoltre esso è preparato inlaboratorio e non si trova in commercio.

Mezzo sintetico

<mezzo di Wickerham

Diversi mezzi sintetici sono stati proposti per lo studio delle esigenze nutritive dei lieviti e per la loro caratterizzazione da questo punto di vista.Attualmente viene impiegato il mezzo formulato da Wickerham nel 1951,disponibile in commercio con differenti formulazioni, a seconda del tipo diprova siluppata, come visualizzabile in Tabella 2.

Per lo studioYeast nitrogen base Yeast carbon base Per

Ingredientidella

per prove per prove di determinazione Mezzoper litro

morfologiadi assimilazione assimilazione di richieste basale

composti del carbonio composti azotati di vitamine

Fonti di N

Ammonio solfato 3.5 9 5.0 9 5.0 9 5.0 9Asparagina 1.5 9Fonti di C

Glucosio 10 9 10 9 10 9 10 9Aminoacidi

L-istidina 10 mg 10 mg 1 mg 10 mg

DL-metionina 20 mg 20 mg 2 mg 20 mg

DL-triptofano 20 mg 20 mg 2 mg 20 mg

Vitamine

Biotina 20 mg 20 mg 20 mg 20 mg

Ca pantotenato 2 mg 2 mg 2 mg 2 mg

Ac. folico 2 mg 2 mg 2 mg 2 mg

Inositolo 10 mg 10 mg 10 mg 10 mg

Ac. nicotinico 400 mg 400 mg 400 mg 400 mg

Piridossina HCI 400 mg 400 mg 400 mg 400 mg

Tiamina HCI 400 mg 400 mg 400 mg 400 mg

Riboflavina 200 mg 200 mg 200 mg 200 mg

Ac. p-aminobenz. 200 mg 200 mg 200 mg 200 mg

Microelementi

Ac. borico 500 mg 500 mg 500 mg 500 mg 500 mg

Cu solfato 40 mg 40 mg 40 mg 40 mg 40 mg

K ioduro 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg

Fe cloruro 200 mg 200 mg 200 mg 200 mg 200 mg

Mn solfato 400 mg 400 mg 400 mg 400 mg 400 mg

Na molibdato 200 mg 200 mg 200 mg 200 mg 200 mg

Zn solfato 400 mg 400 mg 400 mg 400 mg 400 mg

Il Il 28

• Parte Prima Generale I I I I

Sali

1 9

10 95g

20 91 litro

0.15 9

0.1 90.1 9

0.85 9

0.5 9

0.1 90.1 9

0.85 9

0.5 90.15 9

[Tabella 2]Differenti formulazioni del formulatodi Wickerham (1951).

0.1 90.1 9

0.15 9

0.5 9

0.85 9

Glucosio

Peptone

NaCl

Agar

Acqua distillata

0.15 9

0.1 9

0.1 9

0.5 9

0.85 9

Gorodkowa-agar

0.1 90.1 9

0.5 9

0.85 9

0.15 9

Terreno nutntlvo che serve perdeterminare la capacità e la modalitàdi sporificazione. Questo terreno è

più ricco del precedente e consenteun preventivo e moderato sviluppodelle cellule. Ha la composizioneillustrata a fianco in tabella.Viene preparato in laboratorio e non si trova in commercio.

Kfosfato dibasico

Kfosfato

monobasico

Mg solfato

Na cloruro

Ca cloruro

Terreno BiGGY

Estratto di lievito

Glicina

Glucosio

Indicatore al soltito di bismuto

Acqua distillata

Agar

pH finale

Si tratta di un substrato che è caratterizzato da un componente, vale a direil solfito di bismuto, che serve per la determinazione della capacità di formare idrogeno solforato. È stato formulato per la diagnosi e l'identificazione di lieviti del genere Candida, ma è comunemente impiegato ancheper la caratterizzazione di altri lieviti,Saccharomyces in particolare. I ceppi dilievito, strisciati su questo terreno in piastra, sono bianchi oppure più o menoscuri (da bruni chiari a neri per formazione di solfuro di bismuto), in funzionedella capacità di produzione di H 2S.Il terreno BiGGY ha la composizioneesposta a fianco.Questo terreno è difficilmente preparabilein laboratorio (il solfito di bismuto è molto instabile), ma viene prodottoindustrialmente da varie ditte ed è reperibile in commercio allo stato disidratato o già pronto in piastra. Non va sterilizzato in autoclave, ma deveessere portato ad ebollizione in bagnomaria e successivamente versato inpiastra al momento dell'uso.

<idrogeno solforato

1 9

10 910 98g

1 litro

20 96.8

29 Il Il

_______ 1 103

Antibiotici

I più comuni terreni per i lieviti, ad esempio il Sabouraud e YPG, sonogenerici e possono consentire lo sviluppo anche di numerosi batteri. Perimpedire che la presenza di colonie batteriche possa ostacolare l'esame dipiastre d'isolamento o di conteggio, talvolta si aggiunge al terreno un antibiotico antibatterico. Questo può essere fatto con l'aggiunta alla piastra diuna punta di spatola di streptomicina, prima del versamento del terreno.

3.4_1 terreni per batteri lattici

I batteri lattici sono molto esigenti sotto l'aspetto nutrizionale: per questonon esistono terreni veramente selettivi, nel senso che i terreni che ne consentono lo sviluppo sono molto ricchi e quindi difficilmente in grado di inibirela crescita di altri microrganismi acido-tolleranti (soprattutto dei lieviti). Perquesto si aggiungono spesso sostanze che inibiscono la crescita dei lieviti.

NOTA

I batteri lattici sono anaerobi facoltativi. Per ottenere i migliori risultati è bene mettere le piastre in giare per anaerobiosi. Le giare per anaerobiosi sono dei cilindri di vetro spesso o di plastica robusta e trasparente, di diametrotale da contenere piastre di 10 cm allocate in apposito cestello. Esse hanno un coperchio con guarnizione di gommae un'appendice laterale collegabile con pompa da vuoto. All'interno si trova un sito nel quale si mette una busta concomposti che assorbono l'ossigeno.I terreni per batteri lattici possono consentire anche lo sviluppo di lieviti. Questo può essere evitato con l'aggiunta aiterreni di sorbato di potassio allo 0.05%, o con Cicloesimide (Actidione) 0,010 gli, un antibiotico al quale sono sensibili molti lieviti, ma non alcuni lieviti di interesse enologico, come gli apiculati e quelli appartenenti al genereDekkera/Brettanomyces.


<composti azotati

<sali minerali<vitamine

I mezzi nutritivi per batteri lattici devono contenere i seguenti composti.• Composti del carbonio. I batteri lattici richiedono la presenza di glucosio o di altro zucchero fermentescibile. Quelli tipici del vino sono capaci difermentare anche i pentosi quali lo xilosio e l'arabinosio. [acido malico puòessere fermentato (fermentazione malolattica), ma soltanto se sono presentizuccheri.• Composti azotati. I batteri lattici non hanno la capacità di sintetizzaregli aminoacidi e, per questo, li devono trovare disponibili nel mezzo. Essisviluppano quindi in presenza di miscele di aminoacidi o in presenza di peptidi. Non utilizzano i composti inorganici dell'azoto (qual è l'ammoniaca) enon utilizzano le proteine.• Sali minerali. I composti richiesti sono gli stessi già elencati per i lieviti.• Vitamine. Le esigenze di vitamine dei batteri lattici sono molto alte. Essirichiedono la presenza di biotina, tiamina, riboflavina, acido nicotinico, piridossina, acido folico, acido pantotenico. Va poi rilevato che i batteri lattici,particolarmente quelli del vino, hanno capacità di sviluppo a basso valore dipH. Pertanto questa loro caratteristica viene sfruttata per la formulazione diterreni dotati di un certo grado di selettività.

Il Il 30


Terreno ATB

Peptone

Estratto di lievito

MgS04 • 7 H20

MnS04 • 4 H20

Succo di pomodoro (succo di mela o di uva)

Acqua distillata

pH finale

Peptone

Estratto di lievito

MgS04 · 7 H20

MnS04 • 4 H20

Succo di pomodoro (succo di mela o di uva)

Acqua distillata

pH finale

Glucosio

È particolarmente consigliato per l'isolamento di Oenococcus oeni.Il succo di pomodoro, necessario per il migliore sviluppo del batterio, siottiene per spremitura di frutti maturi seguita da fùtrazione. La selettività èassicurata dal basso valore dipH. Al posto del succo dipomodoro, la cui preparazionepuò essere laboriosa, si possonousare in alternativa succhi limpidi di mela oppure di uva, traquelli disponibili in commercio, dopo avere verificato chenon contengano conservanti.

Terreno er Leuconostoc oenos (Oenococcus oem)

È una modifica del precedente, di

cui ha la stessa composizione, ma

con in più il glucosio.

Immediatamente prima della prepa

razione delle piastre si aggiunge,

inoltre, il 5% di una soluzione di

cisteina HCl (1 g in 100 mL),

anch'essa portata a pH 4.8, che crea

un ambiente più ridotto all'interno

del terreno e consente un migliore sviluppo delle colonie.

Terreno di Weiller e Radler

10 95g

0.2 90.05 9

25% (voi/voi)

fino a 1 litro

4.8

10 95g

0.2 90.05 9

25% (voi/voi)

fino a 1 litro

4.8

10 9

È un terreno generico con- ------------------------------:sigliato da Weiller e Radler Peptone 5 9

Estratto di lievito 5 9per l'isolamento dei batterilattici del vino. La sua com- Glucosio 10 9posizione è illustrata nella Diammonio citrato 2 9tabella a fianco. MgS04 • 7 H20 0.5 9È opportuno ricordare che MnS04 • 4 H20 0.2 9con questo terreno di coltu- FeS04 • 7 H20 0.05 9ra gli Autori che l'hanno Agar 15 9

proposto hanno ottenuto Acqua distillata 1 litroottimi risultati. pH finale 5.3-5.4

31 Il Il

_______ 1 103

Terreno SL

Try ticase 10 9-=._-==Estratto di lievito 5 9

KHl04 6 9Diammonio citrato 2 9

MgS04 • 7 H20_:;;;;;;::=====~====::,==;;~_ 0.58 9MnS04 • 4 H20 0.28 9

Glucosio 10 9Arabinosio 5 9

Saccarosio 5 9Tween 80 1 mL ;;;";;,,,0==Na acetato 3 H20 2.5 9

Acido acetico fino a pH 5.4

Acqua distillata 1 litro

(Agar) 15 9

Terreno MRS

Peptone 10 9

Estratto di carne 10 9Estratto di lievito 5 9

~~ 2gDiammonio citrato 2 9Glucosio ~==================--";::;::::20~g:;;:;:';':===-

Tween 80 1 mL-_•.-;::~~==~==~~==:;;;:;;::;;;:=::=:;;==-Na acetato 5 9MgS04 · 7 H20 0.58 9MnS04 • 4 H20 0.28 9(Agar) ============= 15 9

pH finale 6.2-6.4

3.5_Mezzi e terreni per batteri acetici

È un terreno proposto daRogosa et al. per l'isolamento di lattobacilli. Laselettività è conferita dalbasso valore di pH e dallapresenza di forti quantitàdi acido acetico che inibiscono lo sviluppo di altribatteri. Ha la composizione riportata a fianco intabella.L'acido acetico, in soluzione acquosa al 10%, èaggiunto goccia a gocciafino al raggiungimento delpH voluto.

Prende il nome dalle iniziali degli Autori che l'hannoproposto (de Man, Rogosa,Sharpe). È generico, nonselettivo e viene usato per ilmantenimento delle colture. Il mezzo MRS viene preparato industrialmente danumerose ditte ed è disponibile in commercio allostato disidratato. Ha lacompOSlZlOne nportatanella tabella a fianco.

<batteri acetici


I batteri acetici non hanno particolari esigenze nurrizionali e possonoquindi sviluppare in mezzi relativamente semplici.Essi devono trovare disciolti in acqua i seguenti gruppi di composti.• Composti del carbonio. I composti del carbonio possono essere rappresentati da glucosio (preferito dalle specie del genere Gluconobacter), maanche da etanolo (preferito dalle specie del genere Acetobacter) oppure daacido acetico o acido lattico. Certamente la scelta dell'uno o dell'altrocomposto per la preparazione dei terreni dipende dai risultati che sivogliono conseguire.

Il Il 32


Estratto di lievitoCaC03

EtanoloAcqua distillataAgar

pH finale

Estratto di lievito

Glucosio

CaC03

Agar

Acqua distillata

• Composti azotati. I batteri acetici sviluppano bene in presenza di miscele di aminoacidi oppure di peptidi. Molti ceppi (ma non tutti) sviluppanoanche in presenza di soli sali ammoniacali.• Sali minerali. Sono gli stessi già elencati per i lieviti.• Vitamine. La maggior parte dei ceppi di Acetobacter non necessita di vitamine per lo sviluppo. Talvolta sono richiesti l'acido pantotenico, l'acidop-aminobenzoico e l'acido nicotinico. Da Gluconobacter è richiesta la tiamina.Per l'isolamento, l'arricchimento ed il mantenimento dei batteri aceticisono stati proposti numerosi terreni.Date le loro modeste esigenze nutrizionali, essi possono sviluppare anche suterreni generici fra i quali quelli dei lieviti e dei batteri lattici. Va ricordato \che sono strettamente aerobi e hanno ottimo di temperatura a livello dicirca 30°C.

Terreno all'etanolo

Questo terreno è stato proposto da Frateurnel 1950; è specifico per gli acetobatteri deigeneri Acetobacter e Gluconobacter e consente lo sviluppo di tutti i ceppi dei due generi.Ha la composizione illustrata a fianco intabella. Il terreno va preparato senza etanoloche viene poi aggiunto in piastra al momentodell'uso in volume adeguato. Gli Acetobacter,sviluppando su questo terreno, formano acido acetico che scioglie il carbonato provocando la formazione di 4n alone attorno alla colonia (o allo striscio).In seguito a surossidazione, il carbonato di calcio si rideposita. Gluconobacternon rideposita il CaC03.

Terreno GYC

È il terreno standard per tutti i batteri acetici,sia del genere Acetobacter sia del genereGluconobacter, semplice da preparare e ottimoper il mantenimento delle coltur~; può essereusato anche per l'isolamento e il conteggioma, in questo caso, è necessaria l'aggiunta dicomposti (acido sorbico o pimaricina) cheinibiscono lo sviluppo dei lieviti. Esso ha la composizione illustrata a fiancoin tabella.Il carbonato di calcio neutralizza l'acidità prodotta dai batteri e consente unamaggiore vitalità delle colture.

<composti azotati

<sali minerali

<vitamine

10 920 920 ml

1 litro

20 96-7

10 950 9

30 9

25 91 litro

33 Il Il

_______ 1 103

Terreno al mannitolo (MYP)

Estratto di lievitoMannitoloPeptoneAgarAcqua distillata

5g25 93g20 91 litro

È adatto allo sviluppo sia di Acetobacterche di Gluconobacter. La sua selettivitàè data dalla presenza di mannitolo, utilizzato da un numero ristretto di batteri, come unica fonte di carbonio. Ha lacomposizione riportata in tabella.

10 95g5g10 mL1 litro

GlucosioCasamino acidsEstratto di lievitoSucco di pomodoroAcqua distillatapH portato a 5

<enterobatteri

<Escherichia coli

Terreno di Lafon-Lafourcade e Joyeux

È consigliato dagli Autori per l'isolamento degli acetobatteri dei due generi da mosti e da vini, nei qualipossono essere presenti molti altri microrganismi,lieviti in particolare. È indicato anche per i conteggi.Ha la composizione rappresentata in tabella a fianco.Il succo di pomodoro è ottenuto per spremitura esuccessiva chiarificazione per centrifugazione.

Al momento dell'uso, 5 mL del mezzo liquido (già inoculati) sono versati inpiastra, previa aggiunta di:• 0,1 mL di soluzione di pimaricina allo 0,5%;• 0,1 mL di soluzione di penicillina allo 0,25%.Loperazione è completata con l'aggiunta di 5 mL di soluzione di agar al 3%.La pimaricina serve per impedire lo sviluppo di lieviti; la penicillina, allaquale i batteri acetici sono resistenti, impedisce lo sviluppo di altri batteri,lattici in particolare.

3.6_Terreni per enterobatteri

Gli enterobatteri costituiscono un gruppo molto numeroso di batteri tipicamente intestinali e fecali, alcuni dei quali (le salmonelle) sono anche patogeni. La loro determinazione, in particolare quella di Escherichia coli, è altamente significativa per tutti gli alimenti e per tutte le acque (di sorgente, difiume, di mare) per i motivi seguenti:• qualunque materiale che abbia subito inquinamento fecale certamentecontiene cellule di E. coli;• la presenza di E. coli è indice sicuro di inquinamento fecale.Nei mosti e nei vini, E. coli e le altre specie della famigliaEnterobacteriaceae non hanno alcuna possibilità di sviluppo a causa delbasso valore di pH. La loro determinazione può avere importanza per altrimateriali quali il mosto concentrato rettificato, l'acqua impiegata per ilavaggi e, in generale, per gli ambienti di cantina. Gli enterobatteri hannoesigenze nutrizionali semplici; rutti quelli non patogeni hanno la capacitàdi fermentare illattosio e sviluppano in presenza di sali di bile (che, invece, inibiscono la maggior parte degli altri batteri). Di queste caratteristiche si approfitta per la preparazione di terreni e mezzi specifici impiegatiper la loro determinazione.

Il Il 34


Violet Red Bile Agar (VRBA)

Si tratta del terrenopiù comunementeusato per la ricercaed il conteggio deicolibatteri.Ha la composizioneesposta nella tabellaa lato ed è prodottoe commercializzatodisidratato danumerose ditte.

Estratto di lievito

Peptone

NaCl

Sali di bile

Lattosio

Rosso neutro

Cristal violetto

Agar

Acqua distillata

3.0 9

7.0 9

5.0 9

1.5 9

10.0 9

0.03 90.002 9

15.0 91 litro

IIlattosio può essere sostituito dal glucosio.

E.C. Broth (per Escherichia coli)

Gli ingredienti vanno sciolti inacqua distillata; il mezzo viene poidistribuito in provette (160 X 16mm) nella misura di 8 mL per tubo,in presenza di campanula Durham.Si sterilizza a 121 DC per 15 minuti. Il mezzo è preparato in formadisidratata ed è commercialmentereperibile.

Triptone

Sali di bile

Lattosio

Fosfato dipotassico

Fosfato monopotassico

NaCl

Acqua distillata

20.0 9

1.5 9

5.0 9

4.0 9

1.5g

5.0 9

1 litro

Gli ingredientivanno sciolti inacqua distillata.La presenza disorbitolo, comeunica fonte dicarbonio, haun'efficace azione selettiva.

Peptone

Sali di bile

Sorbitolo

NaCI

Rosso neutro

Cristal violetto

Agar

Acqua distillata

20.0 g

da 1.5 a 3.g

10.0 95.0 9

0.03 90.001 915.0 9

1 litro

f·~~~::_:=:=::=::=:=:=::=:=:=::=::::::::::::=:::::::: ::::::::::=:::=::::::::::::::=:::::::::::::=:::=:=::::::::::::::::::::::=::::::::::~~:::::::=:::::::::::=:::::::=:::: ..._-_ __ _ _------_._----_._._-_._.-.-----------.-----------------------------_._----------------------------------_._----------------------------------------------------.--------------

35 Il Il

_______ 1 103

<conteggio totale

3.7_Terreni per microrganismi genericiMolte volte può essere interessante conoscere il grado di contaminazionegenerico di alimenti, attrezzi e materiali di varia natura. Si tratta, in questicasi, di impiegare un terreno nutritivo sul quale può sviluppare un grandenumero di specie microbiche non riferibili ad un gruppo particolare.Il cosiddetto conteggio totale dà sempre risultati in difetto e può essereeseguito impiegando diversi terreni.

Plate Count Agar

tutti i microrganismi possono crescere in un terreno generico: ad esempio il Plate Count Agar descrittosopra è solitamente indicato come terreno per conta totale, ma con ciò siintende conta totale dei microrganismi dell'acqua o di alimenti in genere.I batteri lattici del vino non crescono su PCA e se si esegue un controllomicrobiologico del vino con tale terreno, si possono ottenere dei falsi negativi, ossia risultati di apparente assenza di batteri, perché quelli presenti non crescono in piastra, ma nel vino sì.

Peptone

Estratto di lievito

Glucosio

Acqua distillata

Agar

pH finale

5g

2.5 9

1 91 litro

15 97.0

Questo terreno, di larghissimo impiego, ha la composizione riportata a fianco.Il PCA è preparato allo statodisidratato da diverse ditteed è reperibile in commercio. Si sottolinea che non

<spumantizzazione

3.8_Mezzi di arricchimentoI mezzi di arricchimento hanno una composizione variabile e dipendonodalle caratteristiche proprie dei microrganismi che s'intendono favorire.Ad esempio, se si intende rilevare la presenza di lieviti interessanti dal puntodi vista enologico, è sufficiente impiegare come mezzo di arricchimento unmosto d'uva sterilizzato. Nella spumantizzazione in bottiglia può essereimportante ricercare la presenza di batteri lattici, che potrebbero dare fermentazioni malolattiche indesiderate. Poiché è molto difficile il conteggiosu piastra di un numero molto basso di colonie di batteri in presenza di uneccesso di lieviti e non è facile sottoporre a filtrazione il vino spumante inoculato, in quanto la presenza di cellule di lieviti provoca intasamento dellamembrana dopo pochi mL, si può ricorrere all'inoculo del vino in un mezzoliquido specifico per batteri malolattici, contenente un antibiotico perlieviti, e poi vedere se si osserva intorbidamento. Questo uso dei terreni perbatteri malolattici come arricchimento può essere applicato a diluizionisuccessive di vino, in modo da calcolare la presenza batterica.

3.9_1 diluenti

Generalmente i materiali da sottoporre ad analisi microbiologica devonoessere adeguatamente diluiti. I mezzi diluenti devono avere composizione

Il Il 36


NaClAcqua distillata

Peptone

Acqua distillata

tale da garantire la sopravvivenza delle cellule microbiche senza consentirnela moltiplicazione (che falserebbe i risultati). I diluenti di impiego più frequenti sono rappresentati dalla soluzione fisiologica e dall'acqua peptonata.

Soluzione fisiologica

È una semplice soluzione di clorurodi sodio allo 0,9% in acqua. Ha lacomposizione illustrata in tabella afianco.La soluzione fisiologica va preparata in laboratorio al momento del bisognoe viene distribuita in volumi determinati in provette, in matracci tarati oaltri recipienti; quindi deve essere sterilizzata.

Acqua peptonata

È una soluzione di peptone in acqua. Ha la composlZlone seguente.I..:acqua peptonata deveessere preparata in laboratorio al momento del bisogno e in seguito vienedistribuita in volumi determinati in provette, in matracai tarati o in altrirecipienti; infine, deve essere sterilizzata.

9.0 g1 litro

1 grammo

1 litro

37 Il Il

04 la sterilizzazione

4.1 Definizione

La sterilizzazione consiste nell'eliminazione per uccisione o per allontanamento di tutti i microrganismi sotto ogni forma (cellule e spore). Questorisultato può essere ottenuto attraverso differenti vie.

4.2 La sterilizzazione a caldo

<autoclave, stufa

Il risultato della sterilizzazione può essere raggiunto per mezzo del calore:si tratta di esporre il materiale da sterilizzare a temperature elevate e pertempi sufficientemente lunghi da uccidere tutti i microrganismi presenti.La sterilizzazione a caldo può essere eseguita in autoclave o in stufa, cioècon calore umido o secco. In autoclave si sterilizzano sempre e comunquetutti i materiali liquidi o umidi, mentre in stufa si sterilizzano la vetreria egli attrezzi. Le autoclavi di ultima generazione sono interamente automatiche e, una volta riempita la camera di sterilizzazione e chiuso il coperchio,l'operatore non deve fare altro che avviare l'apparecchiatura ed attendere lafine del ciclo.Se invece le operazioni di apertura e chiusura delle valvole di sfiato delvapore sono manuali, va tenuto presente che il vapore d'acqua sotto pressione si surriscalda molto più velocemente ed efficacemente dell'aria; pertanto, dopo la chiusura del coperchio e prima della chiusura delle valvoledi sfiato della camera di sterilizzazione, si deve eliminare tutta l'aria presente all'interno. È opportuno dunque accendere l'apparecchio e lasciare sfiatare a valvole aperte; inizialmente esce soltanto aria, poi raggiunti i 100 DC,comincia a uscire vapore d'acqua.Quando dalle valvole esce soltanto vapore, si chiudono le valvole; a questo punto, la pressione e la temperatura aumentano e si regolano gli indicatori di pressione e i timer ai livelli voluti. Alla fine, il riscaldamento

Il Il 38

• Parte Prima Generale I I •

viene spento e si apre parzialmente una valvola per fare uscire lentamenteil vapore surriscaldato e abbassare la pressione; quindi l'autoclave vieneaperta e il materiale sterilizzato è estratto (prelevandolo con guanto isolante per non scottarsi). Tutto ciò che è destinato alla sterilizzazione in autoclave deve essere preventivamente preparato in modo tale da evitare inquinamenti successivi o l'ingresso di acqua di condensazione nei recipienti.Tradizionalmente, tutti i recipienti contenenti liquidi vengono chiusi contappo di cotone grezzo (non con cotone idrofilo) e in seguito ricoperticon carta da pacchi impermeabile (Foto Appendice 12b). Il tappo di cotone funziona da filtro contro gli inquinamenti e la carta impermeabileimpedisce l'entrata di acqua di condensazione.I terreni e i mezzi nutritivi, salvo indicazioni contrarie, vengono sterilizzati a 121°C per 20 minuti. In alcuni casi, quando le temperature eccessivamente elevate possono danneggiare composti termolabili, si ricorre allacosiddetta tindalizzazione: questa consiste in un doppio trattamento a100°C (autoclave con valvole aperte) per 30 minuti e a distanza di 24 ore.La sterilizzazione con calore secco viene realizzata in stufa. Il calore seccoè molto meno efficace di quello umido e, di conseguenza, le temperatureda raggiungere e i tempi di esposizione devono essere più alti: si rendononecessarie temperature superiori a 160°C e tempi di esposizione di molteore. Le stufe possono essere utilizzate per la sterilizzazione della vetreria edelle piccole attrezzature metalliche; va tuttavia ricordato che attualmentemolta vetreria è stata sostituita da analoghi oggetti in plastica che sonocommercializzati in confezioni già sterilizzate. Si tratta, in particolare,delle attrezzature di maggiore uso, quali piastre e pipette graduate da 1fino a 5 mL. La stufa potrebbe ancora servire per la sterilizzazione di provette, matracci e pipette di grande volume (da 50 e 100 mL) per le quali,tuttavia, oggi si preferisce ricorrere all'autoclave. Anche questa vetreria,comunque venga sterilizzata, va adeguatamente preparata.

4.3 La filtrazione

La filtrazione è un metodo di sterilizzazione che non uccide i microrganismipresenti in un liquido, ma li allontana. Essa offre il vantaggio di non determinare alterazioni chimico-fisiche di alcun genere, di non provocare ladistruzione delle sostanze termolabili e di lasciare inalterate le caratteristichesensoriali.Il procedimento consiste nel far passare un liquido attraverso filtri, qualicandele o membrane, con porosità tale da trattenere particelle di diametrofino a 0,22 o 0,45 !-lm. La filtrazione è possibile solo con liquidi non troppo densi e già preventivamente resi limpidi (con decantazione a freddo,

<tappo di cotone grezzo

<tindalizzazione

<calore secco

39 Il Il

--- 1 104

<piccoli volumi

con filtrazioni più grossolane o altri mezzi). I laboratori di microbiologiaimpiegano generalmente membrane filtranti di differente diametro (da 5a 20 cm in funzione del volume di liquido da sterilizzare), che vengonopoi adagiate su un supporto a disco di materiale a larga porosità (acciaiosinterizzato).Il liquido viene immesso in un imbuto di volume adeguato e passa in unarampa di acciaio o in un matraccio di vetro spesso dotato di beccuccio, collegato con una pompa da vuoto. Un recipiente apposito funge da "trappola" per raccogliere il liquido filtrato. Per la filtrazione di piccoli volumi (da1 a lO mL) possono essere utilizzate anche siringhe sterili di plastica, tipo"usa e gettà', normalmente presenti in commercio; su tali siringhe vieneapplicato, al posto dell'ago, un piccolo filtro di porosità adeguata. Il liquidofiltrato viene raccolto in provetta sterilizzata. La filtrazione è uno dei metodi meno sicuri di sterilizzazione; infatti essa richiede molta attenzione perevitare inquinamenti successivi all'operazione.

4.4_La sterilizzazione chimica

Esistono diversi composti che, usati a bassa concentrazione, hanno la proprietà di uccidere tutti i microrganismi e, quindi, sono sterilizzanti. Il piùnoto è l'estere dietilico dell'acido pirocarbonico; questo composto,aggiunto ai liquidi in quantità di 20-30 mg per litro, uccide tutti i microrganismi e va soggetto a idrolisi, a seguito della quale si formano anidridecarbonica ed etanolo.

CO-O-CH CH/ 2 3

O

"- CO-O-CH CH2 3

\ Nessun composto sterilizzante è consentito per il trattamento di alimenti;essi non devono essere neppure presenti fra i prodotti di un laboratorio dimicrobiologia enologica.

4.5 Le radiazioni ionizzanti<raggi x e 'Y

<mutazioni

Le radiazioni ionizzanti sono costituite dai raggi x e 'Yemessi da elementi radioattivi come il CoGo• Esse sono dette ionizzanti perché provocano ildistacco di ioni da molecole anche complesse (quali il DNA) causandoprima la comparsa di mutazioni, poi la morte delle cellule. La loro azione è dipendente dall'intensità della fonte, dalla distanza e infine dal tempodi esposizione.

Il Il 40


L'INTERESSE DI QUESTE RADIAZIONI ~ LEGATO AI SEGUENTI FATTORI:

1. non sono trattenute da alcun contenitore di vetro, di plastica ecc. (possono essere trattati anche prodotti giàconfezionati);2. penetrano in profondità senza diminuzione di attività;3. la loro azione è indipendente dalla temperatura (possono essere trattati prodotti congelati);4. i prodotti trattati non diventano radioattivi.

LUSO delle radiazioni ionizzanti per la sterilizzazione è consentito per unnumero limitato di alimenti e suscita diffidenza nei consumatori. È ovvioche soltanto laboratori specializzati possono disporre di queste attrezzature,non certamente un normale laboratorio di microbiologia enologica.

4.6_1 raggi ultravioletti

Sono dette ultraviolette (UV) le radiazioni dello spettro luminoso a bassalunghezza d'onda. Sono dotate di forte azione microbicida quelle con lunghezza d'onda di circa 270 nm. I raggi UV hanno soltanto azione direttae superficiale e non superano sbarramenti di vetro, di plastica, di carta;non sono attivi nelle zone d'ombra. La loro azione è dipendente dall'intensità, dalla distanza della fonte e dal tempo di esposizione. Il loro impiego, anche in un laboratorio di microbiologia enologica, è consigliabile perla sterilizzazione di ambienti di volumi limitati e per la sterilizzazionesuperficiale di alcuni attrezzi. Le cappe a flusso laminare sono dotate diimpianti a raggi UV.

4.7_Le alte pressioni meccaniche

Le pressioni meccaniche a livelli superiori a 100 Mpa (l Mpa = 1MegaPascal = circa lO atmosfere), pari a circa 1000 atmosfere, hannoazione microbicida. Queste altissime pressioni possono essere raggiuntecon strumenti messi a punto dall'industria impiantistica metallurgica enon sono ancora disponibili per laboratori di microbiologia.

4.8_La pasteurizzazione (o pastorizzazione)

La pasteurizzazione è un trattamento termico che consiste nell'esposizione per tempi determinati a temperature inferiori a 100 cc. Essa provocala morte di tutte le cellule microbiche presenti, mentre è inattiva sullespore batteriche termoresistenti, per uccidere le quali, invece, è necessariosuperare quella temperatura.

<ultravioletti (UV)

<azione microbicida

NOte: _ _ __ _ ._. __.._._. . . ._. . . ._. . . ._. . ._._ _ _ _.._ _

41 Il Il

_______ I 104

<Pasteur

<spore batteriche

<pasteurizzatori

La pasteurizzazione è stata ideata da Pasteur (da cui prende il nome) nellaseconda metà del XIX secolo. A quell'epoca, i produttori ed esportatori divini francesi chiesero a Pasteur di risolvere un loro importante problema,quello riguardante la possibilità di evitare l'alterazione (particolarmentel'acetificazione) dei prodotti trasportati via mare. Pasteur suggerl di riscaldare i vini alla temperatura di 60°C per circa trenta minuti, in modo taleda uccidere le cellule dei batteri acetici senza danneggiare il prodotto. Lapratica ebbe successo e per questo in seguito fu estesa a numerosi altri prodotti alimentari.Se applicata ai mosti ed ai vini, la pasteurizzazione è sostitutiva della sterilizzazione perché le spore batteriche sopravvissute non hanno poi la possibilità di germinar~ e dare coltura a causa del basso valore di pH, non idoneoper nessun batterio sporigeno. Di fatto, la pasteurizzazione trova ampieapplicazioni nel settore enologico per stabilizzare i mosti dal punto di vistamicrobiologico e per il trattamento di vini imbottigliati dolci.I pasteurizzatori non sono presenti nei laboratori di microbiologia, ma losono nella maggior parte delle cantine. Questi possono essere utilizzati peril trattamento di mosti o di vino per fini particolari.

Il Il 42

Parte Seconda Speciale

BCriteri e metodi di microbiologia analitica

01_le colture microbiche1.1_lo stato delle cellule

1.2_la coltura pura microbica

1.3_Esame delle colonie

1.4_Trasferimento delle colonie

1.5_1 ceppi microbici

02_lo sviluppo nei mezzi liquidi2.1_Fasi dello sviluppo

2.2_l'accumulo dei prodotti

di fermentazione

2.3_Curve di sviluppo

03_11 carico microbico3.1_Definizioni

3.2_le unità facenti colonia (ufc)

3.3_Significato del carico microbico

3.4_11 caso del vino

3.5_Determinazione del carico

microbico

04_11 campionamento4.1_Definizione e procedura

4.2_Preparazione del campione

4.3_Conteggio diretto

4.4_Conteggio indiretto

4.5_Concentrazione del campione

Applicazioni

CAnalisi microbiologica dell'aria

l_Analisi microbiologiche di superfici

3_1/ sistema HACCP

Approfondimento - Shelf-Iife

4_La colimetria

o1 le colture microbiche

1.1 Lo stato delle cellule

<quiescenzae moltiplicazione

<blastomiceti

<tempo di generazione

Le cellule microbiche possono trovarsi sostanzialmente in due stati: in statodi quiescenza e in moltiplicazione.Sono chiamate quiescenti, dormienti o restanti le cellule che non hanno lapossibilità di moltiplicarsi. Questo può accadere perché si trovano in unmezzo nutritivo di composizione non idonea (in quanto incompleto o contenente inibitori), perché la temperatura è troppo bassa o troppo alta, oppure perché le cellule si trovano in stato di disidratazione. Così, ad esempio,sono in stato di quiescenza e inattive le cellule microbiche del terreno nelperiodo invernale, le cellule sospese nell'atmosfera, quelle che si trovano sumateriali inerti (sui muri, sugli attrezzi puliti, sui pavimenti) e le cellule deilieviti o dei batteri lattici dei preparati commerciali disidratati.Le cellule microbiche possono rimanere in stato di quiescenza anche permolto tempo senza perdere la vitalità. Non appena le condizioni diventanofavorevoli, esse escono dalla quiescenza e cominciano a moltiplicarsi.

La moltiplicazione delle cellule

I microrganismi si moltiplicano sempre agamicamente (in assenza di riproduzione sessuale). Nei lieviti la moltiplicazione avviene per gemmazione oblastogonia: per questo motivo, essi sono anche chiamati blastomiceti(impropriamente, perché alcuni fanno eccezione e si moltiplicano per scissione). Nei batteri la moltiplicazione avviene per scissione o schizogonia:pertanto, essi sono anche chiamati schizomiceti.Il tempo necessario alla riproduzione completa di una cellula è chiamatotempo di generazione. Per le singole specie, il tempo di generazione nonè costante e dipende dalle condizioni in cui si trovano le cellule: esso èminimo se le condizioni sono ottimali e si allunga quando non lo sono.

Il Il 44

• Parte Seconda Speciale I I I •

Fra i diversi microrganismi esistono notevoli differenze nei tempi di generazione, che possono variare da un minimo di lO minuti fino ad alcune ore.Nei microrganismi, la moltiplicazione è di tipo esponenziale: il numerodelle cellule raddoppia ad ogni tempo di generazione. Questo significa chelo sviluppo microbico è molto rapido. Infatti, ipotizzando un tempo digenerazione di un'ora, risulta che da una singola cellula se ne formanomille dopo dieci ore (da 1 a 2, poi 4,8, 16,32,64, 128,256,512, 1024),un milione dopo 20 ore e un miliardo dopo 30 ore. La conseguenza diquesta rapidità di sviluppo è che, partendo da una sola cellula, un microrganismo intorbida un mezzo liquido in poco tempo; su mezzo solido,dove le cellule che si moltiplicano non possono diffondere nel mezzoliquido, si "ammucchiano" una sull'altra e dopo pochi giorni si forma unapopolazione di cellule così numerosa da formare una colonia visibile aocchio nudo. Questo fenomeno viene quindi sfruttato per poter contare imicrorganismi presenti in un certo ambiente, contando le colonie che sisviluppano su terreni solidi dopo incubazione per un tempo adeguato(vedi quanto segue).

1.2_la coltura pura microbica

La coltura pura è una popolazione costituita da cellule che derivano tuttedalla moltiplicazione agamica di una sola cellula originale e costituisce unceppo. Non è del tutto corretto affermare che le colture pure sono costituite da cellule tutte uguali fra loro e uguali alla cellula di origine di cui hannoil medesimo patrimonio genetico, perché i microrganismi, soprattutto i batteri ma anche i lieviti, vanno incontro con una certa frequenza ad eventi diricombinazione genica indipendenti dalla riproduzione sessuale. Un ceppomicrobico, anche se è mantenuto in collezione col massimo scrupolo, dopoun certo numero di trapianti può mutare le sue caratteristiche, ad esempiopuò perdere la capacità di sporificare. Dal punto di vista generale biologico,in teoria le colture pure sono dei "cloni"; tuttavia questa definizione va presacon qualche precauzione.

Ottenimento delle colture pure

Data la definizione, per avere colture pure è necessario mettere singolecellule in condizioni di sviluppare da sole. Questo risultato è ottenuto conl'isolamento in piastra che viene eseguito con le modalità descritte diseguito.Si abbia un mezzo in fermentazione (o una sua diluizione) oppure unasospensione di varia origine o un mezzo di arricchimento in pieno sviluppo, e si supponga poi di voler isolare e individuare i microrganismi che

<moltiplicazione

••...

<ceppo

<ricombinazione genica

<colture pure

• ••••

Note: --.--..--.---- -- ----------.-- -- -- ------.--..--------.---- --..-- .

45 Il Il

_______ 1 101

<

isolamentointervengono nella fermentazione o che sono, comunque, presenti.Lisolamento si prefigge finalità differenti rispetto al conteggio, anche sesi usano le stesse tecniche e gli stessi terreni. Lisolamento deve essere preceduto da alcune scelte importanti. Se il microrganismo da isolare fa partedel microbiota dominante, allora è sufficiente impiegare un terreno che neconsenta la migliore crescita, perché la presenza di altri microrganismi èirrilevante.

~icrobiotaPoiché dal punto di vista tassonomico i microrganismi non fanno parte dei vegetali, ossia della flora, non è correttousare il termine "microflora"; al contrario, i microrganismi costituiscono il microbiota.1I microbiota è definito come"la vita microscopica di un ambiente specifico" .

Se invece la presenza del microrganismo è minoritaria nel microbiota da cui si deve isolare, allora bisogna impiegare un terreno selettivo, in grado cioè di fare crescere una certa specie (o gruppo di specie), inibendo quella dimolte o di tutte le altre.

1. Scelta del terreno per l'isolamento. Èevidente che il terreno nutritivo deve essere di composizione tale da consentire il migliore sviluppo di quei microrganismi che si intendono isolare o che si suppone siano presenti. In molticasi, da uno stesso campione si esegue l'isolamento in più terreni, in modo da rilevare la presenza di microrganismidifferenti (ad esempio, lieviti e batteri lattici).

2. Modalità di semina: superficiale o per inclusione. La semina può essere eseguita: a) superficialmente sul terreno già messo in piastra e solidificato: questo nel caso di ricerca di microrganismi aerobi obbligati o che avrebberodifficoltà a sviluppare nella parte profonda del terreno; b1) per inclusione nel terreno ancora fuso e ancora in provetta, prima del versamento in piastra; questo nel caso di microrganismi che sviluppano bene anche negli strati più profondi; b2) per inclusione, ma mettendo una frazione del campione (da 0.1 a 1.0 ml) nella piastra vuota epoi versando sopra il terreno fuso; questa operazione deve essere seguita da accurata e gentile agitazione del terreno ancoraliquefatto. Fino al momento dell'inoculo il terreno colturale va mantenuto a bagnomaria ad una temperatura noninferiore a 45-50 O( (per evitare la solidificazione dell'agar) e poi va immediatamente versato in piastra e agitato,per evitare shock termici alle cellule.

3. Scelta della temperatura d'incubazione. le piastre seminate devono essere incubate alla temperatura più idonea (o presumibilmente più idonea) allo sviluppo dei microrganismi che si intendono isolare. Anche la temperaturadi incubazione può diventare un fattore di selettività, per isolare specie termofile o criotolleranti.

4. Esposizione all'aria. Se il microrganismo che si vuole isolare è anaerobio o sviluppa meglio in assenza diossigeno oppure se si vuole impedire lo sviluppo di aerobi, è bene sistemare le piastre in giare o in sacchetti peranaerobiosi.

5. Numero di piastre. la semina di una sola piastra direttamente con il campione o con una sua diluizione puòdeterminare lo sviluppo di un numero troppo alto o troppo basso di colonie; di norma, dello stesso campione siseminano almeno tre piastre con diluizioni differenti, in modo che almeno una presenti un buon numero di colonieben distanziate fra loro.

Dopo 2-4 giorni d'incubazione, le cellule si sono moltiplicate in misura taleda dare origine a colonie ben visibili. Delle tre piastre seminate, si scegliequella che presenta colonie sufficientemente numerose e ben distanziate e siprocede alloro esame.

Il Il 46


1.3 Esame delle colonie

Dimensioni. le dimensioni delle colonie variano in misura considerevole; se la semina era stata superficiale, quelle profonde sono spesso puntiformi, mentre quelle superficiali generalmente sono più grandi, con diametro da 1a 5 mm. "-

Forma. la forma delle colonie riguarda prevalentemente quelle superficiali. le colonie possono avere pianta circolare, essere piatte, convesse, appuntite, crateriformi ecc. Il loro perimetro a contatto con il terreno può esserecontinuo e regolare oppure filamentoso o sfrangiato ecc.

Colore. le colonie possono essere bianche o color crema, nocciola o brune oppure possono essere decisamentepigmentate. Nei terreni selettivi o differenziali esse possono presentare colorazioni anche molto diverse.

Superficie. la superficie della colonia può essere liscia o rugosa, lucida, opaca oppure translucida.

In un mezzo in fermentazione o in altri substrati naturali sono sempre presenti più microrganismi, ciascuno dei quali su un certo terreno dà origine acolonie con caratteristiche proprie. La piastra scelta per l'esame presentaquindi un certo numero di colonie riferibili a tipi differenti; per questomotivo, la prima cosa da fare è la loro accurata descrizione. Delle colonie siconsiderano le seguenti caratteristiche.

In una piastra d'isolamento sono di norma presenti gruppi di colonie di diverso aspetto. Le colonie di diverso aspetto generalmente appartengono a speciedifferenti, ma possono anche essere riferibili a ceppi della medesima specie.

Esame microscopico a fresco

Le cellule prelevate dalle colonie del tipo più rappresentato vanno esaminate al microscopio ottico, al fine di stabilire se queste sono formate da cellule con la medesima morfologia; in caso positivo, è lecito pensare che derivino tutte dallo stesso clone originale e in questo caso è sufficiente trasferirneuna sola in altro terreno per completare l'isolamento. Vanno poi esaminateal microscopio le colonie con caratteristiche differenti da quelle prevalenti;anche queste vanno trasferite in terreno solido.L'esame microscopico a fresco viene eseguito prelevando con filo di platino o di acciaio sterilizzato alla fiamma - oppure con ansa sterile manousoin plastica o con stuzzicadenti sterilizzati in autoclave - una parte delle colonie (un punto di filo) e sospendendola poi in una goccia di acqua sistemataal centro di un vetrino porta-oggetto. Il preparato viene coperto con il vetrino copri-oggetto ed è pronto per l'esame microscopico.Con l'esame microscopico a fresco si vedono le cellule così come sononella colonia da cui provengono.

<colonie

<esame microscopico

a fresco

47 Il Il

_______ 1 I 01

Consigli utili

La piastrella nera

<batteri

<lieviti

Lo smaltoper unghie

<registro

Èconsigliabile che di fianco al microscopio, immediatamente a portata di mano, cisia una piastrella nera di ceramica o di plastica, con lati di 20 cm. La piastrella neradiventa utilissima quando si devono esaminare colonie sviluppate in piastra. Infatti,sui fondi chiari (come sono i piani dei tavoli di laboratorio) le colonie si vedono conqualche difficoltà mentre, al contrario, risaltano e diventano perfettamente visibili sufondo nero. La piastrella nera è utilissima anche in fase di allestimento dei vetrini perl'esecuzione degli esami al microscopio.

Questo esame permette di determinare immediatamente:• nel caso di batteri: la morfologia delle cellule, la loro disposizione, laloro mobilità e l'eventuale presenza di spore;• nel caso di lieviti: la morfologia delle cellule, approssimativamente leloro dimensioni, la modalità di moltiplicazione, il posizionamento dellegemme sulla cellula; talvolta, nel caso di lieviti sporigeni, si può notareanche la presenza di aschi.

Consigli utili

I preparati per l'esame microscopico a fresco hanno vita breve perché vanno rapidamente a secco a causa dell'evaporazione dell'acqua ai bordi del vetrino copri-oggetti. Per poter conservare i preparati montati con acqua è necessario escludere il contatto con l'aria chiudendo i bordi del vetrino. Questo può essere fatto stendendo unsottile strato di cera lungo tutto il perimetro del vetrino copri-oggetti oppure (meglio)stendendo una densa soluzione di lacca in acetone con un piccolo pennello.L'allestimento della soluzione di lacca (reperibile anche in commercio), il reperimento di un pennello adatto, il mantenimento del tutto in bottiglietta ecc., non sono operazioni complicate, ma fanno perdere tempo. Il modo più semplice di operare è andare in una qualunque profumeria e acquistare una confezione di smalto per unghie:queste confezioni sono costituite, appunto, da soluzioni di lacca in acetone esono giàdotate di un pennello idoneo. Non è necessario che lo smalto sia di grande qualità(vanno bene anche i più dozzinali) e neppure che sia incolore. AI contrario, quando ipreparati vengono conservati per essere usati a fini comparativi o altro, possonoessere acquistate confezioni di smalto di differenti colori per rendere più facile la loroclassificazione.Anche la bottiglietta di smalto per unghie deve essere vicina al microscopio, semprea portata di mano.

Tutto ciò che viene determinato con l'esame morfologico delle colonie econ l'esame microscopico a fresco deve essere annotato in un registro,precisando quale sia il tipo di microrganismo prevalente. Può essere utilecorredare la descrizione anche con disegni. A questo punto, e in casi particolari, alcune colture di lieviti possono già essere identificate almeno,come genere, e talvolta anche come specie.

Il Il 48


Ad esempio, lieviti come Saccharomycodes ludwigii e Metschnikowia pulcherrima sono identificabili a vista; i lieviti apiculati sono immediatamentericonducibili al genere (Kloeckera = Hanseniaspora); i lieviti riferibili aSchizosaccharomyces sono presumibilmente attribuibili al genere.In ogni caso, quanto è stato determinato al momento dei primi esamiserve in seguito per meglio orientare il successivo e necessario lavoro diidentificazione.

Esamedi un'intera colonia

lampada ad alcol

Accade spesso che quando si eseguono isolamenti con semina per inclusione si formino coloniette molto piccole e profonde, dalle quali il prelevamento di cellule perl'esame microscopico è difficile. Conviene allora ritagliare (con una lancetta) uncubetto di terreno con la colonia al centro, appoggiarlo su un porta-oggetti eschiacciare il tutto con il copri-oggetti in modo da liberare le cellule.

Consigli utili .

le lampade ad alcol sono quelle costituite da un piccolo recipiente di vetro spesso(preferibile) oppure di metallo riempito con alcol denaturato e chiuso da un tappodi sughero; immerso nell'alcol si trova un cordoncino che fuoriesce come uno stoppino per circa 1 cm da un foro praticato nel tappo. Lo stoppino acceso produce unafiammella piccola, molto gentile e pulita (senza fuliggine). La lampada ad alcol èutilissima per eseguire alcune delicate operazioni di asciugamento o di fissaggiodei vetrini per le quali il bunsen non è idoneo.

1.4_Trasferimento delle colonie

Con molte probabilità, le colonie cresciute in piastra sono già colture pure,perché derivanti dalla moltiplicazione di una sola cellula ferma in una certaposizione del terreno solido; tuttavia, spesso 1'operazione di isolamentoviene ripetuta due o tre volte, per essere sicuri di non aver prelevato unacolonia mista, cioè originata da due cellule diverse associate o aderenti fraloro nel campione originale.Per eseguire questa operazione non è necessario risospendere in liquido lacolonia, per poi ripetere le diluizioni, ma è sufficiente prelevare con l'ansa unpunto di colonia e strisciarla su parte della superficie di un'altra piastra vuota.Successivamente, una volta risterilizzata l'ansa (o utilizzando un'altra ansasterile monouso), la si passa sulla piastra con un'angolazione di circa 90°

<isolamento

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- 1 101

<

colonie singole

<trasferimento

rispetto allo striscio appena fatto, e passando sopra questo 1-2 volte; poi siripete l'operazione una terza volta. Dopo incubazione si ottengono sicuramente, almeno in una delle tre strisciate eseguite sulla piastra, delle coloniesingole ben separate tra loro; inoltre si può osservare i'aspetto dello striscioe valutare se le colonie cresciute sono tutte uguali o meno, nel qual caso sipuò ipotizzare che la colonia originaria fosse mista. È bene ripetere due o trevolte questa operazione su terreni non selettivi (almeno nei passaggi successivi al primo), in modo da consentire la crescita di tutti gli organismi eventualmente presenti: solo in questo modo si può essere certi della purezzadella coltura ottenuta. In caso contrario, la presenza di microrganismi contaminanti, associati a quello che si intende isolare, può essere mascherata dalfatto che non riescono a crescere visibilmente sul terreno selettivo.Lisolamento delle colture pure va completato col trasferimento di parte dellapopolazione di una sola colonia in altro recipiente colturale, generalmente inprovetta, su terreno nutritivo solido (striscio o infissione).

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Gli strisci

Il trasferimento in striscio viene adottato per tutti i lieviti e per i batteri aerobi.Si impiega a questo fine un terreno nutritivo lasciato solidificare con provetta inclinata;il terreno assume la forma di becco di clarino eha un'ampia superficie sulla quale vienestrisciata con ansa o filo una parte della popolazione della colonia.

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le infissioni

<conservazione

Il trasferimento in infissione è invece preferibile per i batteri anaerobi facoltativi, qualii lattici. Si preleva da una colonia una parte della popolazione con filo ben diritto elungo circa 5 cm; questo poi viene infisso in terreno posto in provetta esolidificato inposizione verticale. Lo sviluppo awiene lungo il canale di infissione ed è scarso nellaparte superficiale.

Per una conservazione più prolungata, i ceppi puri possono essere moltiplicati in mezzo colturale liquido, poi risospesi nello stesso mezzo contenenteil 25% di glicerolo e, infine, conservati in congelatore a -80 cc.

1.5_1 ceppi microbici

Le provette contenenti le colture pure in striscio o in infissione devonoessere subito etichettate e distinte con un numero o una sigla corrispondente al numero di un registro nel quale si annotano anche le notizie raccolte nel corso dell'isolamento (ad esempio, la data dell'isolamento,l'origine, il terreno usato, la forma della colonia e delle cellule). A questopunto, la coltura pura assume il nome di "ceppo". Al riguardo valgono leseguenti definizioni.

Il Il 50


Ceppo microbico

Isolato

Ceppi tipo(Type Strain)

le collezioni

Èuna coltura pura di cui sono noti, oltre ai primi dati rilevati immediatamente, la specie di appartenenza, le caratteristiche particolari, le sperimentazioni eseguite ecc.I ceppi sono distinti da un numero o da una sigla, corrispondente al numero di registrazione e vengono conservati dalla struttura che li ha isolati; una struttura che possiedeun certo numero di ceppi registrati ha una collezione.

Prima di attribuire il rango di ceppo ad una colonia isolata e non caratterizzata (ed èquindi ancora indefinita), questa si definisce semplicemente un isolato.

Sono i ceppi di riferimento riconosciuti a livello internazionale: sono quelli che rappresentano a livello tassonomico le specie cui appartengono e delle quali possiedono icaratteri più tipici e comuni. Generalmente, per ogni specie microbica esiste un soloceppo tipo. I ceppi tipo sono conservati nelle grandi collezioni di servizio.

Le collezioni di servizio sono istituzioni omologate da regolamenti internazionali che impongono precisi obblighi. Esse hanno il compito di mantenere,per ogni specie microbica, i ceppi tipo ed altri ceppi richiesti a studiosi che nehanno fatto oggetto di pubblicazione su riviste scientifiche; devono pubblicare un catalogo di tutti i ceppi presenti in collezione; devono fornire (a pagamento) i ceppi elencati in catalogo a chi ne faccia richiesta; devono eseguire,a pagamento, l'identificazione di colture inviate da altri studiosi. Per i microrganismi patogeni c'è una regolamentazione particolare per la richiesta e laspedizione.

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collezioni di servizio

l/'Ce più importanti collezioni di servizio

ATCC - American Type Culture Col/ection, 12301 Parklawn Drive, Rakville, Maryland 20852, U.5.A. Èprobabilmentela collezione più ampia e completa del mondo.CBS - Centraalbureau voor Schimmelcultures, Osterstraat 1, Barn, Olanda. È una collezione specializzatasoprattutto per le colture fungine, particolarmente per i lieviti.DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zel/kulturen, Braunschweig, Germania.

In Italia, la sola collezione di servizio è quella del Dipartimento di BiologiaVegetale (DBVPG) dell'Università di Perugia (Facoltà di Agraria).Questa collezione, specializzata in lieviti, comprende fra l'altro tutti i ceppiisolati da mosti e vini da parte di Castelli e, prima di lui, da De Rossi.Esistono poi altre collezioni, non ufficialmente riconosciute, annesse aIstituti o Dipartimenti universitari, a laboratori di industrie e a laboratori

<DBVPG-Perugia

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_______ 1 101

privati. Per fare una collezione non è necessario che i ceppi siano numerosi.Una collezione può essere paragonata ad una biblioteca: ciascuno di noi ha,a casa propria, una biblioteca che è tale anche se è costituita da pochi libri enon da migliaia come nel caso delle biblioteche nazionali. I ceppi possonoprovenire anche da altre collezioni, conservando il numero originale o unnuovo numero di registrazione.

Il mantenimento delle collezioni

<registro

<trapianto colture

Ogni laboratorio di microbiologia ha una propria collezione, piccola o grande, di microrganismi. Un laboratorio di microbiologia, annesso ad una cantina e che non si dedica all'attività di ricerca, possiede poche decine di ceppi dilieviti, generalmente provenienti da altre strutture; può anche possedere pochiceppi di batteri lattici. I ceppi in questione vanno annotati in un appositoregistro e distinti dal numero originario della collezione da cui provengonooppure da un nuovo numero progressivo. In quest'ultimo caso, oltre alla specie e a tutte le caratteristiche note, va scritto anche il numero dato dalla collezione di origine. Sulle provette contenenti le colture va messa un'etichettarecante poche indicazioni: il numero (o la sigla identificativa) del ceppo e,importantissima, la data del trapianto con giorno, mese e anno.I ceppi di lievito possono essere conservati a -80°C in YPG liquido con il25% di glicerolo per numerosi anni; oppure vanno mantenuti in strisci diYPG, in provette chiuse con tappo di cotone grezzo o con capsula metallica (ilcotone è preferibile), sistemate in porta-provette o in scatole. Durante il periodo di mantenimento, il terreno agarizzato perde umidità e diminuisce di volume fino a diventare secco. La velocità di rinsecchimento dipende prevalentemente dalla temperatura: per questo, è bene che i ceppi della collezione sianotenuti in frigorifero a +4 0c. Le scatole eventualmente usate per sistemare iceppi non devono essere chiuse con coperchio e, in ogni caso, l'atmosfera delfrigorifero non deve essere umida. La presenza di umidità (come nel caso discatole chiuse) favorisce lo sviluppo sul cotone del tappo di aspergilli xerofili,il cui micelio lentamente entra fino ad inquinare la coltura.Le colture della collezione vanno trapiantate prima che il terreno sia secco; dinorma, la conservazione in frigorifero permette di eseguire i trapianti unavolta all'anno. Le colture che vengono impiegate in corso d'anno, vanno prelevate e trapiantate in modo che la collezione rimanga completa. Quando sipreleva un ceppo dalla collezione, per impiegarlo in qualunque tipo di prova,è bene trapiantarlo per prima cosa in uno striscio che deve reintegrare la collezione e poi trapiantarne un'altra copia, o anche più di una, in strisci da usarsi per le prove. Nessuno di questi strisci deve rientrare in collezione, ma perun certo numero di passaggi essi possono a loro volta essere trapiantati peraltre moltiplicazioni. In questo modo si minimizza il rischio di inquinamentodei ceppi in collezione e si riducono al minimo i trapianti.Un laboratorio che possieda soltanto ceppi provenienti da altre collezioni nondovrebbe cederli ad altri. È possibile che un laboratorio enologico di cantinao privato abbia ceppi propri, isolati dal personale del laboratorio stesso o daaltri su commissione.

Il Il 52

02 Lo sviluppo nei mezzi liquidi

2.1_le fasi dello sviluppo

Nei mezzi liquidi, lo sviluppo dei microrganismi avviene con particolarimodalità e mostra andamento non costante. Se un certo numero di cellule diuna coltura pura microbica è inoculato in un mezzo liquido sterilizzato ottimale ed il tutto è incubato alla temperatura ottimale del microrganismo, losviluppo avviene secondo le seguenti fasi .

., Fase iniziale o latente. Quando un microrganismo è trasferito in un nuovo mezzo, le sue cellule non comincianosubito a moltiplicarsi, ma attraversano una fase di adattamento. Nel corso della fase iniziale o di latenza non si ha unaumento del carico microbico ma, al contrario, una diminuzione perché una parte delle cellule non soprawive emuore.., Fase dello sviluppo lento. Superate le difficoltà iniziali, le cellule cominciano a moltiplicarsi, ma ancora lentamentecon tempi di generazione lunghi. Il numero di cellule vive aumenta.

., Fase logaritmica o esponenziale. La moltiplicazione awiene con la massima velocità di crescita, che corrisponde alminimo tempo di generazione: le cellule raddoppiano ad ogni tempo di generazione. Il numero di cellule vive aumentavertiginosamente.

., Fase dello sviluppo rallentato. La moltiplicazione awiene con tempi di generazione di poco inferiori a quelliminimi ealcune delle cellule più vecchie muoiono. L'aumento del numero di cellule vive è ancora alto, ma inferiore aquello della fase precedente.., Fase stazionaria. Quando le cellule diventano molto fitte, ognuna di esse non trova, nell'ambiente immediatamente circostante, sufficiente nutrimento per duplicarsi, pur mantenendo un metabolismo attivo. In questo caso sidice che le cellule entrano in fase stazionaria. Gran parte della fermentazione del mosto awiene grazie all'attivitàdi cellule di lievito in fase stazionaria. AI microscopio si può vedere che il numero totale non aumenta nel tempo,

53 Il Il

••••••_1 102

ma è costante. Dopo colorazione con blu di metilene, infatti, si può vedere che il numero totale di cellule nonaumenta e nemmeno il numero di cellule morte. Quando la fermentazione si arresta o procede stentatamente, invece, la moltiplicazione awiene ancora, ma con tempi di generazione più lunghi e numerose cellule muoiono. Ilnumero di cellule vive rimane costante perché le nascite e le morti si equivalgono, ma il numero di cellule morte(e di conseguenza anche il numero totale di cellule) aumenta nel tempo.

., Fase di morte incipiente. Il numero di cellule vive diminuisce.

., Fase logaritmica della morte. la moltiplicazione è del tutto cessata e si verifica soltanto morte delle cellule.In un tempo più o meno lungo la coltura si autosterilizza per morte di tutte le cellule.

2.2_L'accumulo dei prodotti di fermentazione

<prodottidi fermentazione

Durante lo sviluppo nei mezzi liquidi, i microrganismi fermentano glizuccheri e formano i prodotti di fermentazione che sono loro propri (peri lieviti, principalmente etanolo e anidride carbonica). L'accumulo deiprodotti di fermentazione e la corrispondente diminuzione degli zuccheriavviene con modalità che dipendono dalla moltiplicazione cellulare.

NEL CASO DI LIEVITI E DI FERMENTAZIONE ALCOLICA SI VERIFICANO LE SEGUENTI SITUAZIONI:

., durante la prima fase di latenza, le cellule non si moltiplicano e non si ha formazione visibile di etanolo e C02;

., durante la seconda fase e nel corso di tutta la fase logaritmica, la produzione di etanolo e CO2 è particolarmenteintensa;

., durante la fase stazionaria, l'accumulo dei prodotti di fermentazione continua, ma con intensità che decrescenegli ultimi tempi;

., durante la fase di morte incipiente, ancora si formano i prodotti della fermentazione fino ad esaurimentodegli zuccheri, quando tale produzione si arresta del tutto.

<attività fermentativa

2.3_Curve di sviluppo

L'andamento dello sviluppo delle colture microbiche in mezzo liquido puòessere espresso in forma grafica; tuttavia occorre tenere presente che unacoltura in moltiplicazione è costituita da cellule vive, ma anche da celluleche perdono vitalità e inoltre che soltanto le cellule vive svolgono attivitàfermentativa.Le curve di sviluppo riportano sull'asse delle ordinate il numero di cellulevive per unità di volume (normalmente per mL) e non il numero di celluletotali.Pertanto, per tracciare le curve in questione si devono determinare le ufc(mediante conteggi indiretti) e mai le cellule totali (con conteggi diretti).Bisogna però tenere conto del fatto che lo sviluppo dei microrganismi è ditipo esponenziale e che, partendo da poche cellule vive per mL, si arrivarapidamente al livello di circa 1 miliardo di cellule per mL.

Il Il 54


Se il grafico venisse tracciato facendo uso di una normale scala lineare, 1'assedelle ordinate dovrebbe avere una lunghezza di molti chilometri.Per questo motivo si ricorre alla scala logaritmica che permette di contenereil grafico dentro spazi normali. Va rilevato poi che la prima fase, quella di adattamento, nella pratica corrente può essere eliminata con alcuni elementariaccorgimenti: ad esempio eseguendo 1'inoculazione della coltura con un

[Figura 2]l'uso della scala logaritmica consente di tracciare le curve dellosviluppo microbico (espressocome numero di cellule vive perunità di volume) con grafici didimensioni normali.

<scala logaritmica

[Figura 31La formazione di prodotti delle

12 fermentazioni (etanolo ed anidri-

9 h de carbonica nel caso dei lieviti,...... acido lattico nel caso di batteri:2 10 lattici, ecc.) è dipendente dallo"O sviluppo microbico, ma ha anda-~

"' mento differente e viene espressa:c 8 con scala lineare.!ti...Cl......o 6

"Oc::!ti.... 4CII

'"C

tfl. 2~

a bO

O 2 4 6 8 10 12 14Tempo in giorni

55 Il Il

••••••_1 102

~. <

prodottidella fermentazione

[Figura 4]Curva di produzione di anidridecarbonica rilevata durante la fermentazione di un mosto contenente 200 g/L di zucchero.

numero elevato di cellule sviluppate nel medesimo mezzo nutritivo. Le cellule sono già adattate e cominciano subito a moltiplicarsi. È ciò che si faquando le fermentazioni dei mosti vengono affidate a lieviti selezionati.L'accumulo dei prodotti di fermentazione viene invece bene espresso conuna scala lineare e la curva ha andamento differente da quella relativa allosviluppo. Va rilevato che durante la penultima fase il numero di cellulevive diminuisce e la curva di sviluppo si abbassa; ma la coltura ancora simoltiplica e, quindi, i prodotti della fermentazione continuano ad accumularsi ed aumentano. È la fase più delicata, cioè quella che conclude lefermentazioni con l'esaurimento di tutti gli zuccheri.

Data and best-fit curve

100

75

50

25

O{[]~-----r-------r--------'---"------'

Il Il 56

0.0 4.0 8.0

x Tempo in giorni

12.0 16.0

03 Il carico microbico

3.1_Definizioni

Tutti gli alimenti che non siano stati sottoposti a sterilizzazione, cosl cometutte le superfici, gli attrezzi e l'atmosfera, sono contaminati da cellulemicrobiche. Nel caso degli alimenti, le cellule microbiche possono esseregià presenti nelle materie prime di origine oppure derivare da inquinamenti ambientali o di origine umana, involontari o volontari (in questocaso si definiscono inoculi) nelle varie fasi di lavorazione. Se nell'alimento trovano condizioni idonee, i microrganismi si moltiplicano provocando alterazioni oppure benefici, nel caso di materie prime trasformate pervia fermentativa. L'entità di presenza delle cellule microbiche varia inmisura notevole in funzione di diversi fattori ed è espressa con il terminedi carico microbico.Per carico microbico s'intende il numero di cellule microbiche presentinell'unità di volume, 1 millilitro nel caso di mezzi liquidi (quali i mosti edi vini) o di peso, 1 grammo nel caso di materiali solidi. Le cellule microbiche nei liquidi formano sospensioni, mentre nei solidi si trovano allasuperficie del materiale o miscelate con questo.

IL CARICO MleRoBleo PUÒ ESSERE:

1. stabile, perché costituito da cellule non in moltiplicazione;2. in evoluzione, perché costituito da cellule in moltiplicazione;3. omogeneo, perché costituito da cellule di un solo microrganismo;4. eterogeneo, perché costituito da una miscellanea di cellule di varie specie.

<cellule microbiche

<inoculi

<carico microbico

57 Il Il

- 1 103

<conteggio su piastra

<

VBNC

<sviluppo flocculento

<unità facenti colonia

<conteggi diretti

<pasteurizzazione

3.2_le unità facenti colonia (ufc)

Il conteggio su piastra dei microrganismi è sempre il metodo di riferimento con cui confrontare, ad esempio, l'efficacia di tutti gli altri metodi diconta. Consiste nel depositare un'aliquota del campione, se necessario diluito o concentrato, sulla superficie di un terreno di coltura solido. Una voltaassorbita la frazione liquida, le cellule che si sono depositate sul terreno, o alsuo interno, si moltiplicano ma senza potersi muovere, ammassandosi finoa formare una colonia visibile a occhio nudo. Le cellule microbiche presenti in un mezzo possono essere di pronto e rapido sviluppo, ma anche in statodi quiescenza più prolungato. Con il metodo della conta su piastra, soltanto le prime sono capaci di dare colonie in seguito a semina su terreno adatto e sono effettivamente contabili. Le altre colonie sono definite VBNC(Viables But Non-Culturables), cioè "vive ma non vitali".Ogni colonia, generalmente, d~riva dalla moltiplicazione di una sola cellula,ma possono verificarsi eccezioni. Le cellule di alcuni lieviti, ad esempio, hannouno sviluppo flocculento, cioè anche dopo la divisione restano unite inaggregati di molte decine di cellule. Alcuni tipi di preparato, come i lieviti secchi appena reidratati, possono essere costituiti da aggregati di cellule che siseparano con difficoltà e solamente dopo qualche ora di dispersione in mezzoliquido. Inoltre, molti microrganismi hanno cellule riunite in catenelle o piccoli aggregati, ciascuno dei quali dà origine ad una sola colonia. Non è possibile, a posteriori, sapere se una colonia si è originata da una cellula o da unaggregato di più cellule; pertanto, i risultati dei conteggi indiretti vengonoespressi non in termini di numero di cellule per millilitro o per grammo, madi unità facenti colonia (ufclmL o ufclg). I dati orrenibili con i conteggiindiretti sono sempre inferiori al numero di cellule effettivamente presenti.Le cellule morte sono evidentemente incapaci di dare colonie e, quindi,non influiscono in alcun modo sui conteggi indiretti; tuttavia, anch'essepossono avere importanza perché contribuiscono al conferimento della torbidità dei liquidi e non sono immediatamente distinguibili da quelle viveall'esame microscopico. Quando si eseguono conteggi diretti (al microscopio), i risultati che si ottengono sono sempre superiori alle conte su piastra.Molte volte poi, in alcuni alimenti eventualmente sottoposti a particolaritrattamenti (ad esempio, pasteurizzazione), interessa conoscere quale sia ilrapporto fra cellule vive e cellule morte.

3.3_Significato del carico microbico

Da quanto esposto, risulta evidente che il significato del carico microbiconon è univoco e che la sua determinazione si prefigge di ottenere indicazioni di differente natura. In modo molto generico, si può affermare che le analisi microbiologiche si prefiggono di determinare la presenza o l'entità dipresenza di microrganismi che:

1. possono compromettere la qualità igienica del prodotto, perché patogeni o produttori di tossine;2. possono compromettere la qualità commerciale del prodotto, alterando e peggiorando le sue caratteristiche, senzarischio per la salute dei consumatori.

Il Il 58


Quindi in funzione del momento in cui le analisi microbiche sono eseguite,è possibile distinguere due tipi di analisi.

Analisi di processo(sul prodottoall'inizio o durantela produzione)

Analisidi prodotto finito

Consigli utili

Si tratta di analisi semplici, molto utili per mettere a punto epoi per tenere sotto controllo il processo produttivo, e su queste si basa il sistema HACCP (vedi quantosegue). Un'analisi è utile e costituisce un vero controllo qualità, solo quando è indispensabile per prendere decisioni relative al processo. Una buona regola da seguireprima di fare o richiedere un'analisi, microbiologica o di altro tipo, consiste nel valutare quale decisione si prenda una volta conosciuto il risultato. Se la decisione presanon sarà influenzata dal risultato, quell'analisi è inutile e non costituisce un controllo qualità. L'impostazione del piano di controllo qualità è corretta quando si ottienela massima informazione e, quindi, la massima sicurezza sul prodotto finito, con ilnumero minimo di analisi. Essendo di importanza strategica per l'impostazione delprocesso, tali analisi vengono in massima parte eseguite presso laboratori interni,altrimenti sono affidate a laboratori privati o di ricerca.

Le analisi eseguite sul prodotto finito hanno generalmente lo scopo di mettere in evidenza i principali microrganismi responsabili di alterazioni di varia natura. Questo tipodi analisi può essere eseguito presso laboratori pubblici ufficiali, laboratori privati oppure laboratori interni alle industrie.

I gruppi microbici normalmente ricercati in tutti gli alimenti sono:

., quelli potenzialmente patogeni, tossigeni o, comunque, nocivi per i consumatori;

., quelli indicatori di contaminazione fecale;

., quelli in grado di alterare la qualità commerciale del prodotto;

., quelli che intervengono utilmente nei processi di trasformazione fermentativa.

3.4_11 caso del vino

Al riguardo, è opportuno tenere presente che ogni alimento ha una composizione chimica tale da consentire lo sviluppo di un numero più o menolimitato di microrganismi. Analisi microbiologiche, che per alcuni alimentisono assolutamente necessarie, per altri non sono importanti o comunquehanno importanza marginale. La composizione dei mosti e dei vini è deltutto particolare per i seguenti motivi:

., si tratta di mezzi molto poveri di composti azotati, ricchissimi di zuccheri o di etanolo;

., sono mezzi contenenti acidi in quantità tale da determinare valori di pH compresi (normalmente) fra 3.0 e 3.7.

59 Il Il

••••••_1 103

<microrganismi diversi

<MCR

<mosti, vini

<stabilità commerciale

\

Queste condizioni limitano i microrganismi che hanno possibilità di sviluppo al gruppo dei lieviti, dei batteri lattici e dei batteri acetici. Nessun batterio patogeno o tossigeno ha possibilità, non solo di sviluppo, ma anche disopravvivenza e la sua analisi non ha quindi senso (e di fatto non viene eseguita). Questo vale anche per i batteri indicatori di contaminazione fecalequali Escherichia coli ed enterobatteri in genere.La ricerca di microrganismi diversi da quelli tipici del vino può invece avereinteresse per altri materiali di cantina, come i mosti concentrati, i mostimutizzati, i mosti concentrati rettificati (MCR) nei quali, per vari motivi(contatto con l'aria, pH elevato), possono sviluppare o sopravvivere varimicrorganismi, quali le muffe e gli stessi batteri coliformi in (MCR).Lanalisi microbiologica può essere estesa anche all'ambiente di cantina(pareti, atmosfera) e agli attrezzi impiegati nelle varie fasi di lavorazione.

3.5 Determinazione del carico microbico

Premessa

Le analisi microbiologiche nelle industrie agro-alimentari rappresentano unafase molto importante del controllo degli alimenti, particolarmente quandoc'è il rischio che questi possano essere contaminati da microbi patogeni.Fortunatamente, quest'ultimo non è il caso dei prodotti dell'enologia perché,a causa dei bassissimi valori di pH, nei mosti e nei vini i batteri patogeni nonpossono né svilupparsi né sopravvivere a lungo. È per questo motivo che lenormative sui controlli microbiologici riguardanti il settore igienico-sanitario,si riferiscono a numerosi prodotti derivanti da materie prime a rischio e nona prodotti enologici.La conseguenza di questo dato di fatto è che i controlli microbiologici deimosti e dei vini non sono obbligatori e perciò non sono eseguiti sistematicamente. Quando lo sono, servono a fini di studio e di ricerca, per usointerno oppure per garantire la stabilità dei prodotti dal punto di vistacommerciale: spesso è proprio quest'ultima motivazione che li rendenecessari. Questa situazione, certamente tranquillizzante da molti punti divista, tuttavia non rende più facili i controlli.

Il Il GO

04 Il campionamento

4.'_Definizione e procedura

Se si vuole conoscere la composizione di una certa massa di un alimento, liquido o solido, non è necessario analizzarla tutta, soprattutto perché molte analisi sono distruttive e quindi si perderebbe l'intera massa. Si suppone allora chesia possibile determinare la composizione di una piccola quantità di alimentoe generalizzare all'intera massa i risultati ottenuti sul campione: questo processo di generalizzazione si definisce inferenza. È determinante, per il processodi inferenza, che la composizione del campione sia uguale a quella dell'interamassa: cioè il campione deve essere rappresentativo; la rappresentatività deicampioni dipende dal volume di materiale che viene prelevato rispetto allamassa o dal numero di pezzi rispetto al totale.

Prelievo dei campioni

Il prelevamento dei campioni deve essere attuato in modo da non provocarealcuna contaminazione da microrganismi estranei.

<inferenza

LE REGOLE DA RISPETTARE SONO LE SEGUENTI:

., USO di materiali di presa (cucchiai, sonde, pipette, pinze ecc.) e di raccolta (bottiglie, flaconi, sacchetti di plastica)sterilizzati;., rispetto delle precauzioni di asepsi in tutte le fasi;., chiusura dei recipienti contenenti i campioni in modo da evitare contaminazioni;., applicazione di una etichetta che permetta l'individuazione del campione;., mantenimento del campione a temperatura adeguata.

61 Il Il

••••••_1 104

<Brettanomyces

<barrique

<rimontaggio

<inquinamento microbico

<piano di campionamento

In alcuni casi il problema della contaminazione non esiste e ciò che si devefare è solo l'etichettatura: ad esempio quando il campione sia confezionatoin recipiente chiuso come una bottiglia tappata o una scatoletta.Nel prelevare un campione da un serbatoio, da una tubazione o da un'apparecchiatura che fa parte di un impianto più complesso (filtrazione, imbottigliamento ecc.), è necessaria un'attenta valutazione dell'omogeneità dellamateria prima. Un mosto in piena fermentazione, ad esempio, è costituito dauna massa che si può considerare omogenea: la produzione continua e la risalita di bollicine di anidride carbonica mantengono in sospensione i microrganismi presenti e il prelievo può essere effettuato a qualunque livello del serbatoio. Quando però la fermentazione rallenta, le cellule di lievito iniziano asedimentare, dando origine ad un gradiente di concentrazionecellulare, all'interno del serbatoio, che cresce dall'alto verso il basso. Un campione di mosto in cui la fermentazione è nella fase finale, può contenere unnumero significativamente diverso di cellule, a seconda che sia stato prelevato dall'alto, dal rubinetto "assaggiavino", dalla valvola di scarico o dalla valvola di fondo. Se poi il campione è relativo ad un vino in conservazione, ilprelievo è ancora più difficile. In un vino posto in un serbatoio o in una botteda qualche giorno, i lieviti sono tutti depositati sul fondo e lì svolgono le loroattività metaboliche. Negli ultimi anni è diventata molto frequente la ricercadi lieviti del genere Brettanomyces, che possono moltiplicarsi nel vino in conservazione per molti mesi, producendo acido acetico, fenoli volatili e aromisgradevoli. Questi lieviti si possono trovare solamente se il prelievo vieneeffettuato dalla parte più bassa del serbatoio o della botte perché sono depositati sul fondo. Se invece si preleva dalla parte alta del recipiente, come avviene spesso per le botti piccole o barrique, si rischia di non trovare cellule chesono presenti, invece, nella massa del vino. Una quantificazione precisa delcarico di questi lieviti può essere fatta dopo avere rimesso in sospensione ildeposito (rimontaggio), oppure immediatamente dopo un travaso, ma ciònon è sempre agevole o indicato. In alternativa, si può accettare di avereun'indicazione imprecisa e fare un prelievo direttamente dalla parte più bassadel contenitore, ma il valore di ufclmL ottenuto non può essere riferito allamassa totale del vino.Il caso delle bottiglie è invece diverso: ognuna di esse, dal punto di vista microbiologico, è un'entità indipendente dalle altre. Una bottiglia può conteneremicrorganismi e quelle prodotte immediatamente prima e dopo no.I..:inquinamento microbico, durante l'imbottigliamento, avviene spesso a"macchia di leopardo": sbalzi di pressione durante le fermate e le ripartenzedelle linee, gocce di condensa che possono colare lungo gli ugelli dell'imbottigliatrice, sterilizzazione imperfetta di qualche ugello, possono fare sì che siabbia una contaminazione pari a circa 10-15 ufcll00 mL nel 3-5% delle bottiglie. Si tratta di una contaminazione da considerarsi fisiologica, difficile daeliminare, ma poco grave, perché difficilmente un numero così esiguo di cellule riesce a moltiplicarsi in vini cui solitamente è appena stata aggiunta anidride solforosa. In questo caso, si deve istituire un piano di campionamentoche si riferisce al numero di unità campionarie da analizzare e ai criteri chedevono essere applicati.

Il Il 62


Si definisce lotto l'insieme delle unità prodotte, trattate e confezionate in condizioni uniformi di un ciclo di produzione omogenea e identificabile. Percampione si intende la parte di unità da sottoporre ad analisi; nel caso diesame di "pezzi", ad esempio bottiglie rappresentative di un lotto di imbottigliamento, un campione è formato da n unità campionarie prelevate dall'insieme del lotto. Il numero di campioni da esaminare dipende dalle dimensioni del lotto e dalla quantità massima di campioni "non conformi" che si èdisposti a tollerare. La norma UNI-ISO 2859, Procedimenti diCampionamento neL CoLlaudo per Attributi, fornisce le specifiche necessarie.Le operazioni eseguite durante il prelevamento e quanto è connesso con questo, vanno accuratamente annotate in un registro. Quando le analisi hannocarattere di ufficialità, tutte le unità devono essere prelevate in doppio(un campione a disposizione della parte) e deve essere compilato un verbale nel quale vengono specificati il luogo, la data di produzione e di scadenza, il nome e la qualifica del prelevatore, la natura e il numero delleunità del lotto, il numero dei campioni prelevati e il luogo in cui questisaranno inviati. Nel verbale, caso per caso, dovrà essere fornita ogni altraindicazione utile al fine di dare la corretta interpretazione dei risultati.

Piani di campionamento

I piani di campionamento consistono nella formulazione di regole precise inmerito al numero di campioni da prelevare. Si tratta di una decisione moltodifficile, perché il piano di campionamento deve conciliare differenti esigenze: la rappresentatività del campionamento e l'attendibilità dei risultati, l'effettiva possibilità di eseguire un grande numero di analisi, specialmente nelcaso di controlli interni, e i costi derivanti sia dalle analisi sia dalla distruzione di una parte del prodotto (si pensi, ad esempio, al caso dei prosciutti cottio ai vini di particolare pregio).In igiene alimentare, quando si deve dare la ragionevole certezza dell'assenza di batteri patogeni (quali le salmonelle), i piani di campionamento sonocodificati, prodotto per prodotto, da precise normative internazionali e sonopiuttosto complessi.

Trasporto e conservazione dei campioni

Il trasporto e la conservazione dei campioni costituiscono una fase molto·delicata, perché le modalità con cui vengono eseguiti possono essere causadi modificazione dello stato microbiologico: possono, cioè, provocare unaumento del carico microbico (per sviluppo di cellule) o una sua diminuzione (per morte di parte delle cellule). In linea di massima, per il trasporto èbene avere a disposizione delle cassette coibentate e refrigerate (con ghiaccio

<lotto

<campione

<UNI-ISO 2859

<doppio prelievo

<igiene alimentare

63 Il Il

• •••••_1 104

<

mosto in fermentazione

<temperatura

o placche eutectiche) che assicurino una temperatura compresa fra Oe 4°C.Se il campione rappresenta un prodotto finito sterile, non ci sono grossi problemi di trasporto o conservazione; se rappresenta un prodotto finito che devemantenere una certa carica microbica viva e vitale (ad esempio uno yogurt), èbene che sia conservato come prescritto anche durante il trasporto. Se il campione rappresenta un prodotto in fase di lavorazione (mosto/vino), allora lecondizioni di trasporto e conservazione possono essere particolarmente critiche. È opportuno che non trascorrano più di 1-2 ore tra il momento del prelievo del campione e il momento in cui questo viene analizzato. Si deve considerare che, se si prelieva un campione di mosto in fermentazione, anche selo si mette immediatamente a 4°C, impiega parecchie decine di minuti a raffreddarsi, mentre i lieviti in attiva moltiplicazione si duplicano in 2 ore circa;quindi, il tempo che intercorre fra prelievo e analisi deve essere più ridotto,mentre può essere maggiore se i microrganismi presenti sono quiescenti.Una volta giunti in laboratorio, i campioni devono essere sottoposti adanalisi il più rapidamente possibile e, se necessario, conservati ancora atemperatura di frigorifero. È bene evitare il congelamento che può provocare la morte di alcuni microrganismi, soprattutto batteri tossigeni opatogeni. Nel caso di prodotti confezionati in bottiglie o scatole, queste. . .preCaUZlOnl non sono necessane.

4.2_Preparazione del campione

Le cellule microbiche, nel prodotto da analizzare, possono essere presenti innumero che oscilla fra valori estremi, distanti anche dieci miliardi di voltefra loro! In un mosto in piena fermentazione alcolica, infatti, il carico cellulare è a livello di alcune centinaia di milioni di unità per millilitro, mentrein un vino chiarificato i lieviti possono essere assenti o presenti in numerodi poche unità per litro. Questo vale anche per i batteri lattici e acetici.Qualunque sia il metodo seguito e il materiale da analizzare, talvolta ci sitrova di fronte alla necessità di diluire il campione in esame, mentre altrevolte si verifica la necessità di concentrare il campione stesso.

Diluizione (lei campioni

Il metodo qui riportato è quello generale seguito per tutti i liquidi conì carico microbico molto elevato e che trova la sua descrizione in numerosi

metodi di analisi microbiologica.

Materiali e attrezzature

., Soluzione fisiologica: 9 grammi di NaCI sciolti in 1 litro di acqua distillata. Matracci da 200 mL contenenti circa100 mL di soluzione fisiologia (tutto sterilizzato).In alternativa alla soluzione fisiologica possono essere utilizzati:., soluzione fisiologica peptonata (soluzione fisiologica + peptone 1 g/L);., acqua peptonata (1 grammo di peptone in un litro di acqua distillata). Èil diluente da preferirsi, in quanto dà lapercentuale più alta di recupero delle cellule di lievito;., soluzioni di tampone fosfato;

Il Il 64


., altre in casi particolari;

., se possibile, palloni tarati da 100 mL, contenenti 90 mL di soluzione fisiologica (tutto sterilizzato) e pipette da10 mL sterilizzate;., provette normali contenenti 9 mL di soluzione fisiologica (tutto sterilizzato);., pipette da 1 mL sterilizzate oppure micropipette a volume fisso da 1000 mL con puntali monouso sterili;., agitatore meccanico;., etichette autoadesive.

Procedimento

1. Preparare tutto il materiale occorrente sotto cappa a flusso laminare, apponendo le etichette che identificano ilcampione e la diluizione. I-

2. Diluizione 10-1. Nel caso vi sia ampia disponibilità di materiale, operare come segue. Dal campione in esame,agitato e omogeneizzato, prelevare con pipetta 10 mL della sospensione. Aggiungere la sospensione alla soluzionefisiologica in pallone tarato da 100 mL, avendo cura di lavare 2-3 volte la pipetta. Portare a segno, usando un'altrapipetta sterilizzata, con il diluente sterile dei matracci. Eliminare il tappo di cotone e chiudere il pallone tarato coltappo (sterilizzato) di vetro o di plastica. Agitare molto bene, tenendo il pallone tarato ribaltato. Questa è la primadiluizione, che si indica come diluizione 10-1, nella quale il campione e il diluente sono nel rapporto 1:10. In caso discarsa disponibilità di materiali, la diluizione 10-1 può essere preparata come le successive, descritte qui di seguito.3. Diluizione 10-2• Prelevare dalla prima diluizione (10-1) 1 mL di sospensione con pipetta sterilizzata e aggiungerlo a 9 mL di soluzione fisiologica in provetta, lavando più volte la pipetta. Nel caso si usi una micropipetta,tenere conto che la parte effettivamente sterile è solo il puntale e non il corpo della micropipetta. Agitare benecon agitatore meccanico a vortice per 10-20 secondi.4. Diluizione 10-3 e successive. Prelevare dalla seconda diluizione (10-2) 1 mL di sospensione con pipetta sterilizzata e aggiungerlo a 9 mL di soluzione fisiologica in provetta, lavando più volte la pipetta. Agitare bene conagitatore meccanico. Preparare le altre diluizioni (10-4, 10-5 ecc.) con lo stesso procedimento.

Volume di Volume di Volume 1a Volume di Volume 2a Volume di Volume 3a Volume dicampione diluente diluizione diluente diluizione diluente diluizione diluente

Mostocon 100

10 mL 90 mL 1 mL 9 mL 1 mL 9 mL 1 mL 9 mLmilioni

dicellule

diluizione diluizioneper mL. 1a diluizione 2a diluizione10-1 10-2 10-3 10--4

contenente contenente contenente contenente10 milioni 1 milione 100.000 10.000 celluledi cellule di cellule cellule per millilitro

per millilitro per millilitro per millilitro

[Tabella 3]Schema della diluizione dei campioni.

65 Il Il

••••••_1 104

4.3_Conteggio diretto

<metodo diretto

La determinazione del numero totale di cellule per unità di volume può essere eseguita con metodo diretto, vale a dire con conteggio al microscopio.Si utilizzano, a questo fine, i vetrini (o camere) contaglobuli, originariamenteconcepiti per il conteggio dei globuli rossi del sangue. Esistono diversi tipi dicontaglobuli identificati dal nome dei loro progettisti, ma in enologia i piùdiffusi sono solo due:

1. il contaglobuli di Burker; 2. il contaglobuli di Thoma.

Quadratopiccolo

Quadrato grandeLati =0.2 mmSufterficie =0.04 mm2

Va ume (0.04 mm2 x 0.1 mm) =0.004 mm3

0.025 0.2 mm 0.05 mmmm

<

contaglobuli

[Figura 5]Contaglobuli BOrker. Figure geometriche identificate dal reticolo.

Il contaglobuli di Biirker è il più idoneo per conteggi di cellule di lievito edè quello che più spesso viene impiegato a questo fine.

Il contaglobuli è costituito da un vetrino porta-oggetti di notevole spessore(0.4 cm) che, nella sua parte superiore, presenta:• due parti laterali piane recanti, verso l'esterno, dei buchi nei quali possono essere sistemate delle pinze a molla;• una parte centrale piana più bassa, rispetto alle ali, di 0.1 mm. Il pianocentrale è separato dalle ali da due scanalature ed è, a sua volta, diviso in dueparti da una scanalatura collegata con le precedenti;

• due reticoli uguali, ciascunodei quali è tracciato su uno deidue piani centrali;• un vetrino copri-oggetti dimaggiore spessore rispetto allanorma, e perciò rigido, di dimensioni tali da poter essere appoggiato sulle parti esterne e da coprirebene i due reticoli; la parte inferiore del copri-oggetti è distante 0.1mm dal piano su cui è tracciato ilreticolo;• due pinze a molle che, unavolta fissate nei buchi del portaoggetti, tengono ben fermo ilvetrino copri-oggetti.Il reticolo è formato da una seriedi righe perpendicolari incise sulvetro che identificano quadrati (erettangoli) di differente superficie. Come mostrato in Figura 5, iquadrati più grandi hanno un latodi 0.2 mm (200 ~m) ed unasuperficie di 0.04 mm2; tenendoconto dell'altezza di 0.1 mm, essi

Il Il 66


identificano un parallelepipedo di0.004 mm3 di volume. Per farel mm3, occorrono quindi 250 diquesti parallelepipedi; mentre perfare l cm3 ne occorrono 250.000.Intorno ai quadrati grandi sonotracciate 2 righe parallele distanti fraloro 0.05 mm. Queste righe, intersecandosi, individuano dei quadratipiccoli situati ai vertici di quelligrandi. I quadrati piccoli hanno unasuperficie di 0.0025 mm2 e individuano un volume di 0.00025 mm3.

Per fare l mm3 occorrono 4.000quadrati piccoli, per fare l cm3 neoccorrono 4 milioni.Alternativamente, le due righeparallele ne hanno una terza in posizione centrale; queste tre righe dividono ulteriormente alcuni quadratipiccoli in altri quattro quadrati dellato di 0.025 mm.

l..

Il contaglobuli di Thoma

Ha un reticolo con righe perpendicolari distanti 0.05 mm. I quadratihanno le stesse dimensioni di quelli piccoli del contaglobuli Biirker e nonsono immediatamente evidenti quelli grandi. Questi ultimi, tuttavia, possono essere ugualmente individuati dalle triple righe come è illustrato nellaFigura 6. Il contaglobuli Thoma è molto più piccolo del contaglobuliBiirker e ha una superficie complessiva inferiore.

[Figura 6]Contaglobuli di Thoma. Lerighe perpendicolari individuano solo quadrati piccoli (Iato =0.05 mm). Anche il quadratogrande con lato = 0.2 mm(ombreggiato) può essere trovato, ma con qualche difficoltà.

~rocedimentoCon pipetta Pasteur o con puntale monouso, si preleva circa 1 mL del campione (o di una sua diluizione). Siposano 1-2 gocce al centro di ognuno dei piani centrali del contaglobuli dove si trovano i reticoli; si copre iltutto con il vetrino copri-oggetto, appoggiato ai piani laterali, e lo si fissa con le molle a pinza. Il liquido ineccesso si raccoglie nelle scanalature (che servono a questo), mentre sopra i reticoli ne rimane uno strato alto0.1 mm. Si procede quindi con l'esame al microscopio.Nel caso di conteggio di lieviti, l'ingrandimento può essere compreso fra x 150 (ad esempio, obiettivo x 15 eoculare x 10) e x 400. Si mette a fuoco uno dei due reticoli e si contano le cellule contenute in 10 quadrati grandi, avendo presenti i seguenti punti .., Il contaglobuli Burker contiene molti quadrati grandi; prima di eseguire il conteggio è necessario stabilire qualiquadrati verranno esaminati e rispettare senza eccezioni la scelta effettuata. Ad esempio, dopo avere individuato

r~:_t~~::=:==:======::::::::::=:::::::::::::::::::=:: :=::=:::=:===:=::~~::::::~~:::::::::::=::=:::=::::::~~=:::::::::::=:::::::::::=:::=::=:::=::...........__ _ _ _ _-_ _ _-----------------------._._.._._.__._._._---_._._._----------------.----.--.---------------_._._._---------------------------------_._._----_._._-------

67 Il Il

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e contato il primo quadratino grande, si può utilizzare una tabella dei numeri casuali, da cui si leggono due numeriper volta, che rappresentano le coordinate (ad esempio a destra e in basso) in base alle quali muovere il vetrino perindividuare il successivo quadratino da contare dopo quello già contato. In alternativa, cominciare dal quinto da sinistra in alto, poi saltarne cinque efare un nuovo conteggio, saltarne altri 5 econtare, poi andare in diagonale ecc. Ma,si ripete, ciò che è veramente importante è stabilire prima in quali quadrati eseguire il conteggio, per evitare il rischiodi essere influenzati da convinzioni, aspettative ecc.., È necessario saper riconoscere agevolmente le cellule dei lieviti e non confonderle con altro materiale insospensione (se presente) .., Un numero troppo elevato di cellule in ogni quadrato rende difficoltoso il conteggio; in questo caso è megliopassare ad una diluizione successiva.., Ci possono essere cellule sulle righe: si pone allora il quesito se contarle o no. Una buona prassi è contarequelle che giacciono, anche solo parzialmente, su due lati (ad esempio quello in alto e quello a sinistra), e noncontare quelle che giacciono, anche solo parzialmente, sugli altri due lati (ad esempio, quello in basso e quelloa destra).., Ci possono essere cellule in moltiplicazione o riunite in corte catene. Le cellule gemmanti vanno contate per una;per quelle eventualmente in catena si può fare un doppio conteggio.., Le cellule riunite in aggregati (caso dei ceppi flocculenti) non sono contabili, ma il loro numero va stimato, perchésono cellule effettivamente presenti e metabolicamente attive. I lieviti secchi appena reidratati si presentano spessoin aggregati di molte cellule, ma queste si staccano entro poche ore, quindi vanno contate come cellule presenti.

[Figura 7]Schema di individuazione deiquadrati in cui procedere alconteggio delle cellule.

Terminato il conteggio di un reticolo si passa all'altro reticolo dello stessocontaglobuli e si ripete l'operazione; infine si fa la media dei valor.i determinati per arrivare poi al risultato del carico microbico totale. Il calcolo dafare è molto semplice perché ad ogni cellula presente nei quadrati grandicorrispondono 250.000 cellule per mL nella sospensione impiegata.Si supponga, ad esempio, di avere eseguito il conteggio di un campionenon diluito e di avere trovato una media di 12.7 cellule per quadrato grande. Per risalire al carico totale del campione si fa la moltiplicazione: 12.7x 250.000 = 3.175.000, numero che corrisponde alle cellule presenti in 1

mL di campione. In modo piùveloce, si può dividere per quattroil valore della media trovata e siottiene il risultato espresso inmilioni di cellule per mL. Se ilcampione sottoposto ad esamecontiene un numero di celluletroppo alto, tanto da rendere .impossibile o anche solo difficileil conteggio nei quadrati grandi,ci si può rivolgere ai quadrati piccoli moltiplicando poi il numeromedio di cellule per 4 milioni. Ilrisultato ottenibile è però pocoaccurato per vari motivi; meglio,allora, ricorrere ad una diluizionedel campione (10-1 oppure 10-2

Il Il 68

• Parte Seconda Speciale I I I I

ecc.) moltiplicando il risultato ottenuto per la diluizione (x lO oppurex 100 ecc). Se il campione sottoposto ad esame contiene un numero bassodi cellule (con molti quadrati grandi vuoti), si può eseguire il conteggiodell'intero reticolo ripetendo l'operazione più volte. In questo caso, lamedia dei valori trovati va divisa per 0.9 (volume totale in mm3 del contaglobuli) e moltiplicata per 1000. Al di sotto di un carico microbico di105 cellule per mL, il conteggio diretto non è più possibile, in quanto lecellule sono troppo rade.

4.4_Conteggio indirettoIl conteggio indiretto viene eseguito mediante semina in piastra su terreno \adatto di volumi noti del campione in esame e di sue diluizioni. Le cellulevive e vitali, e soltanto queste, si moltiplicano e dopo alcuni giorni formanocolonie visibili e facilmente contabili. Tuttavia, non tutte le cellule vive dannoorigine a colonie (per vari motivi, fra cui quello di un ritardo nell'inizio dellamoltiplicazione) e le cellule riunite in aggregati o in corte catene formano unasola colonia; quindi, quello determinato con il conteggio indiretto non è ilnumero di cellule, ma il numero di unità facenti colonia (ufc). Quando è possibile effettuare sullo stesso campione sia un conteggio diretto sia uno indiretto, si rileva che il numero di ufc è sempre inferiore al numero di cellule totali.

<cellule vive e vitali


., Scatole Petri di 9 o 10 cm di diametro già predisposte con terreno solido (agarizzato) adatto al microrganismo inesame.., Pipette sterilizzate da 1 mL o micropipette con puntali sterili da 1 mL.., Stenditore sterilizzato (bacchetta di vetro piegata a Lo a triangolo) .., Termostato a temperatura adatta (25°C nel caso di più specie di lieviti, di 30°C se interessano solo i lievitiSaccharomyces) .

Procedimento

Si preleva 1 mL con pipetta sterilizzata direttamente dal campione. L'intero contenuto della pipetta viene messosulla superficie del terreno precedentemente versato in piastra e solidificato ed è esteso e distribuito sulla superficie stessa. Il terreno non deve essere troppo umido e, per questo, deve essere preparato in piastra con un giorno di anticipo; per i microrganismi più comuni si trovano in commercio piastre già preparate con il terreno epronte per la semina. Poiché 1 mL può richiedere molto tempo per essere assorbito, si può inoculare 0.2 mL: inquesto caso bisognerà moltiplicare per 5 il numero di colonie contate. In queste condizioni, il terreno assorberapidamente l'acqua e le cellule si depositano sulla sua superficie. Questo procedimento è l'unico che deve essere seguito esclusivamente per i microrganismi strettamente aerobi (batteri aerobi obbligati quali gli acetici e lieviti privi di attività fermentativa). Nel caso di batteri anaerobi o di lieviti fermentanti, l'inoculazione può avvenire anche per inclusione. Il millilitro di campione è versato al centro della piastra vuota; immediatamente siaggiunge il terreno nutritivo ancora fuso e si miscela per bene il tutto ruotando gentilmente le piastre (senzafare debordare il terreno) più volte, prima in senso orario poi in senso antiorario. Le cellule microbiche si distribuiscono uniformemente in tutto il volume del terreno. In questo caso il terreno non deve essere troppo caldo,

69 Il Il

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per non stressare i microrganismi; pertanto deve essere sterilizzato in provette in aliquote di 10-12 mL, ognunada versare in una piastra, e dopo la sterilizzazione deve essere mantenuto immerso in un bagno termostatatoa 45-50 0(, in modo tale che l'agar-agar si mantenga liquido, ma si raffreddi e si solidifichi rapidamente unavolta versato in piastra.Secondo la norma ISO 7218: Microbiology of food and animaI feeling stuffs - GeneraI rules for microbioogical examinations, le piastre si definiscono contabili se contengono un numero di colonie compreso fra 15 e 300. AI di sottodi questo numero il valore trovato è troppo approssimativo, tanto che se non esistono repliche il risultato della contadeve essere espresso come "valore stimato". Se una piastra contiene più di 300 colonie non è detto che tutte lepotenziali ufc siano effettivamente riuscite a dare origine a colonia, per l'eccessiva fittezza ecompetizione per il nutrimento. Inoltre, se le colonie sono molto fitte, sono anche piccole, ed è più probabile commettere errori nel conteggio.Anche in questo caso il risultato di un conteggio può essere solo approssimato e va espresso come "valore stimato"[Figure 8 e 9]. Pertanto, la semina o l'inoculazione in piastra deve essere eseguita non soltanto con il campione, maanche con due o tre sue diluizioni; questo perché, se il carico microbico è elevato, sviluppano troppe colonie (praticamente non contabili). In molti casi può convenire cominciare non con il campione ma già con una sua diluizione. Adesempio, un mosto subito dopo la pigiatura dell'uva contiene poche cellule di lievito; per il conteggio si può utilizzare direttamente 1 mL del campione. Un mosto in piena fermentazione ha un carico di cellule di lievito superiore a 100milioni di unità per mL; in questo caso conviene cominciare il conteggio dalla diluizione 10-5 e proseguirlo fino alladiluizione 10-7 in modo da ottenere almeno una piastra con colonie ben contabili.

Campione non diluito Diluizione 10-1 Diluizione 10-2 Diluizione 10-3

- - - -1000 100 10

[Figura 8]

Conteggio in piastra di un mezzo con un carico microbico di 1.000 cellule (ufc) per mL.

Diluizione 10-4 Diluizione 10-5 Diluizione 10-6 Diluizione 10-7

- ì - - -10.000 1000 100 10

[Figura 9]

Conteggio in piastra di un mezzo con un carico microbico di 100 milioni di cellule (ufc) per mL.

Per ottenere risultati attendibili è bene replicare più volte il conteggio indiretto dello stesso campione o di più campioni della stessa origine, per avere valori medi che possono essere sottoposti ad analisi statistica. Quando per ilconteggio si impiega una diluizione, si risale al numero di cellule del campione con una semplice moltiplicazione.

Il Il 70


4.5_Concentrazione del campioneÈ molto frequente che i microbiologi analisti siano chiamati a stabilire se inun liquido, un mosto o un vino, ci siano cellule vive di lieviti o di batteri,anche in numero bassissimo. Lanalista deve accertare se in un notevole volume di vino (per ipotesi: l litro) siano presenti anche poche cellule microbichevive. Questo è il caso, ad esempio, di un vino già confezionato in bottiglia esuscettibile di subire sviluppo di lieviti o batteri lattici, agenti di una alterazione, quale la formazione di torbidità, che ne compromette la commerciabilità.

La centrifugazioneLa concentrazione del campione tramite centrifugazione, discontinua o continua, in teoria potrebbe essere il metodo più idoneo per il tipo di analisi inesame ma non è assolutamente praticabile perché troppo complesso e perchéespone i campioni ad un elevato rischio di inquinamento. Ottimi risultati,per concentrare il campione, possono essere invece conseguiti applicando ilmetodo della filtrazione.

La filtrazione

La filtrazione per fini analitici consiste nel fare passare attraverso una membrana porosa un grande volume di liquido; le cellule, se presenti, non attraversano il filtro e sono trattenute sulla superficie della membrana. Una voltaterminata l'operazione, si tratta di determinare il numero totale di colonieche si sviluppano sul filtro, facendo uso di terreni nutritivi idonei.

ateriali e attrezzature., Pompa per vuoto a motore o ad acqua.., Dispositivo da laboratorio per filtrazione sterilizzante composto da: rampa per filtrazione a più fori, per eseguirecontemporaneamente 3 o più filtrazioni (in alternativa: matraccio raccoglitore da vuoto, capacità 1 litro, collegabilecon pompa per mezzo di appendice laterale); tappo di gomma con foro centrale; porta-filtri con griglia di materialeporoso; imbuto a base larga perfettamente aderente al porta-filtri, sterilizzabile e sterilizzato; ganascia a molla pertenere collegati il porta-filtri e l'imbuto.., Filtri a membrana di diametro idoneo per il dispositivo di filtrazione (porosità 0.22 o 0,45 mm) sterili .., Cilindri sterili da 100 e/o da 500 mL. ., Lampada di Bunsen.., Pinze elastiche di ferro. ., Scatola Petri con terreno di coltura.Procedimento., Allestire l'apparato di filtrazione con membrana porosa da 0.22 o 0,45 11m su banco di laboratorio o, meglio, sottocappa a flusso laminare.., Collegare il raccoglitore con pompa da vuoto.., Flambare il collo del recipiente che contiene il campione. Questa operazione è piuttosto importante quando si effettua il controllo di sterilità di un vino imbottigliato, che può contenere cellule di lieviti o muffe sul collo o sulla superficie esterna dell'imboccatura. Una flambatura efficace si ottiene immergendo per 1-2 cm la bottiglia capovolta inetanolo e poi passando il collo della stessa sulla fiamma, dando fuoco. L'alcol brucia in pochi secondi, sufficienti peruna buona sterilizzazione superficiale, ma senza surriscaldare eccessivamente il collo della bottiglia.., Versare il campione nel cilindro sterile fino al volume desiderato, facendo attenzione a non versare nell'imbutoil liquido che può essere colato all'esterno della bottiglia, contaminandosi.

71 Il Il

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IMETODO DEL FILTRO A MEMBRANA I

Osservazioni

Con la filtrazione su membranaporosa, tutte le cellule sospese nelcampione rimangono aderenti allaparte superiore della membranastessa. Il campione liquido destinato alla filtrazione deve essere sufficientemente limpido e non causareostruzione dei pori a causa di altromateriale in sospensione.

[Figura 10]Metodo della filtrazione su membrana.

., Attivare la pompa da vuoto.

., Versare il campione nell'imbutomano a mano che in questo cala illivello.., Continuare l'operazione finchéil campione è stato filtrato (da100 mL a 0.5 litri) .., Togliere la ganascia a molla el'imbuto.., Prelevare con pinze sterilizzatealla fiamma la membrana filtrantee posarla in una scatola Petri contenente il terreno di coltura.

c) su unbatuffoloimbevuto diacquasterile

a) scatoladi Petricontenenteagar

b)su unbatuffoloimbevuto dibrodo dicoltura

@................---. .Il filtro a membrana è posizionato su

un brodo di coltura - a b o c -e incubato

Il campione è filtratoL

--.-/attraverso un filtroa membrana.

~~

---- ---- - ---- --------

'_Analisi microbiologica del!'aria

I microrganismi dell'ariaCom'è ben noto, nell'aria sono sospese numerose piccoleparticelle solide di diversa natura che, nel loro insieme,costituiscono il cosiddetto p'ulviscolo atmosferico. Fra icomponenti del pulviscolo sono da annoverare anche imicrorganismi, presenti sotto forma di conidi fungini, cellule di lieviti edi batteri, spore batteriche, derivanti da variambienti (dal terreno, dalle acque, da sostanza organicain fermentazione ecc.). Molti microrganismi sono presentinell'aerosol che si forma in occasione delle operazioni dipulizia di ambienti, impianti e attrezzature, quando siusano getti violenti di acqua. Tutte le forme microbichepresenti nell'aria secca sono invece in stato di più o menointensa disidratazione e quindi in stato di quiescenza.I microrganismi dell'aria sono spostati eportati dal vento e,in assenza di turbolenze, tendono a depositarsi. Essi sonocausa di contaminazione di diversi materiali compresi

>

quelli usati in laboratorio per analisi microbiologica e, inalcuni casi, possono essere causa di malattie e di allergie.La loro densità e composizione non sono costanti e dipendono da diversi fattori, quali la distanza dalla fonte di inquinamento e la sua natura, la presenza o assenza di movimenti dell'aria ed altri ancora. Così, ad esempio, l'atmosfe-ra delle zone desertiche o delle alte quote è poverissima dimicrorganismi, a differenza di quella che sovrasta i territo-ri con intensa vegetazione e ricchi di sostanza organica.Ancora, l'aria di un ambiente di lavorazione è portatriceprevalentemente di microrganismi di un certo tipo: i microrganismi di un ambiente di cantina sono diversi da quellipresenti in un caseificio o in un salumificio o in una stalla. •L'analisi quantitativa e qualitativa dei microrganismi dell'aria può essere importante dal punto di vista sanitario e •tecnologico perché dà utili informazioni sulle ossibilità, i •

>ApPLICAZIONI

Il Il 72


rischi ed i tipi di contaminazione di vari prodotti alimentarie delle condizioni igieniche degli ambienti di lavorazione.

Prelevamento dei campioni

Il metodo di norma seguito per l'analisi microbiologica dell'aria non differisce, dal punto di vista concettuale, da quello della filtrazione dei liquidi prima descritto. Si tratta, indefinitiva, di far passare un volume noto di aria attraversouna membrana con porosità tale da trattenere tutti imicrorganismi. Questa operazione, che può essere considerata un vero eproprio campionamento, è eseguita sul postoimpiegando idonee attrezzature costruite a questo fine.L'apparato filtrante, nelle sue linee essenziali, è costituitoda una bocca per la presa dell'aria, da un flussimetro chemisura il volume di aria prelevata, da una griglia sulla qualesi pone la membrana porosa (pori di 0.22 mm) e da unapompa aspirante. Esistono in commercio diversi tipi diapparati filtranti dotati di differenti prestazioni, soprattuttoin fatto di attendibilità dei risultati. I microrganismi presenti nell'aria sono trattenuti sulla superficie del filtro. Alcuniapparati non hanno filtri e sono progettati in modo tale dafar compiere all'aria una curvatura molto stretta, cosicchéle particelle in sospensione vanno a depositarsi sulla superficie del terreno colturale di una scatola Petri posta immediatamente sotto la griglia di aspirazione. I risultati dei conteggi dei microrganismi dell'aria devono essere consideraticon cautela e hanno valore puramente indicativo.

2_Analisi microbiologiche di superfici

Le superfici di ambienti e di attrezzi sono contaminate dacellule microbiche che provenendo dall'aria vi si depositano. Quando si tratta di pareti o di pavimenti, la contaminazione è, almeno inizialmente, casuale, anche se poi alcunimicrorganismi, muffe in particolare, possono trovare condizioni favorevoli per un limitato sviluppo. Nel caso di paretidi vasche di fermentazione, la contaminazione deriva dagliagenti stessi della fermentazione, soprattutto lieviti.Il grado di contaminazione delle superfici è direttamentedipendente dalla loro natura. Se queste sono di acciaioinossidabile, vetrificate o rivestite da intonaci o piastrellelavabili, la presenza di cellule microbiche è inferiore. Difatto, le cantine più moderne hanno tutte materialidi questa natura e fanno largo uso di soluzioni disinfettanti per lavare e sanitizzare le superfici esposte a contaminazione ambientale. Secondo il parere di molti enologi, il

Analisi microbiologica dei campioni

I filtri sulla cui parte esterna sono stati trattenuti i microrganismi sono messi sulla superficie di un terreno nutritivo idoneo o sono ricoperti con il terreno stesso (ed eventualmente messi in giare per anaerobiosi). I terreni nutritivi con i quali si esegue il conteggio devono essere scelti con cura, possono essere generici, ma più spesso sonofortemente selettivi e specifici. A volte infatti le analisimicrobiologiche dell'aria vengono eseguite allo scopo dideterminare l'entità di presenza di ben precisi gruppi ospecie microbiche. Nel caso di ambienti di cantina, imicrorganismi che maggiormente interessano sono lemuffe, i lieviti, i batteri in genere (conta totale), i batterilattici, gli acetici e gli enterobatteri. Nel caso dei lieviti, ladeterminazione può assumere particolare interesse perquegli ambienti nei quali si eseguono, anche in vendemmia, operazioni per cui l'inquinamento da lieviti puòessere dannoso.

Risultati attesi

I dati riguardanti i carichi microbici dell'aria negli ambienti di cantina sono molto scarsi ed è difficile fornire indicazioni precise: chi volesse individuare una soglia di pericoloper impostare procedure di lavaggio e di sanitizzazione,deve probabilmente costruirsi una taratura sulla sua realtàe con i suoi strumenti analitici.

grado di asepsi di un ambiente di cantina (prima delle fermentazioni) è molto superiore a quello di qualunque salaoperatoria prima degli interventi chirurgici. L'esperienzadimostra, invece, che il livello igienico ambientale può essere compromesso trascurando anche solo pochi particolari:un tubo di gomma, una pompa, un rubinetto in cui ristagnidel vino, anche diluito, per qualche giorno, può consentirelo sviluppo di miliardi di cellule microbiche che possonoalzare significativamente il livello di contaminazione di unamassa di vino inizialmente"pulita".Diverso poteva essere il caso delle antiche ed obsolete cantine aziendali che facevano largo uso di vasi vinari di legnoe le cui superfici, pareti e pavimenti, erano rivestite da •materiali non lavabili. Chi afferma che i lieviti agenti dellefermentazioni naturali (spontanee) dei mosti sono stabil- •mente presenti nell'ambiente di lavorazione, prende come •

73 Il Il

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punto di riferimento cantine di quest'ultimo tipo. Il fattoche spesso le analisi microbiologiche abbiano permessol'isolamento di lieviti, anche riferibili a Saccharomyces cerevisiae, ha indotto qualche studioso ad affermare che i lieviti dei mosti e dei vini si perpetuano nelle cantine e inoltreche quel lievito sia un organismo domestico, inconsciamente selezionato dall'uomo e non esistente in natura.Tutto questo a parte, è bene precisare che le analisi

3_11 sistema HACCP

l'acronimo HACCP, che letteralmente significa HazardAnalysis and Criticai Contrai Points, è una procedura cheprevede le analisi dei rischi produttivi, nonché gli interventi e i relativi controlli sui momenti critici dei processi produttivi e distributivi degli alimenti. l'argomento è regolamentato dal Decreto legislativo 26 maggio 1997, n. 155,relativo all'attuazione delle Direttive Europee 93/43 e 96/3CEE, concernenti !'igiene dei prodotti alimentari e pubblicato sul supplemento ordinario alla Gazzetta Ufficiale n.136 del 13 giugno 1997. la disposizione prevede una seriedi obblighi a carico di tutti gli operatori attivi nel settorealimentare, dalla preparazione fino alla vendita esomministrazione di alimenti al consumatore finale. Alla base vi èla consapevolezza che il controllo del prodotto finito non èsufficiente a garantire un adeguato livello di sicurezza esalubrità. I controlli e gli obblighi collegati si possono riassumere nell'attuazione dell'HACCP che prevede analisi deirischi produttivi, interventi e relativi controlli sui momenticritici dei processi produttivi e distributivi degli alimenti.I principi su cui si basa il sistema HACCP sono:1. identificazione ed analisi dei pericoli e dei rischi;2. individuazione dei punti critici di controllo (CriticaiControl Points, CCP);3. specificazione dei criteri di prevenzione, cioè dei limiticritici entro i quali deve svolgersi l'operazione atta adassicurare che un CCP sia sotto controllo;4. determinazione delle procedure per effettuare ilmonitoraggio dei punti critici di controllo tramite test oosservazioni programmate;5. specificazione eadozione delle azioni correttive da intraprendere quando i risultati del monitoraggio individuanoche un CCP non è più sotto controllo;

microbiologiche delle superfici presentano molte difficoltà e danno risultati di scarsa attendibilità, soprattuttoin fase di prelevamento dei campioni.Si usano tamponi sterili fatti con un batuffolo di cotone incima ad una bacchetta di plastica, contenuti in provettesterili. Si striscia il tampone sulla superficie (di area nota)da esaminare, poi le cellule raccolte vengono trasferitecon varie modalità in terreni colturali solidi o liquidi.

6. adozione di procedure per la verifica dell'operativitàdel sistema HACCP;7. predisposizione della documentazione sulle procedureadottate per tenere sotto controllo il processo produttivo.

Vantaggi dall'applicazione del sistema HACCP

., Èuna moderna metodologia operativa volta, tramite unapprofondito studio del processo produttivo di un alimento, all'individuazione delle fasi critiche per la sicurezza e lasalubrità del prodotto nei confronti del consumatore finale.., Attraverso la valutazione dei rischi intrinseci attribuibiliad un determinato prodotto o al processo che lo realizza,attraverso l'individuazione delle misure necessarie a controllarli, consente di prevenire, eliminare o ridurre ad unlivello accettabile, per il consumatore finale, i pericolipotenziali della produzione alimentare.., Èun metodo efficace e razionale per garantire la sicurezza degli alimenti.., Èun sistema preventivo di controllo dei prodotti alimentari che ne garantisce la sicurezza sanitaria.., Èun approccio documentato e verificabile per !'identificazione dei rischi, delle misure preventive e del controllo dei punti critici e per la realizzazione di un sistema dimonitoraggio.

l'HACCP ed il vinoI controlli e le analisi collegati con l'HACCP hanno grandissima importanza sotto l'aspetto igienico-sanitario,riguardano tutti i prodotti alimentari e quindi, in teoria,anche il vino. Resta il fatto che, nel vino, i microrganismipatogeni o tossigeni, tanto pericolosi per altri alimenti diorigine vegetale o animale, non hanno alcuna possibilitàdi sviluppo o di soprawivenza.

ApPROFONDIMENTO

> Shelf-IifeTutti i prodotti alimentari sono serbevoli per periodi di tempo limitati, anche se notevolmente differenti, per via difenomeni di decadimento dovuti a variazioni di composizione o di stato come conseguenza dell'azione di fattori fisici, chimici o biochimici e microbiologici.la Shelf-life esprime la "durabilità" di un prodotto dal punto di vista commerciale; si tratta di un concetto al quale noncorrisponde obbligatoriamente la reale possibilità di "vita", poiché alla perdita di alcune caratteristiche commerciali non

Il Il 74


necessariamente corrisponde la perdita delle caratteristiche merceologiche fondamentali o di quelle igieniche di sicurezza o di efficacia nutrizionale. La Shelf-Life di un prodotto deperibile è riferibile esclusivamente ad una determinata situazione ambientale. Non ha senso parlare in assoluto di Shelf-Life, senza specificare in quali circostanze è stata valutata omisurata equali fossero le condizioni di magazzinaggio, di trasporto edistribuzione, in quali climi, in quale stagione ecc.Non va sottovalutato inoltre il ruolo dell'imballaggio, che è sempre rilevante e molto spesso essenziale nel definire la"durabilità" commerciale di un prodotto confezionato.La Shelf-life di uno stesso alimento può essere differente per diversi produttori, perché dipende dalle condizioni di produzione edi conservazione, dall'imballaggio ecc. ..

4_la colimetria

Significato della colimetriaLa colimetria consiste nella determinazione della presenza di Escherichia coli con conteggio delle cellule. Com'èben noto, E. coli è un batterio tipicamente intestinale e, inquanto tale, tipicamente fecale. Di conseguenza:., qualunque materiale abbia subito inquinamento fecale,certamente contiene cellule di E. colt,., la presenza di E. coli è indice sicuro di inquinamentofecale.Escherichia coli non è un batterio tossigeno o patogeno(solo pochi ceppi chiamati rispettivamente ETEC ed EPEClo sono) e la sua ingestione da parte dell'uomo non haconseguenze di natura sanitaria. Esso è un tipico batterio"marker" la cui presenza è indice sicuro di un certo tipodi inquinamento, appunto quello fecale: da qui nascel'importanza della sua determinazione.

Applicazioni

La colimetria è un'analisi di importanza generale allaquale vengono sottoposti tutti i prodotti alimentari e cheviene eseguita tutte le volte che si vuole conoscere ilgrado di inquinamento fecale di qualunque materiale,solido o liquido. Quelle che vengono ora sommariamentedescritte sono alcune delle applicazioni più significative.

Il latte

Il latte, all'uscita dalla mammella, è privo di cellule microbiche (se l'animale è sano). Esso si inquina, e abbondantemente, durante e dopo la mungitura perché l'aria dellestalle è portatrice di un grande numero di cellule batteriche di origine fecale. La colimetria del latte viene eseguita con due differenti finalità.1. Per determinare le condizioni igieniche rispettatedurante e dopo la mungitura. In funzione delle norme

igieniche seguite dagli operatori, il numero di cellule diE. coli varia in misura notevole. Generalmente si considera che un conteggio inferiore a 5.000 cellule (ufc) per mLsia indice di latte di buona qualità; spesso questa sogliaviene ampiamente superata con possibilità di arrivare a30.000-50.000 cellule o anche più.2. Per determinare l'efficacia della pasteurizzazione, poichéin Italia tutto il latte destinato a consumo diretto o all'industria lattiero-casearia (salvo poche eccezioni) deve esserepasteurizzato, perché potrebbe provenire da animaliammalati portatori di Brucella abortus (brucellosi o "febbrimaltesi"), Mycobacterium tubercolosis (tubercolosi) oListeria monocytogenes (Iisteriosi), patogeni anche per l'uomo. La pasteurizzazione elimina le cellule di questi batteri ele cellule di E. coli certamente presenti: l'assenza del batterio marker garantisce sulla buona riuscita del trattamento.

la carne

Anche la carne al momento della macellazione è priva dicellule microbiche e può contaminarsi superficialmentedurante la sua lavorazione. In questo caso, la colimetriaserve per determinare le condizioni igieniche esistentinegli ambienti di lavoro, quali macelli e salumifici.

l'acqua

La colimetria è applicata a tutte le acque, con finalità differenti in funzione della loro origine e della destinazione.1. L'acqua potabile. L'acqua per alimentazione umana ecioè quella di acquedotto, di sorgente o di pozzo, dev'esse-re del tutto esente da inquinamento fecale. La colimetria èuna delle analisi fondamentali per stabilirne la potabilità edeve dare sempre risultato negativo (E. colf. assente).2. L'acqua dei torrenti edei fiumi. Nei corsi d'acqua vengono spesso riversati effluenti di varia natura, compresi quelli di allevamenti animali e di fognatura. Anche se depurati, _questi effluenti sono portatori di microrganismi di origine -

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fecale. La colimetria, eseguita a intervalli regolari dalla sorgente alla foce o su tratti stabiliti, serve per individuare ipunti nei quali vengono immessi effluenti di una certanatura e per identificare le fonti di inquinamento.3. Le acque di mare. Nelle acque di mare (ma anche inquelle di lago) la colimetria serve ancora una volta perstabilire se ci sia stato inquinamento fecale e di qualeentità. Èsulla base dei risultati della colimetria che vengono emessi i divieti di balneazione.

Prodotti orticoli

Èpossibile che i prodotti orticoli vengano irrigati con acquainquinata da batteri fecali o che il terreno su cui vegetanosia stato concimato con materiali di stalla. In questi casi, iprodotti sono portatori di batteri di origine fecale. La colimetria serve per determinare questa possibilità edeve darerisultato negativo.

Prodotti alimentari in genere

La possibilità di inquinamento fecale esiste per tutti i prodotti alimentari anche dopo la loro eventuale pasteurizzazione o sterilizzazione o dopo la cottura. Troppo spesso lacontaminazione è dovuta a scarsa osservanza di norme diigiene elementare da parte degli operatori. Èper questomotivo che la colimetria è una delle analisi microbiologiche fondamentali e viene eseguita su tutti gli alimenti intutte le fasi della loro lavorazione ed elaborazione.

Prodotti enologici

I mosti ed i vini, per loro caratteristiche intrinseche, soprattutto il basso valore di pH e l'impiego di anidride solforosa, non consentono né lo sviluppo né la soprawivenza dibatteri patogeni o tossigeni. La colimetria dei vini non èeseguita perché priva di significato (dà sempre risultatinegativi). Questo, tuttavia, non significa che tutto il materiale enologico sia esente da possibilità di inquinamentofecale che può, invece, riguardare i casi seguenti.1. L'uva in campo. Èpossibile che i vigneti siano concimati con materiali solidi o liquidi provenienti da stalle. In questi casi l'uva può subire una contaminazione da batteri diorigine fecale.2. L'acqua. Le cantine fanno un larghissimo uso di acquaper il lavaggio e la disinfezione delle vasche, degli attrezzie degli ambienti. Spesso tale acqua viene prelevata dapozzi e non dalla rete pubblica. Dipendentemente dallasua origine, l'acqua può avere subito inquinamento fecale.3. I pavimenti. I pavimenti e le scale sono destinati al calpestamento ed è possibile che le suole delle scarpe sianofonte di inquinamento fecale.4. Il mosto concentrato rettificato (MCR). A differenza deimosti e dei vini, l'MCR ha un valore di pH non proibitivo

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e consente la soprawivenza di E. co/i e anche lo sviluppodi diverse specie batteriche. Ètuttavia poco probabile chepossa subire una contaminazione fecale.5. I lieviti secchi e gli altri coadiuvanti e preparati per usoenologico.

I metodi

Per la colimetria vengono usati terreni solidi (per i conteggi) o mezzi liquidi (per la determinazione della presenza)specifici, i quali contengono:., lattosio come fonte di carbonio; illattosio è fermentatoda E co/i ed altri enterobatteri e lo è anche da parte dipochi altri batteri;., un indicatore di acidità che vira per effetto della formazione di acidi (E. coli forma acido lattico e provoca ilviraggio dell'indicatore);., un inibitore dello sviluppo microbico (generalmente salidi bile) attivo sui batteri Gram-positivi e non su E. coli.I terreni nutritivi per i conteggi sono quelli noti con i nomidi "Violet Red Bile Agar" e "Brilliant Green Bile Agar", ilcui uso è elementare. I conteggi vengono eseguiti con iprocedimenti generali già in precedenza descritti. Il campione da esaminare o le sue diluizioni vengono inoculatiper inclusione o seminati superficialmente nel terreno e lepiastre sono incubate in termostato a 37°C. Dopo 24 ore,le colonie di E. coli sono già ben sviluppate e riconoscibili perché circondate da un alone colorato diversamentedal terreno a causa del viraggio dell'indicatore.Non altrettanto semplice e rapida è la determinazionedelle presenza di E coli: quando nel campione sono presenti poche cellule per litro, non determinabili con conteggio diretto. Si può usare il metodo della filtrazione, ma piùspesso viene seguito quello dell'arricchimento, impiegando gli stessi substrati già citati, ma allo stato liquido(senza agar). Il procedimento da seguire prevede:., la preparazione del mezzo liquido specifico a concentrazione doppia, immesso in matracci di adeguata capacità, involumi di 50, 100, 250 o 500 mL; segue la sterilizzazione;., il completamento del mezzo con l'aggiunta del campione da esaminare in uguale volume;., l'incubazione a 37°C.Dopo 24 ore di incubazione, si osserva se l'indicatore diacidità ha virato; in caso negativo si lascia il termostatoper altre 24 ore e si ripete l'osservazione. Se l'indicatore èrimasto inalterato si può affermare che in 50, 100, 250 o500 mL del campione esaminato non erano presenti cellule di E. coli. In caso di viraggio dell'indicatore, è necessario trovare conferma della positività del campione con •una semina in piastra del mezzo di arricchimento sullostesso terreno specifico e procedere al riconoscimentodelle colonie di Eco/i.

Parte Terza Applicativa

c.Analisi di microbiologia enologica

01_Caratterizzazione ed identificazionedei lieviti1.1_Generalità1.2-,dentificazione delle specie

più importanti

02_Caratterizzazione delle colture2.1_Caratteristiche enologiche

03_Analisi microbiologica dell'uva3.1_' microrganismi dell'uva3.2_la contaminazione casuale3.3_Analisi dell'uva sana3.4_Analisi di singoli acini3.5_Analisi di grappoli3.6_Analisi della carposfera3.7_Analisi dell'uva danneggiata

04_Analisi microbiologiche dei mostie delle fecce4.1_Controllo del mosto4.2_Controllo del mosto non ancora

in fermentazione

ApplicazioniCMetodi microscopiciZ_ Conta su piastra3_Ricerca di lieviti e batteri acetici4_Ricerca di batteri lattici

4.3_Determinazione della caricabatterica totale e dei mosti

4.4_Analisi microbiologichedelle fecce

05_Analisi microbiologiche del vinoin bottiglia5.1_" metodo standard5.2_Vino filtrato o pasteurizzato

in bottiglia

06_Le analisi microbiologichedei coadiuvanti enologici6.1_Analisi microbiologiche del

lievito disidratato (lSA)6.2_Analisi microbiologica del Mosto

Concentrato Rettificato (MCR)

Approfondimento 1 - Espressione deirisultati dei conteggi di microrganismiApprofondimento 2 - Incertezzadi misura

o1 Caratterizzazioneed identificazione dei lieviti

1.1 Generalità

<DNA

<ribosomi-subunità 165

La più recente classificazione di Kurtzman e Fell (1998) definisce i lieviti"Funghi la cui riproduzione vegetativa avviene in modo predominante pergemmazione o per scissione, e le cui spore sessuali non sono contenute(o sopra-posizionate) in corpi fruttiferi".Nonostante questa definizione non sia stata fondamentalmente modificatarispetto alle classificazioni precedenti, il criterio con cui le specie sono stateraggruppate in generi ed in livelli superiori di suddivisione, è mutato inmodo sostanziale. Come già era avvenuto per i batteri, la classificazione nonsi basa più su caratteri fisiologici, come la capacità o meno di assimilare o fermentare composti del carbonio ed altri composti organici e inorganici, masulla composizione del corredo genetico delle diverse specie. Purtroppo nonè stata trovata una regione unica di DNA in grado di discriminare tutte lespecie di lieviti, mentre per i batteri la determinazione della sequenza diDNA che codifica la subunità 165 dei ribosomi viene universalmenteaccettata per la classificazione filogenetica. Per quanto riguarda i lieviti, laclassificazione ufficiale riconosce che "al presente sono ancora insufficienti leanalisi molecolari per circoscrivere adeguatamente molti generi", soprattuttoquelli di minore diffusione (Kurtzman, Discussion o[teleomorphie and anamorphie ascomycetous yeasts and a key to the genera. In "The Yeast - A taxonomic study". 111-121). La più importante novità dell'ultima classificazionetassonomica è la scomparsa del phylum dei Deuteromiceti, dove venivanocollocate tutte le specie di cui non si conosceva la riproduzione sessuale.Poiché la nuova classificazione si basa sulla composizione di particolarisequenze di DNA, per molte specie che non producono spore sessuali, èstato possibile individuare quelle che presentano maggiori omologie a livello di sequenza, fra quelle di cui invece si conosce la riproduzione sessuale.

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• Parte Terza Applicativa I I I •

Divisione

Ascomiceti

Basidiomiceti

Generi di maggioreinteresse enologico

[Tabella 4]Classificazione dei lieviti secondo Kurtzman e Fell (1998). Igeneri di maggiore interesseenologico sono segnati da 1, 2 o3 asterischi, in funzione dellaloro importanza.

Metschnikowia *Schizosaccharomyces * *Hanseniaspora * *Saccharomycodes *Pichia**Dekkera**Saccharomyces * * *Torulaspora *

\ Zygosaccharomyces *

Urettanomyces * *

Candida**Kloeckera * *

~essun lievito riferibile

ai basidiomiceti harilevante interesseenologico

ex Deuteromiceti

I soli due phyla che comprendono tutte le specie di lieviti sono ora gli ascomiceti e i basidiomiceti, e alloro interno sono descritte le spe-cie teleomorfe, quelle di cui si conosce lariproduzione sessuale, e le specie anamorfe,che non producono spore sessuali e di cui nonsi conosce il ciclo completo. Dal genereCandida, che conteneva tutte le specie di deuteromiceti di incerta attribuzione (circa 400),sono state eliminate tutte le specie anamorfe dibasidiomiceti, e quindi esso è stato spostatonegli ascomiceti dove costituisce la famigliaCandidaceae. Nonostante questa "ripulitura",il genere Candida rimane comunque un genere dai confini vaghi, e tutti i lieviti (161 specie)di cui non si conosce la riproduzione sessualevi sono stati mantenuti.La famiglia degli ascomiceti contiene 41 generi teleomorfi e 15 anamorfi, quella dei basidio-miceti contiene 17 generi teleomorfi e 21 ana-morfi. Complessivamente, il gruppo dei lieviti è formato da 94 generi e pocomeno di 700 specie. [identificazione dei lieviti enologici fino a livello digenere non è difficile anche basandosi esclusivamente su caratteristiche difacile determinazione quali la forma e le dimensioni delle cellule, la modalitàdi sporificazione (se presente) e la forma delle spore. [identificazione dellespecie presenta invece notevoli difficoltà, tanto che per la composizione dialcuni generi esistono ancora molte incertezze. Fino alla classificazione del1984 di Kreger-van Rji, l'identificazione delle specie si basava su caratteristiche morfologiche e fisiologiche e, in particolare, sulla capacità o incapacità diutilizzare alcuni idrati di carbonio. Poi, la caratterizzazione su basi molecolariha introdotto nuovi criteri che hanno modificato la situazione preesistente.[identificazione dei lieviti fino a livello di specie richiede attrezzature particolari che di norma sono presenti in laboratori e istituti che si dedicano prevalentemente all'attività di ricerca. Tuttavia, i lieviti di maggiore importanzasotto 1'aspetto enologico sono pochi e hanno caratteristiche tali da poter essere riconosciuti anche con i mezzi limitati di un laboratorio di microbiologiaenologica.

SI TRATTA, IN PARTICOLARE, DELLE SPECIE SEGUENTI:

.., Saccharomyces cerevisiae ed altre dello stesso genere, i cosiddetti Saccharomyces sensu stricto;

.., Kloeckera apiculata ed altri lieviti con cellule tipicamente apiculate;

.., Schizosaccharomyces pombe ed altre dello stesso genere;

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.., Saccharomycodes ludwigii, unica specie del genere;

.., Metschnikowia pulcherrima;

.., Pichia membranifaciens ed altri lieviti della fioretta;

.., Dekkera bruxellensis, Brettanomyces bruxellensis ed altre specie degli stessi generi;

.., Torulaspora delbrueckit,

.., Zygosaccharomyces bai/ii ed altre dello stesso genere.

Per arrivare ad un'identificazione con buone probabilità di successo sononecessarie una notevole dimestichezza con il microscopio ed un'esperienzaprecedente con ceppi di collezione: alcuni lieviti, visti una volta, si riconoscono immediatamente.

1.2_ldentificazione delle specie più importanti

Riconoscimento di Saccharomyces cerevisiae

Va preliminarmente detto che S. cerevisiae è il lievito più vigoroso e alcoltollerante; in molti prodotti enologici le probabilità di una sua presenza,anche esclusiva, sono molto alte. Questo facilita e rende più probante illavoro di identificazione che, comunque, va eseguito sulla base dei seguenticaratteri.

0"ellule di Saccharomyces cerevisiae

Le cellule di Saccharomyces cerevisiae, sviluppate in striscio o in mosto o in altro mezzo, hanno forma sfericaoppure ellittica o, talvolta, leggermente allungata. Le gemme si possono formare in qualunque posizione dellacellula perché la gemmazione è multipolare.

<colture sporificate

<aschi

Lesame microscopico delle colture sporificate è necessario. La sporificazione può essere indotta con trasferimento abbondante di una coltura giovane(24-48 ore) da striscio in YPD in striscio di agar all'acetato. Su questo terreno, molto povero, la coltura forma gli aschi, ossia le spore sessuali che vengono prodotte con la meiosi (ascospore); esse restano contenute all'internodella cellula che le ha generate, la quale non si dissolve ma diventa appuntol'asco. Gli aschi si formano direttamente dalle cellule di cui conservano laforma; essi contengono, ben visibili, da 1 a 4 spore di forma sferica o leggermente ellittica con parete liscia. Gli aschi sono stabili e non liberano lespore. Nella specie, ci sono ceppi che sporificano con difficoltà: in questicasi è bene eseguire pazientemente un esame microscopico molto accuratoe, se è il caso, ripetere l'operazione. In caso di mancata sporificazione (alcuni ceppi non sporificano), l'identificazione con S. cerevisiae non può essereesclusa (se l'attività fermentativa è intensa), ma rimane incerta.S. cerevisiae è lievito dotato di forte attività fermentativa; la determinazione della capacità di fermentare vigorosamente gli zuccheri è necessaria.S. cerevisiae è molto simile alla specie S. paradoxus con la quale, sulla basedelle determinazioni prima descritte, può essere confuso. È molto simileanche a S. bayanus (= s. uvarum) che può essere identificato sulla base

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della capacità di quest'ultimo di fermentare ancora bene a temperature difrigorifero.Per quanto riguarda il riconoscimento delle colonie cresciute su terreni di coltura solidi, Saccharomyces cerevisiae cresce bene su WL Nutrient Agar in 4giorni a 25 DC, originando colonie circolari dal diametro anche notevole ecolore variabile dal crema al verde (Foto Appendice 19a). Le diverse gradazioni cromatiche possono sl indicare la presenza di ceppi diversi, ma anche unpotenziale polimorfismo o la presenza di mutanti "petites" incapaci di respirare; la colonia ha elevazione tipicamente umbonata, superficie liscia opaca econsistenza cremosa. Non cresce su Agar Lisina (Foto Appendice 35b).

Riconoscimento dei Saccharomyces freddo-fermentanti

Il genere Saccharomyces, oltre alle specie cerevisiae e paradoxus, ne comprende anche altre, la cui posizione tassonomica è dubbia e in corso di revisione; si tratta di quei lieviti a suo tempo denominati S. bayanus, S. uvarum,S. carlsbergensis e S. pastorianus che hanno in comune la capacità di fermentare bene a basse temperature (6 DC) e che per questo motivo sono chiamatifreddo-fermentanti o criotolleranti.Sono i tipici lieviti delle birre "Lager" che intervengono anche nella fermentazione dei mosti d'uva, in particolare dei mosti frigoconservati.I Saccharomyces freddo-fermentanti sono morfologicamente molto simili aS. cerevisiae: possono essere riconosciuti per la loro incapacità di sviluppo a37 DC oppure mediante la determinazione della temperatura ottimale(da 26 a 28 DC rispetto ai 31-33 DC di S. cerevisiae). Essi possono essere reperiti e isolati mediante arricchimento, facendo ricorso alla bassa temperaturacome fattore di selezione.

Riconoscimento dei lieviti apiculatiKloeckera a iculata ed altre s ecie

I lieviti apiculati sono facilmente riconoscibili sulla base del semplice esame. .

mIcroscopICO.

<birre "Lager"

~ellule di Kloeckera apiculata

Le cellule di Kloeckera apiculata, originariamente ellittiche, si moltiplicano con formazione di gemme alternativa·mente in corrispondenza delle estremità. Dopo il distacco delle cellule figlie, rimangono degli anelli cicatriziali checonferiscono agli apici il tipico aspetto appuntito.

Questi lieviti sono dotati di capacità fermentativa ma, essendo poco alcoltolleranti e molto sensibili all'anidride solforosa, sono rilevabili solo nelle primefasi delle fermentazioni spontanee dei mosti e a bassa concentrazione di S02'

Note: . .__.__.__..__._ _ _ _ _ _._. __._ _ _ _ _ _.__._ _..

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I lieviti apiculati sono considerati poco idonei per fini enologici (anche perché formano alte quantità di acido acetico) e il loro intervento nella fermentazione dei mosti è ostacolato dall'uso di S02 e di colture selezionatedi S. cerevisiae. Di conseguenza, la loro esatta identificazione a livello dispecie può avere interesse dal punto di vista della ricerca, ma non dal puntodi vista tecnologico.I tipici lieviti apiculati appartengono al genere sporigeno Hanseniaspora nelquale sono confluite le specie prima comprese nel genere Kloeckera (asporigeno). La specie più frequente nei mosti è asporigena ed è ben nota con ilnome di Kloeckera apiculata. Nei mosti delle zone a clima temperato caldo(Italia meridionale) è spesso presente anche Hanseniaspora guilliermondii.I lieviti apiculati crescono su WL Nutrient Agar in 4 giorni a 25 cC, con colonie di colore verde intenso con profilo tipicamente piatto, superficie lisciaopaca e consistenza burrosa. Crescono su Agar Lisina e su WL differenziale.Alcune specie non crescono a 30 cc.

Riconoscimento di Saccharomycodes ludwigii

Il genere Saccharomycodes comprende la sola specie Saccharomycodes ludwigiiche, per le caratteristiche morfologiche delle sue cellule e dei suoi aschi, èimmediatamente riconoscibile con l'esame microscopico.

~ellule di Saccharomycodes ludwigii

Le cellule sono molto grandi e apiculate: la loro moltiplicazione avviene per formazione di gemme inizialmentesferiche alle estremità, che hanno base di inserzione particolarmente larga. Questo conferisce alle cellule un·aspetto simile a birilli da bowling.

Il genere Saccharomycodes è sporigeno e forma aschi contenenti 4 spore abbinate 2 a 2 ed è dotato di attività fermentativa. È normalmente presente sulleuve e nei mosti limitatamente alle prime fasi di fermentazione. È considerato molto resistente alla S02 e può provocare fermentazione dei mosti mutizzati con anidride solforosa. Le colonie di Saccharomycodes ludwigii non sonodifferenziabili da quelle di altri lieviti su terreni specifici o differenziali, mal'aspetto delle cellule, osservate al microscopio, è talmente caratteristico chesolitamente è sufficiente per l'identificazione.

Riconoscimento di Metschnikowia pulcherrima

Metschnikowia pulcherrima ha come specie non sporigena corrispondenteCandida pulcherrima. Si tratta di un lievito con cellule le cui caratteristiche morfologiche sono tali da rendere immediatamente riconoscibili le suecolture sviluppate su terreni solidi.

~ellule di Metschnikowia pulcherrima

Le colture risultano infatti costituite da una mescolanza di cellule di due tipi: le une, più numerose, sono di piccoledimensioni ed ellittiche, le altre sono molto grandi, sferiche e hanno ben visibile al centro una voluminosa goccia diolio. Sono queste ultime a giustificare il nome di "pulcherrima" dato alla specie.

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Aellule di Schizosaccharomyces pombe

Le loro cellule hanno forma cilindrica e, se in moltiplicazione, sono divise al centro da un setto ben visibile. Questilieviti sono inconfondibili e possono essere identificati, almeno a livello di genere, con il solo esame microscopicodelle cellule.

M. pulcherrima, lievito molto comune sulle uve e nei mosti prima dell'inizio della fermentazione, non è più rilevabile quando la fermentazione è inatto e nelle fasi successive. È pressoché privo di attività fermentativa.Ha colonie di colore bianco crema e forma un pigmento rosso (noto colnome di "pulcherrimina") che colora il terreno sottostante le colonie, nellescatole Petri, e gli strisci di mantenimento.

Riconoscimento di Schizosaccharomyces pombe

I lieviti del genere Schizosaccharomyces sono i soli che si moltiplicano per. . .

SCISSIOne e non per gemmazIOne.

Sono inoltre sporigeni, gli aschi sono spesso presenti nelle colture di mantenimento e hanno una forma tipica a manubrio. Benché la loro moltiplicazione sia più lenta rispetto al S. cerevisiae, sono dotati di intensa attivitàfermentativa.Il genere comprende poche specie, la più importante, dal punto di vistaenologico, è Schizosaccharomyces pombe i cui aschi contengono 4 spore. Lapresenza di questo lievito nei mosti e nei vini è stata più volte segnalata e,in alcuni particolari prodotti quali i filtrati dolci, talvolta è dominante. Ilsuo sviluppo provoca inattese modificazioni compositive legate alla capacità di dare intensa fermentazione malo-alcolica. Proprio per questa capacità, è stato sperimentato e proposto il suo impiego per la disacidificazionebiologica dei vini.Un'altra specie talvolta rinvenuta negli stessi prodotti è Schizosaccharomycesjaponicus. Questo lievito ha cellule più grandi rispetto al precedente, formaaschi contenenti 8 spore, ha intensa attività fermentativa e sviluppa condifficoltà in aerobiosi.

Riconoscimento di Pichia membranifaciens

Secondo la classificazione vigente, il nome di Pichia membranaefaciens èstato sostituito con Pichia membranifàciens, perché secondo Kurtzman eFell, sarebbe più corretto secondo la lingua latina (sic).P. membranifàciens è il tipico agente della fioretta dei vini; in passato eranoto con i nomi di Mycoderma vini e Candida mycoderma oggi desueti. Sitratta di un lievito privo di attività fermentativa che, nei vini ed altri mezzi

<pulcherrimina

<Schizosaccharomyces

pombe

<Schizosaccharomyces

japonicus

<fioretta dei vini

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liquidi, sviluppa superficialmente (a contatto con l'aria) formando spessiveli e ossidando l'etanolo con formazione di acqua e CO2. È uno deinemici del vino.

Cellule di Pichia membranifaciens

P. membranifaciens ha cellule di diversa forma e di diverse dimensioni. Possono essere ellittiche con gemmemultipolari ma anche, e sono le più tipiche, molto allungate e pseudomiceliari.

Si tratta di lievito sporigeno ma composto da ceppi che spesso sono privi diquesta capacità. Le spore, se presenti, si trovano negli aschi in numero diquattro e hanno forma a cappello: sono sferiche e sono munite di un anelloeccentrico. La precisa identificazione di P. membranifaciens sulla base deicaratteri prima elencati non è possibile anche se l'origine del ceppo in esameè fioretta. Di fatto, il carattere più importante che denuncia il tipo di lievitoè l'assenza di attività fermentativa, peraltro comune a diverse altre specie, lacui presenza viene rilevata quando si eseguono isolamenti da mosti e da vini.Pichia membranifaciens cresce bene su WL Nutrient Agar in 5 giorni, lecolonie assumono una colorazione crema-grigia con sfumature azzurre,l'elevazione è convessa, la sua superficie è rugosa e la consistenza farinosa.Cresce su Agar Lisina.

Riconoscimento di Torulaspora delbrueckiie Z osaccharom ces s

<

lieviti ellittici

<alcol-tolleranza

Torulaspora delbrueckii e le specie del genere Zygosaccharomyces sono lieviti cheper la loro morfologia cellulare rientrano nel gruppo dei cosiddetti ellittici(insieme con Saccharomyces cerevisiae). Essi infatti sono dotati di buonaalcol-tolleranza e possono intervenire durante la fase centrale di fermentazione dei mosti anche se in maniera marginale rispetto a S. cerevisiae.

~ellule di Torulaspora delbrueckii e Zygosaccharomyces spp.

Le loro cellule sono da sferiche ad ellittiche, sono multigemmanti e molto simili a quelle di S. cerevisiae. La loroidentificazione è possibile soltanto con il rilevamento delle modalità di sporificazione (che spesso avviene anchenei normali mezzi d'isolamento e di mantenimento).

<rifermentazione

In T. delbrueckii le cellule non si trasformano direttamente in aschi e la sporificazione è preceduta da coniugazione di una cellula madre con la propriagemma. Di conseguenza, gli aschi, contenenti da 2 a 4 spore, sono collegaticon una sorta di appendice (il residuo della gemma).Nelle specie del genere Zygosaccharomyces, invece, la sporifìcazione è preceduta da coniugazione di due cellule, collegate da un sottile canale. Lo zigote sitrasforma direttamente in asco (da qui deriva il nome del genere) e conservala forma assunta durante la coniugazione. Generalmente gli aschi contengono 4 spore, suddivise a 2 a 2 nelle pareti delle cellule da cui derivano.Quando si osserva una leggera ed indesiderata rifermentazione in bottigliadi vini leggermente dolci, che contengono cioè pochi grammi di zucchero

Il Il 84


per litro, spesso la causa è la crescita di lieviti del genere Zygosaccharomyces.Questi formano dei piccoli grumi, di 1-2 mm di diametro circa, di colorebruno carico (nei vini bianchi). All'osservazione microscopica le celluleappaiono riunite in aggregati di qualche centinaio.Torulaspora delbrueckii, su WL Nutrient Agar, in 5 giorni dà origine acolonie non distinguibili da S. cerevisiae, di colore crema che possonomanifestare sfumature verdi al centro più o meno intense; hanno elevazione umbonata, superficie liscia opaca e consistenza cremosa. Cresce su AgarLisina, ma non su WL differenziale.Zygosaccharomyces bai/ii cresce bene in 5 giorni su WL Nutrient Agar, lecolonie hanno diametro leggermente più ridotto, colore crema, elevazione acupola, superficie liscia e consistenza cremosa. Cresce su Agar Lisina e nonsu WL differenziale.

Riconoscimento dei lieviti dei generiDekkera e Brettanomyces

Questi due generi comprendono le stesse specie: Brettanomyces le formeasporigene, Dekkera le corrispondenti forme sporigene. Si tratta di lieviti lacui presenza marginale è stata osservata occasionalmente nel corso della fermentazione dei mosti. L'importanza loro attribuita nella produzione dellebevande alcoliche non è univoca; essi sono considerati importanti nel conferimento della qualità tipica di alcune birre inglesi (da cui il nome delgenere), mentre vengono considerati agenti di alterazioni olfattive che simanifestano nel corso della conservazione dei vini in barrique.I lieviti di questi generi, in particolare quelli asporigeni del genereBrettanomyces, possono essere facilmente riconosciuti sulla base del semplice

. .esame mlCroscoplCO.

<birre inglesi

Aellule di Dekkera e Brettanomyces

Per la forma delle loro cellule e per la modalità di moltiplicazione questi generi rientrano nel gruppo genericodegli ellittici, anche se, in coltura pura, un certo numero di cellule (non tutte!) assumono una caratteristica edesclusiva morfologia ogivale. Soltanto quelli riferibili al genere Dekkera possono essere riconosciuti per la formaa cappello delle spore presenti negli aschi in numero di 4.

Per la determinazione della loro presenza nei mosti e nei vini è necessarioricorrere a metodi che ne favoriscono la crescita rispetto agli altri piùcomuni ellittici, S. cerevisiae in particolare: tra questi metodi ricordiamol'arricchimento o l'uso di terreni selettivi contenenti cicloesimide.Dekkera bruxellensis cresce lentamente su WL Nutrient Agar: sono necessari almeno 8 giorni prima di osservarne lo sviluppo. Le colonie, di diametro ridotto, hanno colore crema ed elevazione a cupola, superficie liscia

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<acido acetico

<acetato di etile

<succo d'uva

<colture non riconoscibili

e consistenza cremosa; producono quantità particolarmente elevate diacido acetico, che risulta avvertibile anche all'olfatto, aprendo leggermente le scatole Petri, e provoca ingiallimento del terreno di coltura circostante (se WL Nutrient Agar). Non cresce su Agar Lisina, ma cresce su WL differenziale. Di grande importanza risulta il controllo su WL differenziale perl'identificazione di lieviti Dekkera spp. altrimenti non distinguibili daZygosaccharomyces bailii. Una conferma si deve comunque cercare con l'osservazione microscopica: anche in Dekkera le cellule sono piccole, spessocon tipica morfologia ogivale.

Riconoscimento di Pichia anomala

Pichia anomala (ex Hansenula anomala) è un lievito piuttosto resistente all'anidride solforosa, che può crescere nei mosti e nei vini: in entrambi producequantità particolarmente elevate di acetato di etile. Una sua presenza in quantità rilevante può causare la comparsa di un odore di acetone/solvente neimosti prima dell'avvio della fermentazione alcolica.Pichia anomala cresce bene su WL Nutrient Agar; dopo 5 giorni le colonie hanno colore crema o azzurro-grigio, ma assumono una colorazionedecisamente azzurra dopo 8. Lelevazione è piatta, la superficie liscia e laconsistenza cremosa, talvolta mucosa. Cresce su Agar Lisina.

Riconoscimento di altri lieviti

Durante le molteplici fasi della vinificazione, oltre ai lieviti già descritti ericonoscibili con l'ausilio di terreni selettivi, possono essere presentinumerose altre specie di lieviti oltre a quelle fin qui prese in esame. Alriguardo, basti considerare che nel succo d'uva possono moltiplicarsiquasi tutti i lieviti conosciuti e che le numerose ricerche eseguite in passato sull'argomento hanno effettivamente portato al reperimento di alcunecentinaia di specie. Va inoltre detto che quando si eseguono alcune analisi microbiologiche, in particolare quando si usa il metodo della filtrazione, può capitare di osservare lo sviluppo (forse per inquinamento) di unao di pochissime colonie, della cui presenza è difficile dare una correttainterpretazione.Lesatta e sicura identificazione dei lieviti è lavoro che può essere svolto dalaboratori di microbiologia che si dedicano all'attività di ricerca e, tuttavia,anche questi producono spessso risultati incerti; certamente questo lavoronon può essere affidato a un laboratorio di microbiologia enologica che siprefigge di ottenere dati che riguardano in modo diretto e, spesso, immediato l'attività produttiva. Infatti quando gli addetti di un laboratorio dimicrobiologia enologica si trovano di fronte a colonie o a colture non riconoscibili (almeno approssimativamente) a vista, possono comunque isolare emantenere le colture stesse registrando tutti i dati rilevati (tipo di colonia,morfologia cellulare, presenza di aschi), riservandosi poi di proseguire lo studio in proprio o affidandolo ad altri.

Il Il 86

02 Caratterizzazione delle colture

2.l_Caratteristiche enologiche

La determinazione di alcune caratteristiche enologiche può avere interesse alfine di prevedere il comportamento dei lieviti in fase di applicazione. Questacaratterizzazione interessa non soltanto Saccharomyces cerevisiae ma anchealtr'e specie. In questa sede vengono descritti metodi semplici e rapidi ai finidella determinazione dei caratteri più importanti sotto l'aspetto enologico.

Determinazione della capacità fermentativa

In molti casi, ciò che interessa sapere di una o più colonie sviluppate in piastre d'isolamento o di colture non identificate, è se sono o meno in grado difermentare. È il caso che si presenta tipicamente quando si trovano coloniedi lieviti al controllo microbiologico di vini imbottigliati con un residuo zuccherino, e si vuole valutare se questi lieviti possono dare rifermentazione omeno. Il carboidrato che s'impiega in questo caso è sempre e solo il glucosioperché questo esoso, così come il fruttosio e il mannosio, è fermentato datutti i lieviti dotati di capacità fermentativa.

<rifermentazione

Il PROCEDIMENTO È Il SEGUENTE:

1. preparare provette con 10 ml di mosto d'uva (meglio), oppure di altro mezzo liquido quale l'YPD o il Sabouraudcon glucosio;2. mettere nel mezzo già in provetta un tubo di Durham ribaltato (con la bocca in basso), cioè una piccola provettadi vetro sottile. Non preoccuparsi se vi rimane una bolla d'aria;3. chiudere le provette con tappo per microbiologia e sterilizzare. Durante la sterilizzazione, il tubo di Durham sisvuota dell'aria, si riempie del mezzo nutritivo e scende sul fondo della provetta;

87 Il Il

_______ 1 102

4. inoculare il mezzo nutritivo con cellule del ceppo in esame (una punta di filo), tratte da colonia o da striscio;5. incubare in termostato a 25°C.

Dopo 2 GIORNI LE COLTURE VENGONO ESAMINATE CON I SEGUENTI POSSIBILI RISULTATI:

.., il tubo di Durham, riempito di anidride carbonica da fermentazione, galleggia sulla superficie del mezzo: la coltu·ra è dotata di attività fermentativa;.., il tubo di Durham rimane sul fondo ancora pieno del mezzo nutritivo che può essere torbido o presentare celluledepositate sul fondo. La coltura è priva di attività fermentativa;.., la coltura tende a sviluppare in superficie come velo o anello e non forma gas: la coltura inoltre è priva di attivitàfermentativa.

<tubo di Durham

<metodo Castelli

<valvola di MOller

<alcol-tolleranza,vigore fermentativo

In caso di risultato positivo, si può valutare in modo approssimato anche l'intensità del carattere: alcuni lieviti sono dotati di debole attività fermentativaed il tubo di Durham si riempie parzialmente e lentamente di CO2.

Se di una coltura si vuole conoscere la capacità di fermentare altri zuccheri,il glucosio viene sostituito con quelli che interessano. Ciò vale, in particolare, per il saccarosio quando questo può essere impiegato legalmente (comeper la spumantizzazione).

Determinazione dei caratteri di competitività

I caratteri di competitività (vigore fermentativo, resistenza all'anidride solforosa, alcol-tolleranza) sono determinabili con il metodo a suo tempomesso a punto da Castelli. li metodo consiste nel determinare l'andamentodella fermentazione in mosto d'uva sulla base del calo in peso per svolgimento di anidride carbonica. Esso prevede l'uso di 100-1000 mL di mosto d'uvasterilizzato in matracci o bottiglie, la cui bocca viene chiusa con tappo digomma munito di una valvola di Miiller ad acido solforico. Il riempimento dei recipienti avviene preferenzialmente per via gravimetrica, in quanto,una volta determinato il tenore zuccherino del mosto, si può calcolare ilpeso di 100 (o 1000) mL di mosto in un matraccio tarato, e successivamente riempire in modo veloce un numero anche elevato di recipienti nonnecessariamente tarati (ad esempio normali bottiglie), ponendoli su unabilancia tecnica che arrivi al centesimo di grammo e aggiungendo il pesodesiderato di mosto. Con una pipetta "Pasteur" è possibile dosare goccia agoccia quantità di mosto di circa 0.01 g, pari a circa 0.00001 mL, cosa assaipiù difficile da farsi con una pipetta, anche molto precisa.Quando, dopo l'inoculazione, comincia la fermentazione alcolica, la valvolaad acido solforico cattura l'umidità e lascia passare solo l'anidride carbonica: ilvalore del calo in peso non è quindi viziato da perdite dovute all'evaporazioneo ad altra natura.Il metodo proposto da Castelli è molto preciso, ma è piuttosto laborioso:richiede una lunga fase preparativa e deve essere impiegato obbligatoriamente nel caso dell'alcol-tolleranza. Per quel che riguarda il vigore fermentativo e la resistenza alla 502' risultati sufficientemente probanti possono essereottenuti omettendo l'uso delle valvole ad acido solforico (valvola di Muller)

Il Il 88

• Parte Terza Applicativa I I I I

e limitando le perdite di umidità con uno strato di olio di paraffina.In questo caso, però, è difficile eliminare la paraffina che può contaminareeventuali campioni prelevati per analisi, dalla superficie.Il procedimento semplificato prevede le seguenti operazioni:• preparazione di matracci conici contenenti almeno 100 mL di mosto dicomposizione nota, ricoperto da uno strato di 1 cm di olio di paraffina;• chiusura dei matracci con tappo di cotone e sterilizzazione;• aggiunta di 1 mL di soluzione acquosa di anidride solforosa se il carattereche interessa è la resistenza verso il composto;• inoculazione delle colture, sostituzione del tappo di cotone con valvola diMaller e pesata di tutto il sistema su bilancia tecnica e incubazione a 25 DC;• determinazioni del calo in peso con bilancia tecnica ogni 24 ore fino apeso costante.Si ottengono così dei valori di anidride carbonica prodotta nel tempo,direttamente proporzionali all'andamento della fermentazione, che permettono di tracciare curve su di un sistema di assi ortogonali cartesiani. I risultati sono probanti ed assumono un preciso significato a condizioni precise.Il vigore fermentativo e la resistenza alla S02 sono caratteri che rientrano nelgruppo delle "prestazioni" e assumono significato soltanto con confronto fraceppi diversi, di cui almeno uno con comportamento noto (ceppo di controllo). La presenza di un ceppo di riferimento serve anche per neutralizzare glieffetti del mezzo (che non può essere sempre lo stesso) perché le differenze fraceppi rimangono inalterate: i più vigorosi ed i meno vigorosi restano talianche se i mosti sono diversi.Molto importante è anche l'entità dell'inoculo che deve essere uguale pertutti i ceppi. A questo fine, è consigliabile preparare provette contenenti5 mL di mosto sterilizzato (10 stesso che verrà messo in prova) e inocularlo con cellule tratte da strisci coetanei. Dopo 3 giorni di sviluppo a 25 DC,le precolture vanno agitate e l'intero contenuto viene versato nei 100 mLdi mosto pronti. Se invece si utilizza un lievito secco, questo va reidratatosecondo le istruzioni e inoculato in ragione di 1 mL per litro di mosto, checorrisponde a lO g/hl.Se il carattere che si vuole determinare è il vigore fermentativo, si deveimpiegare mosto tale e quale. Se invece è la resistenza alla S02 si deveaggiungere una quantità costante del composto: ad esempio, risultati probanti si ottengono con 100 mg per litro.Se si vuole esprimere 1'uno o l'altro carattere in termini numerici si puòprendere come punto di riferimento 1'entità del calo in peso dopo 2 giorni: infatti, dopo questo tempo le differenze di intensità di fermentazionefra i ceppi sono bene evidenti, mentre nei giorni successivi tendono adannullarsi. È possibile che in presenza di S02 alcuni ceppi non mostrino

\

<olio di paraffina

<entità dell'inoculo

<vigore fermentativo

89 Il Il

-----__ 1 102

segno di sviluppo (di calo in peso) dopo 2 giorni: questo significa che sonomolto sensibili.

<potere fermentativo

<

metodo integrale

<capacitàdi flocculazione

Determinazione dell'alcol-tolleranza

I.:alcol-tolleranza, da Castelli definita potere fermentativo, esprime la quantità massima di etanolo che un ceppo può produrre da un eccesso di zucchero. Questo carattere è determinato con il metodo integrale (con valvole adacido solforico) e prevede l'impiego di mosto arricchito di zucchero fino allaconcentrazione del 30%. Ancora una volta lo sviluppo è seguito sulla base delcalo in peso, ma quello che interessa è il valore finale, direttamente proporzionale all'intensità della fermentazione. Il dato finale va poi verificato con leesatte determinazioni del volume di etanolo formato e dello zucchero residuo.Il potere fermentativo viene espresso con un numero corrispondente alvolume di etanolo formato in 100 mL di mosto arricchito. Il carattere è alivelli molto elevati in S. cerevisiae perché in questa specie sono pochi i ceppiprovenienti da vino con valori inferiori a 14. Le differenze più rilevanti sitrovano mettendo in prova ceppi di altre specie, tutte situate a livelli piùbassi: Kloeckera apiculata a livello di circa 4, Hanseniaspora guilliermondii di7-8, Schizosaccharomyces pombe, Torulaspora delbrueckii e le specie del genere Zygosaccharomyces di 8-10. Anche le altre specie del genere Saccharomyces(fra cui il freddofermentante S. uvarum o S. bayanus) hanno potere fermentativo inferiore a quello di S. cerevisiae. È questo il motivo principale (manon è il solo) che fa di S. cerevisiae il lievito più importante del settore enologico: gli altri non sono in grado di trasformare completamente il mosto1ll VIno.

Determinazione della capacità di flocculazione

Le cellule dei ceppi di S. cerevisiae che hanno la capacità di flocculare si aggregano tra loro dando origine alla formazione di fiocchi o di grumi compatti.La capacità di flocculazione è di facile e rapida determinazione e può essererilevata osservando il comportamento del deposito al termine dello sviluppoin mezzo liquido: per agitazione non si distaccano cellule che intorbidanouniformemente il mezzo, bensì aggregati cellulari che si sollevano e poi ricadono rapidamente sul fondo senza dare torbidità. Il carattere è rilevabile

'\ anche prendendo in esame colture in striscio: se si preleva una parte della patina con una punta di filo, si nota che questa non ha consistenza cremosa(come nei ceppi non flocculenti), ma è più dura e rilascia aggregati di cellule.I ceppi flocculenti non sono idonei per la fermentazione dei mosti ,perché,a causa dell'aggregazione, le loro cellule si depositano, non occupano tuttoil volume del mezzo e fermentano più lentamente. Il carattere ha, invece,grande importanza per le rifermentazioni dei vini spumanti e frizzanti.

Determinazione della capacità schiumogena

Molti ceppi di S. cerevisiae hanno cellule che durante la fermentazione sonoattratte dalle bollicine di anidride carbonica e da queste vengono trascinatein superficie. Qui rimangono nella schiuma che diventa persistente ed alta.

Il Il 90

• Parte Terza Applicativa I I l •

Il fenomeno non è dipendente dalla natura e dalla composizione del mosto,bensì dalla presenza sulla superficie delle cellule di proteine che conferisconola tensioattività ed è negativo perché costringe a lasciare ampio spazio nellaparte alta delle vasche (in caso contrario il mosto in fermentazione esce) riducendone il volume utile. La presenza del carattere può essere determinata inlaboratorio con prove di fermentazione di mosti usando il metodo descrittoper i caratteri di competitività ed è rilevabile se la fermentazione è rapida econ formazione di bollicine di CO2• Sulla superficie del liquido (anche conlo strato di olio di paraffina) si forma una schiuma alta circa 2 cm, di colorebruno che sporca le pareti del matraccio.

Determinazione della temperatura ottimale

La temperatura ottimale di una coltura microbica si determina facendo usodi un attrezzo chiamato politermostato.Il politermostato è costituito da un parallelepipedo di metallo, lungo il qualesi trova una fila (anche due o tre) di fori, ciascuno dei quali può contenere unanormale provetta (oppure 3 o 4 provette piccole e un termometro). Una estremità del politermostato è dotata di un impianto di raffreddamento, l'estremità opposta di un impianto di riscaldamento. Una volta stabilizzato il sistema,lungo la fila di fori si hanno le temperature intermedie. Si prepara una serie diprovette o di provettine con un mezzo nutritivo liquido limpido e sterilizzato;tutte vengono poi inoculate in maniera uniforme con la coltura in esame. Leprovette vengono messe nei fori a varie temperature e dopo un cerro tempo(generalmente 18-24 ore) si determina l'intensità dello sviluppo per via turbidimetrica. La temperatura in corrispondenza della quale lo sviluppo è piùintenso con maggiore torbidità, è considerata quella ottimale, cioè la temperatura che consente la moltiplicazione più rapida delle cellule. Generalmentela temperatura ottimale di sviluppo così determinata è più alta rispetto aquella che dà origine alle fermentazioni più complete.

Determinazione della capacitàfermentativa a basse temperature

La capacità di fermentare ancora bene a basse temperature, da 4 a lO cC, ètipica dei lieviti cosiddetti freddofermentanti o criotolleranti, il piùimporrante dei quali è S. uvarum.La specie S. uvarum è stata recentemente riproposta come specie a sé, mentre secondo la classificazione di Kurtzman e Fell (1998), i ceppi che primacostituivano la specie S. uvarum erano quasi tutti compresi nella specie S.bayanus. Comunque sia, si tratta di una specie presente quasi sempre nellenormali vinificazioni, benché in misura minore rispetto a S. cerevisiae, chein alcuni casi può diventare dominante: una situazione esemplare, a questoproposito, è quella dei mosti frigoconservati.

\

<tensioattività

<politermostato

<temperatura ottimale

<classificazione

di Kurtzman e Fell

91 Il Il

_______ 1 102

I CEPPI FREDDOFERMENTANTI RIFERIBILI A S. UVARUM POSSONO ESSERE FACILMENTE IDENTIFICATI:

..., incubando un coltura in mosto a 6 O( e determinando !'intensità della fermentazione dopo 20 giorni (il metodo èun po' lungo);..., incubando una coltura a 37 0(, temperatura alla quale i freddofermentanti non sviluppano (il metodo è menosicuro).

Formazione di composti secondari della fermentazione

<

composti secondari

Durante la fermentazione alcolica, tutti i lieviti producono, oltre all'etanoloe all'anidride carbonica, numerosi altri composti fra i quali glicerolo, acidosuccinico, acido acetico, aldeide acetica e alcoli superiori. Lentità di formazione di questi composti minori rispetto all'etanolo varia in misura notevole da specie a specie e, nell'ambito di una specie, da ceppo a ceppo. Laconoscenza del comportamento di un lievito da questo punto di vista puòessere importante, in particolare nel caso di colture selezionate o in selezione.La produzione dei composti secondari da parte di un ceppo non è costante, perché questi caratteri sono influenzati dalla composizione del mostod'uva. Tuttavia, la variabilità riguarda tutti i ceppi e le differenze fra gli unie gli altri persistono anche in mosti differenti. Per questo la determinazione di tali caratteri va eseguita in mosto d'uva, a condizione di eseguireconfronti con almeno un ceppo di riferimento a comportamento noto. Adesempio, la produzione di acido acetico da parte di S. cerevisiae varia, infunzione del ceppo, da 0.1 a oltre 1 grammo per 100 volumi di etanolo;la maggior parte dei ceppi è situata a quello che può essere considerato illivello medio della specie, cioè a 0.3 grammi, con possibilità di variazionida 0.2 a 0.4 g, in funzione del mosto.

SE SI VUOLE CONOSCERE IL COMPORTAMENTO DI UNO O PiÙ CEPPI A QUESTO RIGUARDO, SI puO SEGUIRE QUESTO PROCEDIMENTO:

1. preparare matracci conici contenenti 500 ml di mosto sterilizzato, tanti quanti sono i ceppi in esame;2. inoculare i mosti dei matracci con singole colture (compreso il ceppo di riferimento);3. incubare a 25 O( e lasciare fermentare a fondo;4. chiarificare i vini e sottoporli ad analisi almeno dell'etanolo e dell'acido acetico.

Lentità di produzione di acido acetico va riferita non al volume (litro) divino, ma a 100 volumi di etanolo. I valori dati dai ceppi in studio vannoconfrontati con quelli del ceppo (o dei ceppi) di riferimento: se questo è unceppo "medio", possono essere considerati idonei tutti quelli che dannovalori inferiori, di dubbia idoneità quelli che danno valori superiori.Questo stesso procedimento può essere seguito per tutti i più comuni prodotti minori della fermentazione che, sulla base di vari studi biometrici, inS. cerevisiae hanno i valori medi ed estremi esposti in Tabella 5.

Produzione di composti solforati

<anidride solforosa,idrogeno solforato

Durante lo sviluppo e durante la fermentazione, S. cerevisiae ed altri lievitiformano solfiti (anidride solforosa) e idrogeno solforato per riduzione deisolfati. Lentità di produzione di anidride solforosa può essere determinata

Il Il 92\


Valori espressi come grammi o milligrammiper 100 volumi di etanolo

Bassi Medi

* I ceppi non producenti H2Sformano alte quantità del composto (>100 mg/L).** La produzione di alcol isoamilico è in gran parte dipendente dalla composizione dei mosti: l'influenza del ceppo dilievito è molto limitata.

Alti

>6

> 0.7

> 0.4

> 40

> 40

> 50

>150

[Tabella 5]Entità di produzione di compostiminori da parte di Saccharomycescerevisiae.

5-6

0.6-0.7

0.3-0,4

30-40

30-40

\ 35-50

100-150

<5

<0.6

<0.3

< 30

< 20

< 25

< 80

Composto

Glicerolo (g)

Acido succinico (g)

Acido acetico (g)

Aldeide acetica (mg)

n-Propanolo (mg*)

Isobutanolo (mg)

Alcoli amilici (mg**)

al termine dello sviluppo. in mezzosintetico ed è sempre positiva.La maggior parte dei ceppi è a livellicompresi fra 4 e 20 mg per litro, maalcuni arrivano a quantità prossime a100 mg/L. Nello stesso mezzo sintetico può essere valutata anche la produzione di H 2S, sulla base del gradodi annerimento di una cartina all'acetato di piombo fermata dal tappoall'interno del matraccio.La capacità di produrre H 2S può essere anche ben valutata facendo uso delterreno solido BiGGY, contenentesolfito di bismuto come indicatore.Gli strisci di S. cerevisiae su questo terreno possono sviluppare producendopatina bianca (produzione di H 2S assente) oppure patina di colore brunopiù o meno carico in funzione della intensità di produzione.

I ce i di riferimento

Per la determinazione dei caratteri di tutti i tipi, qualitativi, quantitativi oche riguardano prestazioni, è necessario disporre di ceppi con comportamento noto con i quali possono essere confrontati quelli oggetto di studio.I ceppi di confronto non sono mai i ceppi tipo i quali servono per l'identificazione delle specie e sono inurilizzabili ai fini della caratterizzazioneenologica.È consigliabile avere nella propria collezione diversi ceppi, ciascuno dei qualiin possesso di una caratteristica enologica importante quale:

.., alto vigore fermentativo (è utile avere anche un ceppo con basso vigore);

.., alta resistenza all'anidride solforosa (è utile avere anche un ceppo molto sensibile);

.., alto potere alcoligeno;

.., capacità di flocculazione ai più alti livelli;

.., potere schiumogeno;

.., incapacità di produrre idrogeno solforato;

.., produzione di alte oppure di basse quantità di acido acetico;

.., altri caratteri che possono interessare.

Quando si esegue la caratterizzazione di ceppi, si mettono in prova, oltrea quelli oggetto dello studio, anche ceppi con caratteristiche note, in mododa poter attribuire il giusto significato ai risultati, eliminando o attenuandol'influenza eventualmente svolta dal mezzo nutritivo impiegato.

<caratterizzazione

di ceppi

93 Il Il

03 Analisi microbiologica dell'uva

<microbiota

3.1_1 microrganismi dell'uva

È ben noto da molto tempo che sulla buccia dell'uva ancora in campo si trovano cellule microbiche, la cui entità di presenza può variare in misura considerevole in funzione di diversi fattori. Le cellule microbiche portate dall'uvapassano nel mosto al momento della pigiatura e sono quelle che danno origine alla sua fermentazione naturale (la cosiddetta "fermentazione spontaneà'),assieme a quelle associate alle attrezzature di cantina. La conoscenza delle specie che compongono questo microbiota e dei rapporti con cui le specie sonopresenti è importante da molti punti di vista, anche quando poi la fermentazione dei mosti viene affidata a lieviti selezionati. I metodi che vengono seguiti per lo studio di questi organismi sono dipendenti dalla finalità che si prefigge lo studio e dallo stato sanitario dell'uva. I procedimenti che sono quidescritti possono essere considerati di base; nulla vieta che possano esseremodificati conformemente ai criteri definiti dal ricercatore e dipendentemente dalle possibilità offerte dal laboratorio (ad esempio, anziché singoli acinipossono essere sottoposti ad analisi più acini contemporaneamente ecc.).

'\ 3.2 La contaminazione casuale

I microrganismi sono diffusi più o meno dappertutto nell'ambiente e sonoveicolati dall'aria (spore di muffe) da aerosol o goccioline d'acqua (batteri elieviti), da insetti e animali di dimensioni maggiori. La contaminazione diqualunque alimento è sempre casuale: spore o goccioline d'acqua che cadono sulla sua superficie, insetti che vi si appoggiano, possono trasportare unagrande varietà di microrganismi.

3.3_Analisi dell'uva sana

Sull'uva sana si possono trovare cellule microbiche depositate sulla buccia, cosìcome su qualunque altra superficie esposta a contaminazione ambientale.

Il Il 94/


Queste cellule possono derivare dall'atmosfera ma più spesso derivano dal terreno sottostante portate dalla pioggia, specie se battente, da insetti e da altrivettori. In genere, queste cellule sono poco numerose e, in molti casi, possono mancare del tutto. I microrganismi di cui interessa determinare l'entità dipresenza sono soprattutto i lieviti che intervengono o possono interveniredurante la successiva fermentazione alcolica ed i batteri lattici agenti della fermentazione malolattica. Per questo motivo, i metodi che vengono seguiti sonoquelli tradizionali che prevedono l'arricchimento in mosto d'uva.

3.4_Analisi di singoli acini

Quando l'analisi microbiologica viene eseguita su acini singoli, le probabilità di avere esito comunque positivo sono molto scarse; è necessario quindipreparare il materiale occorrente per l'analisi di un grande numero di unità(da 1.000 in su).


..., Provettoni sterili di plastica o vetro (diametro 2 cm, altezza 10 cm).

..., Un paio di forbici .

..., Una bottiglia di alcol etilico.

..., Battlffoli di cotone idrofilo.

..., Matracci contenenti mosto d'uva sterilizzato (in volume adeguato) .

..., Pestelli di vetro.

..., Pipette da 10 mL sterilizzate.

..., Etichette autoadesive.

..., Quaderno per registrazione dati.

Procedimento

..., Dopo aver stabilito i criteri di campionamento ed il numero di campioni da esaminare, andare nel vigneto conprovette, forbici, alcol, cotone, etichette e quaderno...., Sterilizzare le forbici con cotone imbevuto di alcol; questa operazione va ripetuta per ogni acino...., Tagliare il picciolo di un acino facendolo cadere, intatto, direttamente dentro una provetta aperta (occorrono 2persone). '..., Chiudere la provetta con tappo di cotone...., Etichettare la provetta, numerarla e scrivere su registro le notizie essenziali ...., Trasferire tutti i campioni in laboratorio...., Pigiare accuratamente ogni acino con pestello di vetro sterilizzato...., Aggiungere 10 mL di mosto sterilizzato ad ogni provetta...., Incubare alla temperatura di 25°C...., Dopo 1 giorno e nei giorni successivi accertare se nel mosto ci sia sviluppo microbico con formazione di gas...., In caso positivo, eseguire l'esame microscopico e procedere all'isolamento in piastra, impiegando i terreninutritivi più idonei in funzione delle finalità.

95 Il Il

---- 1 103

Risultati attesi

Con questo metodo si determina il numero e quindi la percentuale di acini "fertili", cioè che sono portatori di cellule microbiche. Èpossibile anche stabilire quali siano le specie di lievito più rappresentate fra quelle che hanno lapossibilità di intervenire nel corso della fermentazione dei mosti e successivamente.La metodologia descritta si riferisce soprattutto ai lieviti; essa è analoga per altri gruppi microbici, quali i batterilattici, la cui presenza può essere rilevata usando il mezzo di arricchimento ed i terreni d'isolamento adatti.

3.5_Analisi di grappoli

L'analisi microbiologica di singoli acini è molto laboriosa e richiede notevole impegno. La determinazione della contaminazione casuale può essereeseguita anche prendendo in esame grappoli interi.

~ateriali e attrezzature

..., Forbici da vendemmia.

..., Sacchetti di plastica molto robusti, grandi, trasparenti e sterilizzati .


..., Batuffoli di cotone idrofilo.

..., Etichette autoadesive e quaderno.

Procedimento

..., Dopo aver stabilito i criteri di campionamento ed il numero di campioni da esaminare, andare nel vigneto conforbici, sacchetti di plastica, alcol, cotone, etichette e quaderno...., Sterilizzare le lame delle forbici con cotone imbevuto di alcol; questa operazione va ripetuta per ogni grappolo...., Tagliare il graspo alla base facendo cadere il grappolo, intero e intatto, direttamente dentro un sacchetto diplastica (occorrono 2 persone) ...., Chiudere accuratamente la bocca del sacchetto di plastica.~ Etichettare i sacchetti, numerarli e scrivere su registro le notizie essenziali...., Trasferire tutti i campioni in laboratorio...., Chiudere ermeticamente le bocche dei sacchetti, possibilmente con saldatura a caldo e lasciando la minor quantità possibile di aria all'interno...., Pesare ogni campione...., Pigiare accuratamente con pressione manuale l'intero grappolo facendo attenzione a non danneggiare l'involucrodi plastica...., Mettere tutti i sacchetti contenti graspi e mosto in termostato a 25 dc...., Controllare quotidianamente lo stato dei sacchetti; il gonfiore è indice sicuro di fermentazione alcolica in atto...., Aprire il sacchetto e sottoporre ad esame microscopico ed isolamento il mosto in fermentazione.

Risultati attesi

Con questo procedimento si determina il numero e la percentuale di grappoli sui quali sono presenti lieviti diinteresse enologico. Il risultato può essere espresso in termini di grappoli fertili oppure può essere riferito alpeso del materiale esaminato.

3.6_Analisi della carposfera

Le analisi degli acini e dei grappoli eseguite col metodo dell'arricchimentohanno grande interesse sotto l'aspetto tecnologico ma non consentono diindividuare tutti i microrganismi. È dimostrato infatti che sulle superfici

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delle foglie e dei frutti la presenza di cellule microbiche non è sempre casuale perché i microrganismi possono sviluppare in misura molto limitata aspese di essudati e formare delle microcolonie. Le cellule delle microcolonieaderiscono strettamente alla superficie, non si distaccano con facilità e nonsempre denunciano la loro presenza con il metodo dell'arricchimento.Questi micro-habitat delle foglie e dei frutti costituiscono rispettivamente lafillosfera e la carposfera.Lo studio della carposfera deve essere eseguito, oltre che con l'arricchimento,con l'osservazione diretta al microscopio elettronico a scansione poi, previarimozione delle cellule che aderiscono alla superficie dell'acino, medianteripetuti ed energici lavaggi o con ultrasuoni. Inoltre, è bene impiegare mezzi "e terreni selettivi per rilevare la presenza di specie microbiche altrimenti didifficile isolamento.Lanalisi microbiologica della carposfera ha interesse sia dal punto di vistaecologico sia da quello tecnologico, perché dà un quadro completo dellasituazione esistente al momento della pigiatura dell'uva. Alcune specie dilieviti rilevabili con questi metodi e non con il semplice arricchimento possono poi trovare possibilità di sviluppo durante la vinificazione con risultatiinattesi.Le metodiche da seguire per lo studio della carposfera non vengono quidescritte dettagliatamente perché riguardano principalmente il settore dellaricerca e richiedono attrezzature che sono fuori dalla portata di un normalelaboratorio di microbiologia enologica di cantina.

3.7_Analisi dell'uva danneggiata

Non sempre l'uva al momento della vendemmia è tutta sana ed integra; spesso i grappoli sono portatori di acini danneggiati da eventi meteorici, da malattie o da uccelli. In questi casi, il succo non è protetto dalla buccia ed è esposto allo sviluppo anche intenso di microrganismi contaminanti casuali ma,soprattutto, portati da insetti (moscerini, vespe, lepidotteri). In questi casi, ilnumero di cellule è molto elevato e la loro presenza può essere determinatacon isolamento diretto, senza previo arricchimento.

<fillosfera e carposfera

<pigiatura dell'uva

<contaminanti casuali

<insetti


..., Provettoni sterili in plastica o vetro (diametro 2 cm, altezza 10 cm) .

..., Un paio di forbici.


..., Batuffoli di cotone idrofilo.

..., Matracci contenenti acqua peptonata o soluzione fisiologica sterile (in volume adeguato).

..., Provette contenenti 9 mL di acqua peptonata o soluzione fisiologica sterile.

97 Il Il

_______ 1 103

..., Pestelli di vetro.

..., Pipette da 10 mL sterili.

..., Pipette da 1 mL sterili.

..., Etichette autoadesive.

..., Quaderno per registrazione dati.

..., Contaglobuli.

Procedimento

..., Sterilizzare le forbici con cotone imbevuto di alcol; questa operazione va ripetuta per ogni acino.

..., Tagliare il picciolo di un acino danneggiato facendolo cadere direttamente dentro una provetta aperta (occorrono2 persone)...., Chiudere la provetta con tappo di cotone...., Etichettare la provetta, numerarla e scrivere su registro le notizie essenziali ...., Trasferire tutti i campioni in laboratorio...., Pigiare accuratamente ogni acino con pestello di vetro sterilizzato...., Aggiungere 10 mL di soluzione fisiologica sterilizzata ad ogni provetta ed agitare vigorosamente (diluizione1/10)...., Eseguire l'esame microscopico e il conteggio diretto delle cellule con contaglobuli ...., Diluire ulteriormente il campione...., Eseguire la semina in piastra da almeno tre diluizioni su terreno nutritivo idoneo.

Risultati attesi

Con il metodo descritto si può eseguire il conteggio di lieviti, batteri lattici e batteri acetici presenti sugli acinidanneggiati. Èmolto probabile che su acini non integri siano in pieno sviluppo lieviti riferibili a numerose specie.Lo studio va allora completato con la loro identificazione e con la determinazione della percentuale di presenza.

Il Il 98

04 Analisi microbiologichedei mosti e delle fecce

4.1_Controllo del mosto

I mosti d'uva, dal momento che segue la pigiatura dell'uva fino al termine della fermentazione alcolica, rappresentano una fase assolutamentetransitoria della vinificazione.Il mosto può essere osservato direttamente al microscopio e le cellule dilievito sono immediatamente visibili, se presenti in numero maggiore di1Q5/mL; il loro conteggio è possibile con vetrino contaglobuli di Thoma,di Biirker o simile.Il tempo necessario per l'operazione è, in teoria, molto ridotto, ma ilmosto fresco contiene una tale quantità di frammenti solidi in sospensione che è difficile distinguere le cellule di lieviti e praticamente impossibile riconoscere le cellule batteriche. La colorazione delle cellule vive non nefacilita la rilevazione, perché anche la sostanza organica in sospensione sicolora facilmente e le cellule restano indistinguibili.Il conteggio su piastra consente una determinazione quantitativa molto precisa della carica microbica, ma il tempo necessario allo sviluppo delle colonieè dell'ordine di qualche giorno e quindi la conoscenza del livello di contaminazione è possibile solo a posteriori, per ricostruire la storia di una vinificazione. È importante allora trarre il maggior numero di informazioni da essa.Per la determinazione del contenuto in lieviti e batteri acetici i terreni dicoltura consigliati sono YM, YEPG, WL.

<YM, YEPG, Wl

99 Il Il

_______ 1 104

<cicloesimide

<terrenidi coltura specifici

<

batteri lattici

<catalasi

Con terreno YM, l'incubazione a 30°C in aerobiosi consente lo sviluppodella gran parte dei lieviti in tempi anche inferiori a 48 ore. A quella temperatura, però, non crescono le specie di Rhodotorula ed ancheHanseniaspora uvarum cresce a stento; altre specie (Dekkera spp., Pichia exHansenula spp.) hanno uno sviluppo più lento e la loro rilevazione richiede qualche giorno in più, pertanto è consigliabile una temperatura diincubazione non superiore a 25°C. Il terreno di coltura WL consente diottenere un maggior numero di informazioni dalla stessa operazione,anche se in un tempo leggermente più lungo. In questa fase non è quasimai importante evidenziare particolari gruppi di lieviti rispetto a quelliche si possono già riconoscere su terreno WL. Inoltre anche l'aggiunta dicic1oesimide, antibiotico attivo su buona parte delle specie di lieviti, noninibisce lo sviluppo delle cellule della specie più comune in questa fase,Hanseniaspora uvarum.Sui terreni finora indicati crescono molto bene anche i batteri acetici, chedanno colonie piatte, traslucide, di colore verde intenso su WL. Nel caso siarichiesta questa ricerca, è possibile anche l'impiego di terreni di colturaspecifici, che contengono carbonato di calcio, per neutralizzare l'eccesso diacidità dovuto alla produzione di acido acetico, nei quali è facilitato lo sviluppo delle colonie: uno di questi è il GYC, che contiene cicloesimide e nonconsente lo sviluppo dei batteri lattici.La rilevazione dei batteri lattici è invece molto più difficile. Le esigenzenutrizionali del Oenococcus oeni lo rendono difficile da coltivare in laboratorio. Volendo impiegare esclusivamente terreni di coltura disponibili incommercio, o comunque di semplice composizione, i terreni che dannomigliori risultati sono il Tornato Juice Agar e l'MRS al 20% di succo dipomodoro. I tempi necessari perché le colonie raggiungano dimensioni sufficienti per poter essere contate sono di almeno 15 giorni in condizioni diana~robiosi. Inoltre le colonie sviluppate devono poi essere osservate almicroscopio, poiché l'ossigeno nel terreno non è sempre del tutto rimossodal sistema che genera l'anaerobiosi ed è possibile lo sviluppo di batteri acetici che danno colonie leggermente più grandi e piatte rispetto ai batteri lattici; allora è necessario sottoporre le colonie sviluppate al test della catalasi:quelle di batteri lattici sono catalasi-negative, quelle di batteri acetici sonocatalasi-positive.Un terreno la cui preparazione è più laboriosa, ma che dà risultati leggermente più rapidi, in termini di tempi di sviluppo delle colonie, è il terrenoMTb secondo Delfini e Berta.

4.2_Controllo del mosto non ancora in fermentazione

In questo mosto tutte le forme microbiche sono da considerare contaminanti, e particolarmente le cellule di Saccharomyces cerevisiae, perché andranno acompetere con il ceppo che verrà inoculato.Fatta eccezione per casi particolari, la contaminazione del mosto è di solitodell'ordine di 104-106 cellule/mL: il primo valore è accettabile, il secondoindica un imminente pericolo di avvio di fermentazione.

Il Il 100


ApPLICAZIONI

>

1_Metodi microscopici

Il controllo della contaminazione del mosto può essereeffettuato mediante osservazione diretta al microscopio,perché le cellule di lievito sono immediatamente visibili sepresenti in numero maggiore di 10s/mL.Il conteggio dei lieviti è possibile con vetrino contaglobuli di Burker, ma anche di Thoma o simile. Il tempo necessario all'operazione è, in teoria, molto poco, ma se ilmosto è appena ottenuto contiene una tale quantità diframmenti solidi in sospensione che è difficile distinguere

2_Conta su piastra

Il conteggio su piastra consente una determinazionequantitativa molto precisa della carica microbica, ma iltempo necessario allo sviluppo delle colonie è dell'ordinedi qualche giorno. Con questo metodo la conoscenza del

I

I

3_Ricerca di lieviti e batteri acetici

Per questa determinazione i terreni di coltura consigliatisono YM, YEPG, WL. Con terreno YM, l'incubazione a 30°Cin aerobiosi consente lo sviluppo della gran parte dei lieviti in tempi anche inferiori a 48 ore. A 30°C però, non crescono alcuni ceppi di Rhodotorula, la cui importanza è tuttavia marginale per la vinificazione, come pure alcuni diHanseniaspora uvarum, la cui presenza è invece assaiimportante da rilevare. Altre specie (Dekkera spp., Pichiaex Hansenula spp.) hanno uno sviluppo più lento e la lororilevazione richiede qualche giorno in più. La temperaturadi incubazione consigliata in questo caso è di 25°C.Il terreno di coltura WL consente di ottenere un maggiornumero di informazioni dalla stessa operazione, anchese in un tempo leggermente più lungo, perché le diversespecie di lieviti presentano colonie con morfologie differenti. In questa fase quindi non è quasi mai importante

le cellule di lieviti e praticamente impossibile riconoscerele cellule batteriche. La colorazione delle cellule vive nonè consigliabile in questa fase, perché anche la sostanzaorganica in sospensione si colora facilmente e le cellulerestano indistinguibili.I batteri sono molto difficili da distinguere nel mosto torbido ed è praticamente impossibile rilevarli in una camera diBurker, che ha uno spessore tale per cui essi si muovono evanno facilmente sopra o sotto il piano di messa a fuoco.

livello di contaminazione è possibile solo a posteriori, adesempio per ricostruire la storia di una vinificazione; èimportante allora trarre da essa il maggior numero diinformazioni.

evidenziare particolari gruppi di lieviti rispetto a quelliche si possono già riconoscere su terreno WL.Il terreno WLD, uguale al precedente ma contenentecicloesimide, antibiotico attivo su buona parte delle specie di lieviti, non impedisce lo sviluppo delle cellule dellaspecie più comune in questa fase, Hanseniaspora uvarum.Sui terreni finora indicati crescono molto bene anche ibatteri acetici, che danno colonie piatte, traslucide, dicolore verde intenso su WL.I terreni di coltura specifici per questi batteri contengo-no carbonato di calcio per neutralizzare l'eccesso di acidità dovuto alla produzione di acido acetico e facilitanolo sviluppo delle colonie: uno di questi è il GYC (FotoAppendice 15), che contiene cicloesimide e non consen- •te lo sviluppo dei batteri lattici, ma dà risultati difficili dainterpretare.

101 Il Il

_______ 1 104

4_Ricerca di batteri lattici

La rilevazione dei batteri lattici è molto più ardua. Le esigenze nutrizionali di Oenococcus oeni (una volta noto comeLeuconostoc oenos) lo rendono difficile da coltivare in laboratorio. Tra i terreni di coltura disponibili in commercio, ocomunque di semplice composizione, quelli che dannomigliori risultati sono il Tornato Juice Agar, che molte casehanno eliminato dal catalogo, l'MRS modificato con l'aggiunta del 20% di succo di mela o pomodoro, esoprattuttoil terreno ATB. I tempi necessari perché le colonie possano

essere contate sono di almeno 10-12 giorni, meglio 15, incondizioni di anaerobiosi. Una volta sviluppate, le coloniedevono essere osservate al microscopio, in quanto l'ossige-no nel terreno non è del tutto rimosso dal catalizzatore epuò verificarsi sviluppo di batteri acetici, che danno colonieleggermente più grandi e piatte rispetto ai batteri lattici; inquesto caso è necessario sottoporre le colonie sviluppate al •test della catalasi: quelle di batteri lattici sono catalasinegative, quelle di batteri acetici sono catalasi-positive.

4.3_Determinazione della carica batterica totale nei mosti

Da quanto riportato sopra si deduce che non esistono terreni di coltura ometodologie idonee alla determinazione della carica batterica totale: esprimere quindi il contenuto di batteri di mosti e/o vini come il risultato di unaconta su Plate Count Agar non è esatto, perché i batteri lattici crescono soloin minima parte su PCA. È più corretto indicare separatamente il contenutoin "lieviti e batteri acetici" e in "batteri lattici".

4.4_Analisi microbiologiche delle fecce

<fecce

<lieviti dominanti

<specie marginali

Al termine della fermentazione dei mosti e dopo l'allontanamento del vino,sul fondo delle vasche rimangono le fecce, costituite prevalentemente da cellule di lieviti e da particelle solide derivanti dalla pigiatura. I lieviti delle feccesono tutti quelli che hanno partecipato alla fermentazione alcolica dall'inizioalla fine. Tuttavia, il complesso di lieviti è costituito sia da cellule vive che dacellule morte ed è presumibile che queste ultime derivino dalle specie e daiceppi che per primi hanno cominciato a sviluppare.Lanalisi microbiologica delle fecce può avere interesse per individuare ilieviti dominanti nel corso della fermentazione e, soprattutto, quelli chela portano a termine; è molto probabile che questi ultimi siano i più vitali ed i più alcol-tolleranti. Essa è suscettibile di dare i risultati più rilevanti nel caso di fermentazione condotta senza lieviti selezionati. Con questaanalisi si può tentare l'isolamento di specie marginali, naturalmentericorrendo all'arricchimento e all'uso di terreni selettivi.I campioni devono essere prelevati al momento dell'apertura del portelloposto alla base delle vasche, tenendo in considerazione la difficoltà a riferire il risultato ottenuto ad un volume preciso, come si è già discusso nelparagrafo "Il campionamento".

Il Il 102



-, Recipiente ben pulito (eventualmente sterilizzato con alcol al momento).-, Sacchetti in plastica sterili.-, Bottiglie o matracci tarati da 1'00 mL contenenti circa 80 mL di acqua peptonata o soluzione fisiologica sterile.-, Pipette da 10 mL sterili.-, Acqua peptonata o soluzione fisiologica sterile in matracci di 100 mL.-, Contaglobuli e microscopio.-, Batteria di provette con 10 mL di acqua peptonata o soluzione fisiologica sterile.-, Pipette da 1 mL sterili.-, Batteria di piastre sterili.-, Terreno nutritivo idoneo sterile e distribuito in provette.-, Se del caso e in alternativa, mezzo nutritivo di arricchimento.

Procedimento

-, Prelevare alcuni chilogrammi di feccia densa e portare in laboratorio.-, Prelevare 10 mL di feccia, trasferirli in sacchetto sterile o in matraccio tarato da 100 e portare a segno consoluzione fisiologica o acqua peptonata; agitare bene la sospensione (diluizione 1/10).-, Eseguire le diluizioni progressive 10-2, 10-3 fino a 10-8.

-, Eseguire conteggi diretti al contaglobuli cominciando dalla prima diluizione fino alla quarta; esaminare almicroscopio la morfologia delle cellule.-, Eseguire semine in piastra con 1 mL di più diluizioni, cominciando da quella che ha un carico microbico di circa1000 cellule per mL.-, Incubare a 25 cC fino a formazione di colonie ben sviluppate.-, Fare esame morfologico e microscopico delle colonie e procedere con !'isolamento, secondo le finalità dell'analisi.-, Se è il caso, inoculare 1 mL (o più) della diluizione contenente cellule interessanti in mezzo o in condizioni diarricchimento idonei.

Risultati attesi

Le cellule ancora vive che si possono isolare dalle fecce fanno parte presumibilmente dei cloni più alcol-tolleranti e vigorosi, quelli cioè che hanno portato a termine la fermentazione; il loro isolamento può avere un interesseparticolare ai fini della selezione di nuove colture di lieviti.

103 Il Il

05 Analisi microbiologichedel vino in bottiglia

5.1 Il metodo standard

I..:imbottigliamento è la fase conclusiva della vinificazione. Solamente per ivini spumanti e frizzanti per rifermentazione in bottiglia è richiesto lo sviluppo dei lieviti, ma questo è limitato dalla quantità di zuccheri aggiunti al vinobase. In tutti gli altri casi, il vino deve essere imbottigliato in condizioni talida non consentire lo sviluppo di alcun microrganismo, sia di lieviti che dibatteri lattici o acetici.

QUANDO SI VOGLIA IMPEDIRE LO SVILUPPO DI LIEVITI, IL RISULTATO PUÒ ESSERE RAGGIUNTO ATTRAVERSO TRE VIE:

..., con la pasteurizzazione del prodotto già confezionato in bottiglia.

..., con l'esaurimento di nutrienti necessari per il loro sviluppo e, in particolare, di zuccheri fermentescibili o, in alcunicasi, di composti azotati;..., con la filtrazione sterilizzante.

<campionamento

<imbottigliatrice

In tutti i casi il primo problema che si presenta è quello del campionamento:dato un lotto costituito da n unità, si tratta di stabilire il numero di campionida sottoporre ad analisi ed i criteri da seguire per il loro prelevamento.Un campionamento corretto dal punto di vista statistico richiederebbe l'esame di un numero molto elevato di bottiglie, impraticabile per un singoloimbottigliamento. È possibile allora suddividere questo controllo in più giornate. Supponendo di avere un'imbottigliatrice da 60 ugelli e di imbottigliareper sei giorni a settimana, è possibile prelevare il lunedì lO campioni dagliugelli l-IO, il martedì dagli ugelli 2-20, e così via per il resto della settimana.In questo modo, nel medio-lungo periodo, è possibile individuare la presenzadi problemi legati a qualche ugello sempre contaminato, perché magari è danneggiato e non viene sterilizzato correttamente prima dell'inizio dell'imbottigliamento. Lo stesso accorgimento può essere applicato per il controllo ditutte le altre attrezzatute dell'impianto di imbottigliamento, come sciacquatrici, tappatrici, ecc. In generale, è difficile ottenere la sterilità assoluta del 100%delle bottiglie.

Il Il 104


Uno standard diffusamente accettato dalle grandi aziende imbottigliatricipone come limite massimo di contaminazione un 2-3% di bottiglie contenenti lieviti o batteri, in quantità non superiore a lO ufcllOO mL. Il superamento di questi valori indica insufficiente sterilizzazione del vino, dell'impianto odei materiali, ed impone una revisione accurata delle procedure adottate.

S.2_Vino filtrato o pasteurizzato in bottiglia

Un vino contenente ancora zuccheri è suscettibile di rifermentazione se contiene cellule di lievito vive. Anche se accuratamente filtrato prima dell'imbottigliamento, il rischio di permanenza di qualche cellula viva e di sviluppo conformazione di gas è forte. Per questo motivo, i vini dolci imbottigliati (fermio frizzanti) sono generalmente pasteurizzati.Il trattamento a caldo di vini contenenti zuccheri presenta qualche problemalegato alla caramellizzazione e al conferimento di sapore di cotto, cosicchéspesso si preferisce non alzare la temperatura oltre i 55°C aumentando iltempo di esposizione.

Conteggio dei lieviti

Il controllo dell'assenza di cellule di lievito vive rassicura sulla stabilità delprodotto; è opportuno che il vino sottoposto a pasteurizzazione sia messo aconfronto con un vino dello stesso lotto prima del trattamento.

Campionamento

Da una vasca o da un'autoclave di 200 ettolitri si ottengono poco più di25.000 bottiglie. Queste vengono poste su nastro trasportatore e attraversano il tunnel nel quale subiscono il trattamento a caldo. I campioni da esaminare devono essere prelevati con gli stessi criteri e in uguale numero all'ingresso e all'uscita del pasteurizzatore. In un caso come quello ipotizzato ilnumero minimo di campioni da sottoporre ad analisi è lO. È bene che illoro prelevamento non sia casuale.

<vini dolci

<campioni

SI CONSIGLIA DI'PROCEDERE COME SEGUE:

..., prelevare un campione fra le prime 100 bottiglie;

..., prelevare un campione fra le ultime 100 bottiglie;

..., prelevare 8 campioni a intervalli regolari fra le prime e le ultime bottiglie.

CON QUESTO CRITERIO DI CAMPIONAMENTO SI STABILISCE:

1. se ci sia e, in caso positivo, quale sia l'entità di presenza di cellule di lievito nel vino prima del trattamento;2. se il trattamento termico è stato efficace.

105 Il Il

_______ 1 105

<carico microbico

I risultati ottenibili, tuttavia, non sono del tutto rassicuranti soprattutto acausa dell'esiguità del numero dei campioni rispetto al totale delle unità.Per avere risultati più sicuri può essere consigliabile immettere nel lotto alcune bottiglie con un carico microbico modesto, ma noto e verificare poi lostato del prodotto dopo la pasteurizzazione. Alcune bottiglie (in ipotesi, lObottiglie), già riempite del vino, vengono inoculate con 1 mL di sospensione di Saccharomyces cerevisiae contente circa 50 cellule. È bene impiegare lostesso ceppo usato per la precedente fermentazione o rifermentazione.Cinque delle lO bottiglie vengono subito sottoposte a determinazione delcarico microbico iniziale, le rimanenti cinque vengono immesse sulla lineadi pasteurizzazione a intervalli regolari; queste ultime devono essere reseimmediatamente e sicuramente riconoscibili. Al termine della pasteurizzazione, sulle cinque bottiglie di controllo si determina il carico microbicototale: i lieviti devono essere assenti.I risultati più attendibili si ottengono applicando entrambi i criteri ora descritti: determinare il carico microbico sul vino non inoculato (5 campioni primae 5 dopo il trattamento) ed eseguire anche i controlli sui vini inoculati con 50cellule per bottiglie. Se tutti i campioni pasteurizzati danno carico microbicouguale a zero, si può avere la ragionevole certezza che l'intero lotto non èsuscettibile di subire fermentazione alcuna.


., Apparato di filtrazione con griglia porosa di 50 mm di diametro; vasca superiore di 1 litro di capacità, sterilizzata.

., Lampada di Bunsen.

., Membrane porose di forma sferica, diametro 47 o 50 J..Lm e porosità di 0.45 o 0.22 J..Lm.

., Pinze di acciaio.

., Piastre di 6 cm di diametro sterilizzate. Eventualmente piastre pronte monouso contenenti un tampone assorbente impregnato di terreno disidratato, da reidratare con 2-3 mL di acqua sterile immediatamente prima dell'uso.., Terreno nutritivo idoneo, 10 mL in normali provette da laboratorio.

Procedimento

., Le bottiglie prelevate dalla linea di imbottigliamento o dalla catena di pasteurizzazione, etichettate e numeratesono portate in laboratorio.., Le singole bottiglie sono aperte (eventualmente con levatappi) dopo averne passato alla fiamma l'imboccatura.., L'intero contenuto della bottiglia è versato nel contenitore dell'apparato filtrante e si filtra.., Con le pinze sterilizzate alla fiamma si solleva la membrana porosa e la si deposita dentro la piastra contenenteil terreno di coltura.., Si versa il terreno sulla membrana porosa.., Le piastre sono incubate in termostato a 25°C.., Dopo 2-3 giorni si esegue il conteggio delle colonie sviluppate in piastra.

Risultati attesi

Nelle piastre relative ai vini, soprattutto quelli dolci, non devono essere presenti colonie. Queste possono esserci nel vino non ancora pasteurizzato e certamente nel vino inoculato (controlli). Se sui filtri ottenuti da vinopasteurizzato sviluppa qualche colonia di lievito, è bene accertare innanzitutto se questo è o non è dotato diattività fermentativa; infatti, non è da escludere la possibilità di inquinamento ambientale durante la fase di filtrazione. Tuttavia è bene tenere bloccata una partita di vino dolce che può contenere lieviti finché non si è assolutamente sicuri che tutti i casi di contaminazione siano dovuti a lieviti non fermentativi. Così come sono entrati questi, ne possono essere entrati, o sopravvissuti, altri dotati di capacità di fermentazione, con effetti drammatici sulla partita di vino in oggetto.

Il Il 106


Conteggio dei batteri lattici

Un vino che abbia subito solamente la fermentazione alcolica e che non contenga più zuccheri (esosi) utilizzabili da parte dei lieviti, è ancora suscettibile di fermentazione malolattica. Per effetto dello sviluppo di batteri si haintorbidamento con formazione di anidride carbonica che compromette laqualità commerciale del prodotto. È per questo motivo che in molte cantine si sottopone il vino ad accurata filtrazione ed anche a pasteurizzazionedopo imbottigliamento. È ovvio che il problema non si presenta per queivini la cui tecnologia di produzione preveda l'innesco della fermentazionemalolattica prima dell'imbottigliamento.Le analisi microbiologiche dei batteri lattici vengono eseguite quando lecaratteristiche chimiche del vino sono tali da consentirne lo sviluppo: in particolare, quando il pH è superiore al valore di 3.3 e l'anidride solforosa, perscelta tecnica, è presente a bassa concentrazione.

<fermentazione

malolattica

Procedimento

Il materiale, gli attrezzi necessari ed il procedimento da seguire sono gli stessi già descritti per la ricerca dei lieviti. Quella che cambia è soltanto l'ultima fase: è necessario impiegare un mezzo nutritivo adatto allo sviluppodi Oenococcus oeni e incubare le piastre in giare per anaerobiosi. Le colonie che, eventualmente, sviluppanovanno sottoposte ad esame microscopico per determinare che si tratta effettivamente di batteri e per accertarnela morfologia cellulare.Per quanto riguarda la rilevazione dei batteri lattici si rimanda a pagina 102.

107 Il Il

06 Analisi microbiologichedi coadiuvanti enologici

<

lieviti secchi attivi

<L5A

6.1_Analisi microbiologiche del lievito disidratato (L5A)

Il numero totale di cellule di lievito per grammo di prodotto è molto elevato, nell'ordine delle decine di miliardi di cellule per grammo di prodotto; tuttavia, per la modalità stessa della preparazione (soprattutto dell'essiccamento)il numero di cellule vive può essere più basso. Inoltre, durante la lavorazionesi verificano numerose occasioni di inquinamento sia di lieviti estranei che divari batteri. Per questi motivi, sui lieviti secchi attivi vengono eseguitedifferenti analisi microbiologiche al fine di determinare:• il numero di cellule di lievito vive per grammo di prodotto;• il numero di cellule batteriche inquinanti per grammo di prodotto.

Conteggio dei lieviti

I preparati commerciali di lievito disidratato (Lievito Secco Attivo = LSA)hanno aspetto più o meno finemente granulare e sono costituiti, in teoria,solo da cellule di lievito.

~ateriali e attrezzature

-, Bilancia analitica.-, Spatola metallica.-, Vaschette di plastica per pesata.-, Matraccio tarato da 100 mL sterilizzato.-, Matracci conici contenenti soluzione fisiologica sterilizzata.-, Beker di vetro da 200 cm3 sterilizzato a secco.-, Bacchette e pestelli di vetro.-, Bottiglia di etanolo e batuffoli di cotone idrofilo.-, Batteria di provette contenenti 9 mL di soluzione fisiologica sterilizzata.

Il Il 108


o Pipette da 1 mL sterilizzate.o Contaglobuli e microscopio.o Piastre di 10 cm di diametro sterilizzate.o Terreno nutritivo per Saccharomyces cerevisiae (quale l'VPD) sterilizzato in provette.

Procedimento

o Aprire la confezione del preparato commerciale.o Prelevare 10 g e parli in sacchetto da "stomacher". Aggiungere 90 mL di acqua o soluzione fisiologica a 37°C.o Sciogliere i grumi con le mani e poi agitare per 30 secondi in omogeneizzatore a pale tipo"stomacher" .o Immergere il sacchetto per 10-15 minuti in bagno termostatico a 37°C.o Ripetere l'agitazione per 60 secondi e immergere a 37°C per altri 10-15 minuti, poi ripetere l'agitazione per 60secondi.o Agitare molto bene la sospensione e diluire progressivamente fino a 10-9.

o Eseguire conteggi diretti al contaglobuli, sulla diluizione 10-3, e determinare il carico totale di cellule di lieviti.o Eseguire semine in piastra su terreno per lieviti, su agar Iisina e su terreno per batteri lattici, delle diluizioni concarico totale di circa 1000 cellule, circa 100 cellule, circa 10 cellule.o Incubare le piastre in termostato a 25°C ed esaminare dopo 2-4 giorni, contando le colonie relative alle diluizioniimpiegate.o Risalire al numero di cellule vive (unità facenti colonia) per grammo di prodotto.

Risultati attesi

Con questi conteggi si determina, oltre che il numero di cellule vive per grammo di prodotto, anche la percentuale dicellule vive rispetto al totale. Si ricorda che un buon preparato commerciale ha un numero di cellule vive di 20-30miliardi per grammo.

Conteggio dei batteri

La presenza di cellule batteriche nel L5A commerciale è normale, tantoche la legislazione non ne pone limiti precisi (devono però essere assentibatteri patogeni e loro tossine, coliformi, srreptococchi fecali e clostridisolfìto-riduttori in 0.1 g di prodotto), mentre l'OIV richiede che il tenore in batteri totali sia inferiore a 105 ufclg. I batteri contaminanti nonsono riferibili ad un gruppo ben preciso e sono rappresentati da unamiscellanea di specie differenti, tra le quali dominano i batteri lattici. Essisono comunque minoritari rispetto ai lieviti ed il loro conteggio è possibile soltanto se il terreno è tale da non consentire lo sviluppo dei lieviti. Perquesto motivo il terreno, generalmente il PCA (Plate Count Agar), perconta totale, o un terreno per batteri lattici, deve essere addizionato disorbato di potassio ad alta concentrazione (l grammo per litro) oppurecicloesimide (0.1 g/L).

<batteri totali

<peA

r:~::-=:==:=::==:=::~-===:==:===~=====~=:===~::::==::= :::=:==::::::::::~~::=:::::==:~~::~~:=:=~~:=:=:=::::::::=:=::::::----------------------------...._...._._----.-_.-_._.--._-------_._------_._._-----_._.__._._----------_.__.---------_._-----------------.--------.----_._._------_._------_._----_....._---------_._-----

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-- 1 106

Materiali, attrezzature e procedimento

Per il conteggio dei batteri si possono usare le stesse serie di diluizioni impiegate per il conteggio dei lieviti.Tuttavia, considerato che il numero di cellule batteriche è basso, la semina in piastra va fatta con le diluizioni da10-2 a 10-4. Le piastre vanno incubate a 25°C evanno esaminate dopo 2-4 giorni. Per avere conferma che le colonie sono di batteri (e non di lieviti soprawissuti), è necessario eseguire esami microscopici. Una volta contate lecolonie, si risale al numero di unità facenti colonia (ufc) per grammo di prodotto.

6.2_Analisi microbiologicadel Mosto Concentrato Rettificato (MCR)

<MCR

<acidi malico, tartarico

<lieviti osmotolleranti

Il mosto concentrato rettificato è un prodotto ottenuto per disidratazione delmosto, che viene poi fatto passare attraverso resine a scambio ionico che trattengono tutte le molecole organiche ed inorganiche dotate di carica elettrica.In pratica rimane solo lo zucchero dell'uva.LMCR ha un elevato contenuto in zuccheri dell'uva (glucosio e fruttosio),a livello di circa 680-730 g/l, ed una limitata presenza di tutti gli altri componenti del mosto. Il restante 30% è acqua. Esso è sostitutivo del mostoconcentrato nel quale, oltre agli zuccheri, vengono concentrati anche gliacidi malico e tartarico ed altri composti. Il suo valore di pH, per leggedeve essere inferiore a 5.0, ma solitamente i valori di pH dei mosti concentrati rettificati che si trovano in commercio oscillano fra 3.1 e 3.6. LMCRtrova numerosi impieghi nel settore enologico, soprattutto per dolcificare ivini secchi destinati a rifermentazione e per aumentare il grado alcolico divini un po' deboli in questo senso.LMCR, pur avendo una composizione nettamente squilibrata e pur essendopovero di alcuni nutrienti, consente lo sviluppo di numerosi microrganismi.Questi possono essere costituiti da lieviti (fermentanti e non fermentanti) eda batteri riferibili a diversi gruppi. Si tratta di microrganismi che, per la maggior parte, non hanno poi capacità di sviluppare nei mosti e nei vini perchéinibiti dal basso valore di pH di questi ultimi o per l'assenza di aria.La flora che contamina l'MCR è quella tipica dei prodotti ad alta concentrazione zuccherina, essenzialmente costituita da lieviti osmotolleranti: quellidi interesse enologico appartengono ai generi Zygosaccharomyces,Schizosaccharomyces, Candida, Pichia, ecc. All'inizio degli anni '80 è statosegnalato il rischio dell'abbattimento del contenuto di acido malico nei vinidovuto a contaminazione dell'MCR, utilizzato per l'arricchimento, daSchizosaccharomyces spp. Questo lievito osmotollerante potrebbe sopravviveree moltiplicarsi nell'MCR per poi continuare a crescere, dopo l'arricchimento, nel mosto in fermentazione, dove potrebbe consumare anche tutto l'acido malico. Poiché comunque la quantità di MCR aggiunto non supera mai1'1-2% rispetto al mosto in fermentazione, di regola la contaminazione chene deriva non è rilevante, soprattutto perché la velocità di moltiplicazione diSchizosaccharomyces pombe è piuttosto bassa.

Il 11110


La determinazione del carico microbico dell'MCR ha tuttavia importanzaperché rivela 1'accuratezza della sua produzione e della sua conservazione.


.., Gli stessi impiegati per il controllo microbiologico dei vini, ed in più:- recipiente sterile della capacità di almeno 1 litro;- acqua distillata sterile;- bilancia tecnica.

Procedimento

.., Porre il recipiente sterile sulla bilancia ed azzerare la tara.

.., Versare 100 9 di MCR.

.., Portare a 1000 9 con acqua sterile.

.., Agitare per disciogliere bene l'MCR.

.., Inoculare una piastra con 1 mL di questa soluzione (10-1 9 MCR).

.., Filtrare 10 mL su membrana da 0,45 (o 0,22) Ilm e depositare la membrana su una piastra di terreno colturale(1 9 MCR)..., Filtrare 100 mL su membrana da 0,45 (o 0,22) Ilm e depositare la membrana su una piastra di terreno colturale(101 9 MCR)..., Filtrare il restante volume di liquido su membrana da 0,45 (o 0,22) Ilm e depositare la membrana su una piastradi terreno colturale.

ApPROFONDIMENTO 1> Espressione dei risultati nei conteggi di microrganismi

CONTEGGIO DELLE COLONIE

Contare le colonie sviluppate dopo 4 giorni di incubazione a 25 ± 1°C, se necessario con l'ausilio di apparecchioo di penna contacolonie, valutando separatamente, se è il caso, la diversa morfologia delle colonie.Contare le colonie che hanno le caratteristiche ricercate, verificare al microscopio che appartengano alla categoriadi microrganismi di interesse (lieviti o batteri; gram+ o gram-; catalasi+ o catalasi-...).Il risultato più attendibile è quello calcolato da piastre che contengono un numero totale di colonie compreso fra15 e 300 (vedi l'incertezza della misura).Se esistono almeno una o due piastre, a parità di diluizione, in cui si sono sviluppate colonie, calcolare la mediaaritmetica del numero di colonie contate e moltiplicarla per l'inverso del fattore di diluizione per ottenere il numero di ufclml (ISO 7218: 1996, Microbiology of food and animaI feeding stuff - GeneraI rules for microbiologicalexaminations).Se si trovano piastre contenenti 15-300 colonie in due diluizioni consecutive, calcolare il numero di ufclmL indipendentemente da ogni diluizione, e poi la media dei valori trovati: questo è il valore di ufclml del campione. Se uno deidue valori è maggiore del doppio dell'altro riportare come ufclmL il valore inferiore. Se su tutte le piastre sono cresciute più di 300 colonie, contare quelle dove sono in numero minore ed esprimere il risultato come ufc stimate per ml.Se vi sono meno di 10 colonie/cm"" contare quelle presenti in 12 quadrati di lato 1 cm e risalire a quelle presenti su

111 Il Il

-- 1 106

tutta la piastra; se sono di più, contare quelle presenti in 4 quadrati di lato 1 cm; esprimere il risultato come ufc stimate per mL.Se su tutte le piastre sono cresciute meno di 15 colonie, contare quelle dove sono in numero maggiore ed esprimereil risultato come ufc stimate per mL.Se non sono cresciute colonie esprimere il risultato come "meno di", oppure "inferiori a", seguito dal fattore didiluizione, ma considerare la necessità di ricercare la presenza di sostanze inibitrici nel campione.Se porzioni di piastra sono incontabili e vi sono meno di 10 colonie/cm2, contare quelle presenti in 12 quadrati dilato 1 cm e risalire a quelle presenti su tutta la piastra, se sono di più, contare quelle presenti in 4 quadrati di lato1 cm; esprimere il risultato come ufc stimate per mL.Nell'espressione dei risultati, considerare solamente due cifre significative.

ApPROFONDIMENTO 2> L'incertezza della misura

CRITERI DI CONTROLLO DEI RISULTATI

Quando si esegue un'analisi microbiologica è opportuno anche avere nozione del grado di accuratezza edi precisione del risultato che si ottiene. la quantità di campione depositato sulla superficie di un terreno di coltura, oppure inun vetrino contaglobuli, è diluita anche svariati milioni di volte rispetto al campione di partenza, il quale a sua voltapuò essere una parte milionesima della massa in analisi. Quando si è contato un certo numero di colonie cresciutein una piastra, per risalire alla concentrazione di ufc presenti nel campione bisogna moltiplicare questo numero permilioni di volte, ma bisogna tenere presente che così facendo si moltiplica per milioni di volte anche l'errore analitico. Precisiamo: per errore analitico non si intende uno sbaglio dell'analista, ma !'insieme di tutti i fattori casuali edimponderabili che determinano un allontanamento del risultato ottenuto dal valore "vero", che resta sempre incognito. Nessuno, nemmeno il migliore dei laboratoristi può ottenere un risultato "vero" da un'analisi, ma solo lamigliore stima di questo valore.In pratica, la distribuzione dell'errore di conteggio è stata stimata ed esistono delle procedure che associano, adogni numero di colonie contato, il suo intervallo di confidenza al 95%, ossia indicano !'intervallo in cui cadono per95 volte i valori ottenuti se si ripete quella conta per 100 volte (intendendo per conta tutte le operazioni analiticheeseguite a partire dal campione, non solo il conteggio delle colonie presenti nella piastra).Per ogni lotto di terreno colturale preparato, una piastra è impiegata per il controllo di sterilità dopo autoclave.Durante l'esecuzione delle prove una piastra viene lasciata aperta sotto cappa a flusso laminare per controllare lasterilità dell'ambiente di lavoro. la piastra verrà incubata assieme a quelle dei campioni sottoposti a prova.Ogni 10 campioni, uno viene analizzato in doppio. Sulla base dei risultati si calcola il valore Kp sperimentalemediante la seguente equazione:

Kp= IC,-C2 1

~C, +C2

dove C, e C2 sono i valori dei due conteggi in parallelo.""Se Kp < 1,96"" 2,0 i conteggi sono accettabili ed è possibile esprimere il risultato come media delle due prove.Se 2,0 < Kp $; 2,576 "" 2,6 la differenza fra i due conteggi è critica e meritevole di approfondimento prima diesprimere il risultato come media delle due prove.Se Kp > 2,6 la differenza fra i due conteggi è anomala; le prove in parallelo non si considerano valide e devonoessere ripetute.

Il 11112


In quest'ultimo caso è necessario valutare tutti i dati relativi alle prove eseguite dopo l'ultima volta che i risultatierano stati accettati.Ogni 10 campioni in cui ci sia sviluppo di colonie nelle piastre ottenute da due diluizioni successive, si verifical'accettabilità dei valori numerici ottenuti secondo la seguente formula per il "controllo di risultati ottenuti comecombinazione di valori riscontrati a diversi livelli di diluizione del campione":

[ [m J]LC

2 m C· m i-l I 2Xs = 2· L(Ci In-'-) -(Lci)ln ~ ::; X v

'P 1=1 I?; 1=1 LI?; p.

i=1

dove:In è la funzione logaritmo naturale, m è il numero dei livelli di diluizione considerati, Ci e Ri sono, rispettivamente, il valore totale dei conteggi e il rapporto di diluizione al livello i. Il valore della variabile X2 p, v si trovanella seguente tabella per p pari a 0.95 ev = m-l.Distribuzione della probabilità, p, per la variabile X2•

N X2 P = 0.95

1 2.8412 5.9913 7.8154 9.4885 11.0716 12.5927 14.0678 15.5079 16.91910 18.30711 19.67512 21.026 .13 22.36214 23.68515 24.99616 26.29617 27.58718 28.86919 30.14420 31.410

Espressione dell'incertezza di misura

Se il numero di colonie da cui si determina la carica microbica è inferiore a 15, il risultato è comunque valido,ma si considera che la popolazione contata segua la distribuzione di Poisson. L'intervallo di confidenza a livello

1131111

_______ 1 106

di probabilità del 95%, e quindi l'incertezza di misura, del conteggio effettuato su una piastra Petri è indicatonella seguente Tabella (ISO 7218: 1996, Microbiology of food and animaI feeding stuff - GeneraI rules for microbiological examinations).

Num. Colonie limite di confidenza 95% Scarto percentuale*

Inferiore Superiore Inferiore Superiore

1 <1 6 -97 4572 <1 7 -88 2613 <1 9 -79 1924 1 10 -73 1565 2 12 -68 1336 2 13 -63 1187 3 14 -60 1068 3 16 -57 979 4 17 -54 9010 5 18 -52 8411 6 20 -50 7912 6 21 -48 7513 7 22 -47 7114 8 24 -45 6815 8 25 -44 65

• riferito al num. Colonie.

Quando il conteggio delle colonie dà risultati>15, l'intervallo di confidenza a livello di probabilità pari a p si calcolacon la seguente equazione:

C=Ci ± Kp..JCi

dove Ci è il numero di colonie nella piastra e Kp è il fattore di copertura. Salvo eccezioni, il fattore di coperturauniversalmente adottato è 2 (Criteri di accettabilità dei risultati nelle prove microbiologiche - Esempi pratici.UNICHIM, 1999).

Il 11114

I I I •Indice analitico e delle parole chiave

o Accessori utili 12 o Batteri tossigeni 3 c> Ciclo di sterilizzazione 16o Acetato di etile 86 c> Batteri totali 109 c> Cicloesimide 100o Acido acetico 27,86 c> Batteri virtuosi 3 c> Coadiuvanti enologici 108o Acido malico 110 c> BiGGY: terreno solido 93 o Colimetria 75o Acido tartarico 110 c> Binoculare 21 o Collezioni di servizio 51o Acini: analisi 95 o Birra (controllo o Colonie 47

o Acqua 75 microbiologico) 26 - singole 50

- peptonata 37 o Birre "Lager" 81 o Colture non riconoscibili 86

- corsi d'acqua 75 c> Blastomiceti 44 c> Coltu~e pure 45

- di mare 76 c> Brettanomyces 62 c> Colture sporificate 80

- potabile 75 c> Brettanomyces-genere 85 c> Colture: caratterizzazione 87

c> Agar-acetato 27 c> Brodi nutritivi 16 c> Comitato Esecutivo 7o Agar-lisina 27 c> Calore secco 39 o Comitato

o Agitatori a vortice 22 o Campionamento 61, 104 Tecnico Scientifico 7

o Agitatori orbitali 22 c> Campione 63c> Comportamento

o Alcol-tolleranza 84, 88, 90 c> Campioni 105in laboratorio lO

o Ambiente saturo c> Campioni:c> Composti azotati 25,30,33

di vapore 16 trasportolconservazione 63c> Composti

o Ambiente sterile 18 c> Capacità di flocculazione 90del carbonio 25, 30, 32

o Analisi di processo 59 c> Capacità fermentativa 87-91c> Composti solforati 92

o Analisi di prodotto finito 59 c> Capacità schiumogena 90c> Concentrazione

o Anidride carbonica 89 o Cappa a flusso laminare 18campIOne 71

o Anidride solforosa 92 o Cappe "biohazard" 19c> Congelatore 14

o Antibiotici 30 o Caricoc> Conservazione 14, 50

o Apparato filtrante 15 microbico 57,58,60,105c> Conta su piastra 101

o Aria: analisi c> Carico microbico totale 68c> Contaglobuli Biirker 66

microbiologica 72 c> Carne 75c> Contaglobuli Thoma 67

o Aschi 80 c> Carposfera: analisi 96c> Contaminanti casuali 97

o Ascomiceti 79 c> Catalasi 100c> Contaminazione casuale 94

o ATCC-U.5.A. 51 c> CBS-Olanda 51c> Conteggi diretti 58

o Attività fermentativa 54 o Cellule microbiche 57c> Conteggi: espressione

o Autoclave 16,38 c> Cellule: 69dei risultati 111

- a parete doppia 16 - vitali 69c> Conteggio colonie 111

- a parete singola 16 - vive 69c> Conteggio diretto 66

c> Azione microbicida 41 c> Centrifuga 15 c> Conteggio indiretto 69o Barrique . 62 c> Centrifugazione 71 c> Conteggio su piastra 58o Basidiomiceti 79 c> Ceppi di riferimento 93 c> Conteggio totale 36

o Batteri 3,48 c> Ceppi microbici 50 c> Contrasto di fase 13

- acetici 32 o Ceppi: caratterizzazione 93 c> Controlli microbiologici 14

- alteranti 3 c> Ceppo 45 o Controllo mosto:

- lattici 30, 100 microbico 51 non in fermentazione 100- lattici: conteggio 106 c> Chiarificazione c> Controllo qualità 5

o Batteri patogeni 3 di campioni 15 c> Cucina 12,16

115 Il Il

I I

o Curve di sviluppo 54 o Ingrandimenti 12 pulcherrima 82o D BVPG-Perugia 51 o Inoculi 5 o Mezzi di arricchimento 36

o Dekkera-genere 85 o Inoculo: entità 89 o Mezzi nutritivi 23

o Deuteromiceti-ex 79 o Inquinamento microbico 62 o Mezzi nutritivi:

o Diluenti 36 o Insetti 97compOSIZiOne 23

o Diluizione campioni 64 olSO 8 o Mezzi nutritivi: impiego 24

o Diluizione del campione 69 o ISO-7218 70 o Mezzi nutritivi:

o Diluizioni seriali 22 o ISO-7218 114 stato fisico 23o Mezzo di Sabouraud 25

o Distribuzione dell'errore 112 o Isolamento 46,49 o Mezzo di Wickerham 28o DNA 78 di Lattobacilli 32 o Mezzo sintetico 28o Doppio prelievo 63

o Isolato 51o MezzoYPG 26

o DSMZ-Germania 51o Kloeckera apiculata 81o Kurtzman e Fell: o Microbi alteranti 5

o Duradilità commerciale 74 classificazione 91 o Microbi indicatori 5o E.C. Broth 35 o Lampada ad alcol 49 o Microbi nocivi 5o Enterobatteri 34o Epilluminazione 21 o Lampada UV 20 o Microbi utili 6

o Errore analitico 112o Latte 75 o Microbiota 46,94

o Esame di intera colonia 49o Legge 626/94 lO o Microrganismi 2o Lieviti 48 - diversi 60

o Esame microscopico o Lieviti 78 36a fresco 47 - genencl

o Escherichia coli 34- apiculati 81 o Microscopio a- dominanti 102 epifluorescenza 20

o Estratti 25 - ellittici 84 o Microscopio ottico 12o Etanolo e microrganismi 4 - enologici 79 o Moltiplicazione 45o Fecce: analisi - osmotolleranti 110

microbiologica 102 - secchi attivio Mosti 60

o Fermentazione18 o Mosto 99

malolattica 106o Lieviti: caratterizzazione 78 - concentrato rettificato 110

o Fermentazione: o Lieviti: classificazione 78 - in fermentazione 64composti secondari 92 o Lieviti: identificazione 78 o Mosto: carica batterica

o Fillosfera e carposfera 97 o Logaritmo totale 102

o Filtrazione 39, 71naturale - funzione 113 o Mosto: controllo 99

o Fioretta dei vini 82o Lotto 63 o Mosto: terreni di coltura 99

o Forma disidratata 24oLSA 108 o Mutazioni 40

o Forno microonde 14 o MacConkey Sorbitol agar 35 o Obiettivi 12

o Frigorifero 14 o Malto (YM) 26 o Oculari 12

o Giare per anaerobiosi 30 o Mantenimento 32 oON 6

o Gorodkowa 29 o Mantenimento collezioni 52 o Olio di paraffma 89

o Grappoli: analisi 96 o Materiali "usa e gettà' 22 o Omogeneità 62

oHACCP 5 o Materie prime 2 o Pasteur 41

o Idrogeno solforato 29, 92 oMCR 60, 110 o Pasteurizzatori 42o Igiene alimentare 63 o Metodi interni 6 o Pasteurizzazione 41, 58o Illuminatore 22 o Metodi microscopici 101 oPCA 109

o Imbottigliatrice 104 o Metodi ufficiali 6 o Piano di campionamento 62o Impianti di servizio 11 o Metodo Castelli 88 o Piano di lavoro 19o Incertezza della misura 112 o Metodo diretto 66 o Piastrella nera 48o Inferenza 61 o Metodo integrale 90 o Piccoli volumi 40o Infissioni 50 o Metschnikowia o Pichia anomala 86

Il Il 116

I I I •ò Pichia membranifaciens 82 ò Sistema HACCP 74 ò Terreno all'etanolo 33ò Pigiatura dell'uva 97 ò Smalto per unghie 48 o Terreno ATB 31ò Plate Count Agar 36 ò Soluzione fisiologica 37 ò Terreno BiGGY 29ò Politermostato ò Sostanze intercalanti 21 o Terreno diò Pompe aspiranti 15 o Sostanze tampone 25 Lafon-Lafourcadeò Pompe da vuoto 15 ò Specie marginali 102 e ]oyeux 34ò Potere fermentativo 90 ò Spore batteriche 41 ò Terreno di Weillerò Prelievo dei campioni 61 o Sporificazione 27,29 e Radler 31ò Preparazione campioni 64 o Spumantizzazione 36 ò Terreno GYC 33ò Pressioni meccaniche 41 o Stabilità commerciale 60 ò Terreno MRS 32ò Probabilità-distribuzione 113 o Stati membri 6 o TerreQo per enterobatteri 34ò Prodotti alimentari 76 ò Stato di moltiplicazione 44 ò Terreno per Leuconostocò Prodotti commerciali 24 ò Stato di quiescenza 44 oenos 31ò Prodotti di o Sterilizzazione 17,38 o Terreno selettivo 46

fermentazione 54,56 - a freddo 14 o Terreno SL 32ò Prodotti enologici 76 - chimica 40 o Tindalizzazione 39ò Prodotti orticoli 76 ò Sterilizzazione: ò Tipologie di cappa 19ò Protezioni 20 preparazione dei materiali 17 o Torulaspora delbrueckii 84ò Pulizia e sanitizzazione 20 o Strisci 50 o Trapianto colture 52ò Pulviscolo atmosferico 72 o Stufa 38 ò Trasferimento 50ò Radiazioni ionizzanti 40 o Succo d'uva 86 ò Tubo di Durham 88ò Raggixey 40 o Superfici:

o Type Strain 51ò Registro 48, 52 analisi microbiologica 73 ò Ufclg 58ò Ribosomi-subunità 16S 78 o Sviluppo 53

ò UfclmL 58ò Ricerca: batteri acetici 101 - flocculento 58

ò Ultravioletti (UV) 41ò Ricerca: batteri lattici 101 -lento 53

ò Ricerca: lieviti - rallentato 53 ò UNI-ISO 2859 63101

ò Sviluppo: ò Unità facentiò Ricombinazione genica 45ò Rifermentazione 84,87

fase iniziale/latente 53 colonia (ufc) 58,69

ò Rimontaggio 62ò Sviluppo: fase logaritmica 53 ò Uva danneggiata 97

ò Riscaldamento rapido 14o Sviluppo: fase stazionaria 53 ò Uva sana 94ò Sviluppo: ò Uva: analisi 94ò Saccarosio 110 morte incipiente 54

ò Saccharomyces cerevisiae 80 o Sviluppo:ò Uva: microrganismi 94

ò Saccharomyces morte logaritmica 54 ò Valore stimato 70

- freddofermentanti o Tappo di cotone grezzo 39 ò Valvola di Milller 88/criotolleranti 81 ò Temperatura 64 òVBNC 58

ò Saccharomycodes ottimale 91 o Vetreria 22ludwigii 82

ò Temperature 13 o Vigore fermentativo 88, 89ò Sali minerali 25, 30, 33

o Tempo di generazione 44 O Vini 60ò Scala logaritmica 55

ò Tensioattività 91 - dolci 105ò Schizosaccharomyces

ò Termostati 13o Vino 59

japonicus 82ò Schizosaccharomyces o Terreni 24 o Vino in bottiglia: analisi 104

pombe 82 - di coltura specifici 100 o Violet Red Bile Agar 35

ò Shelf-life 74 - non selettivi 24 ò Vitamine 25, 30, 33

ò Sicurezza lO - selettivi 24 o WL Nutrient Medium 26ò Sistema di filtrazione 14 o Terreno al mannitolo 34 Zygosaccharomyces spp. 84

117 Il Il

______ 11

Bibliografia

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Cavazza A. e Poznanski E. (1998) - Le analisi microbiologiche nel laboratorio enologico. Vignevini 61998: 42-53.

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Zambonelli C, Tini V. e\Castellari L. (2000) - Guida all'uso dei lieviti selezionati in enologia. CalderiniEdagricole, Bologna.

Il 11118

· ndice iconograficaAppe

Le pagine che seguono sono dedicate all'Appendice iconografica che si sviluppada pagina 119 a pagina 134.

In essa è proposta una serie di illustrazioni fotografiche a corredo del testoche rappresentano un ulteriore approfondimento o sottolineatura di quantoesposto nei capitoli precedenti.

Nello sviluppo della trattazione dell'Opera, è stato utilizzato un elementografico posto a margine del testo per segnalare il riferimento alle illustrazionidisponibili in Appendice sul!'argomento trattato.Questo elemento riporta il numero progressivo dell'immagine (foto o grafico) e il riferimento alla pagina dell'Appendice iconografica dove la stessa èproposta (vedi esempio).

Nell'Appendice iconografica, invece, lo stesso elemento grafico, di coloreazzurro chiaro è collocato sotto o a fianco dell'illustrazione, indica sempre ilnumero progressivo della fotografia, ma anche il rimando alla pagina ditesto dove è trattato l'argomento. Ogni immagine è inoltre accompagnata dauna didascalia esplicativa.In questo modo la lettura e lo studio dell'Opera risultano più gradevoli e alcontempo è resa più efficace la comprensione degli argomenti trattati.

119 Il Il

Tavole illustrative

La conversione del mosto invino è dovuta alla trasformazione dello zucchero in etanolo e anidride carbonica daparte dei lieviti enologici.

I campioni sottopostiad analisi pressolaboratori "terzi" ,cioè non appartenenti né al produttore néali'acquirente di unprodotto, vengonosempre resi anonimiprima dell'analisi.

Ègrazie allo sfruttamento dell'attività dimolteplici microrganismi utili che moltiprodotti alimentari di base (latte, uva,carne, ... ) vengono trasformati in prodotti derivati (latticini e formaggi, vini eaceti, insaccati, ...). Molti altri prodotti,invece, possono essere alterati e irrimediabilmente compromessi dali'attivitàmicrobica.

Analisi di controllo qualità: osservazione di colonieal microscopio binoculare. L'illuminatore a fibreottiche crea una luce radente che permette di evidenziare anche le colonie puntiformi e traslucide.

Il 120

Tavole illustrative

La zona di lavoro di un laboratoriodi analisi microbiologiche.

Rampa per filtrazione a sei postazioni (Pergentile concessione: Sartorius S.p.A).

Un microscopio ottico con visore e unmicroscopio binoculare su tavoloantivibrante.

Un'autoclave di ultima generazione non consentemanovre manuali una volta chiuso il coperchio eawiato il ciclo di sterilizzazione. La sterilizzazionedei materiali è una delle prime regole da osservareper procedere alle attività analitiche.

121 Il

Tavole illustrative

La cappa a flussolaminare verticale èuna delle strumentazioni essenziali pergarantire idonee condizioni di lavoro emassima sicurezza perl'operatore.

Cellule di lievito osservate al microscopio adepifluorescenza. Le cellule di colore verdesono vive, quelle arancione sono morte.

Il piano di lavoro di una cappa a flusso laminareverticale è forato, per permettere l'idoneo mantenimento del flusso d'aria dall'alto verso il basso.

Vetreria da laboratorio prima dellasterilizzazione.

\

Vetreria da laboratorio dopo lasterilizzazione.

Il 122

Tavole illustrative

Colonie di batteriacetici, circondateda alone trasparente, e di altri batteriin terreno selettivoGYc.

AI termine della sterilizzazione è necessario indossare sempre i guanti protettiviprima di estrarre il materiale.

Materiali e attrezzi manuali peranalisi da laboratorio, sono realizzati in materiali sterilizzabili allafiamma.

Membrana filtrante (diametro 5 cm)applicata in ambiente sterile (Per gentile concessione: Sartorius S.p.A).

Materiali di ultima generazione realizzati inplastica, sterilizzati all'origine e sigillati perun utilizzo monouso.

123 Il

Tavole illustrative

I preparati di lievito secco contengono cellule quiescenti in grado dimantenere la propia vitalità per 2-3anni. Quando vengono reidratate,per l'uso, innescano prontamente lafermentazione alcolica del mosto.

~....... - .~f.J --~-'~' ~

- - _..---

Coltura pura in provetta su terrenosolidificato e "becco di clarino".

a) L'aspetto delle colonie può essere piatto (a sinistra unacolonia di Kloeckera apiculata), a cupola (al centro unacolonia di Brettanomyces sp.), umbonata (a destra unacolonia di Saccharomyces cerevisiae).b) Due colonie rugose, di lieviti a metabolismo ossidativoresponsabili della formazione di fioretta nel vino.c) Colonie di Pichia membranifaciensfortemente ingrandite.

Una coltura pura siconserva in una provetta contenente unterreno solidificato inposizione inclinata.Nell'immagine,aspetto assunto dallecolture in fase di conservazione.

Per il conteggio delle colonie si puòutilizzare la penna contacolonia.

Il 124

Tavole illustrative

I numerosi ceppi di lieviti, appartenenti a specifiche collezioni di pro-

prietà dei laboratori o di provenien- '~~~~~~~)~~~~~1~~~~~1~;;'~~~za esterna, sono identificati ed .~~~~~~~JI~~ij;~~~t;Q~~I:~organizzati in appositi registri: i tceppi di lievito possono essere conservati a -80°C in YPG liquido con 1----...".;;.'-,:-;..:.-~~il 25% di glicerolo per diversi anni.

Uomo (6.000.000.000)TMammiferi

Animali

Attrezzatura per l'analisimicrobiologica dell'aria. Ilcontrollo microbiologico vaesteso anche agli ambientioperativi.

Verso la fine della fermentazione la concentrazione cellulare varia secondoun gradiente dall'alto verso il basso, sia nei recipienti da laboratorio, che neiserbatoi di grandi dimensioni. Il punto in cui si effettua il prelievo puòinfluenzare notevolmente il carico microbico del campione.

La conservazione per tempimedio-brevi, delle collezionidi lieviti può essere fatta infrigorifero a +4°, per garantire una bassa umidità dell'aria, che favorirebbe lo sviluppo di funghi xerofili(aspergilli) che inquinerebbero la coltura.

Nel grafico sono espressele dimensioni del genomadi diversi organismi. I lievitipossiedono molto più DNArispetto ai batteri e non èstata ancora individuatauna regione unica dellacatena su cui basare laclassificazione delle specie.

Lieviti (10.600.000) Piante

Escherichia coli,

(4.700.000) Funghi,MS2 CMV Batteri

(3.500) (280.000), ,Virus

102 103 104 105 106 107 108 109 1010 1011

125 Il

• Cellule di 5accharomyces=-~. cerevisiae viste al microsco~a;Iiij. pio ottico, in contrasto di fase.

Ingrandimento x 1.000.Le cellule hanno forma dasferica a ellittica.

l~il!!!! Ammasso di cellule di 5. cereIl :. visiae viste al Microscopio~Ja:.t:,j. Elettronico a Scansione (SEM)

x 1.000.

Cellula vecchia di 5. cerevisiaevista al SEM x 15.000.

I I Tavole illustrative

\

Coltura sporificata di 5. cerevisiae. Gli aschi hanno forma di .:lIlII!IIIr.r.'II.

tetrade e contengono tipica- "'iAil"'~~~~~mente 4 spore (v. frecce).Microscopio ottico in c.t.Ingrandimento x 1.000.

Il Il 126

Asco (senza parete) diHanseniaspora guilliermondi r:!t'!IIron.visto al 5EM e costituito da 4 ~..111~~~~~

spore. Ingrandimento x20.000.

Aschi con 4 spore diSaccharomycodes Ludwigii -::::=~costituiti da due cellule anco- _iil'.J,!~-.::=-~~

ra unite dopo la gemmazione.Microfotografia al 5EM.Ingrandimento x 10.000.

Tavole illustrative I I

rI~i.mfE: Cellule apiculate di Klockeraapiculata al microscopio ottico in c.t. Ingrandimento x1.000.

Cellule ellittiche diSaccharomycodes ludwigiial microscopio ottico.Ingrandimento x 1.000.

127 Il Il

I I Tavole illustrative

Cellule di Schizosaccharomycespombe al microscopio ottico inc.f. Ingrandimento x 1.000.Indicati dalle frecce si notano isetti tipici della moltiplicazioneper scissione.

Cellule di Pichia membranifaciens tipiche della fioretta,anche unite in pseudomiceli.Microscopio ottico in c.f.Ingrandimento x 1.000.

Il I 128

Cellule di Metschnikowia pulcherrima al microscopio ottico in c.f. Ingrandimento x1.000. Le cellule hanno diverse dimensioni; quelle piùgrandi e sferiche contengonouna grande goccia di olio.

Cellule di Schizosaccharomycespombe viste al SEM.Ingrandimento x 4.000.

Cellule di Zygosaccharomycesbai/ii viste al microscopio ottico in cf. Ingrandimento x1.000. Indicato dalla freccia èvisibile anche un asco.

Cellule di Brettanomyces(Dekkera) bruxellensis viste almicroscopio ottico in cf.Ingrandimento x 1.000.

Tavole illustrative I I

Cellule ellittiche diToru/aspora de/brueckii visteal microscopio ottico in cf.Ingrandimento x 1.000.

Asco di Zygosaccharomycesbai/ii visto al SEM.Ingrandimento x 15.000. L'ascoderiva dalla coniugazione didue cellule ciascuna delle qualicontiene due spore.

129 Il

Tavole illustrative

Colonie di Pichia anomala cresciute sui terreni WL NutrientAgar, Agar lisina eYM.

Colonie di Kloeckeraapiculata cresciutesu terreno WLNutrient Agar.

Colonie di Saccharomycescerevisiae cresciute sui terreni WL Nutrient Agar, Agarlisina (notare che in questoterreno non cresce) eYM.

Colonie'di Pichia membranifaciens cresciute sui terreni WL Nutrient Agar,Agar Iisina e YM.

Colonie di Schizosaccharomycespombe cresciute sui terreni WLNutrient Agar, Agar lisina eYM.

Il 130

Tavole illustrative

Diversi contenitori in fase di microvinificazione sperimentale per le relativeanalisi di laboratorio.

a) Le curve esprimono il vigore fermentativo di diversi ceppi in confronto con un ceppo di riferimento di comportamento noto. b) Le curve esprimono il livello di resistenza alla S02 di vari ceppiin confronto con un ceppo di riferimento a resistenza nota.

131 Il

Tavole illustrative

La perfetta maturazionedell'uva, garantita dacondizioni c1imaticopedologiche ottimali, eil buono stato sanitariodei grappoli, a seguitodi una corretta difesafitosanitaria, sono lecondizioni essenzialiper garantire un ottimale processo di fermentazione dei mosti. Foto a:grappolo di Pinot nero(fonte CRPV). Foto b:ottimale maturazionedel vitigno Albana.

Due esempi di degenerazione avanzata dellamateria prima conpressoché totale compromissione delle qualità organolettiche equalitative dell'uva.Foto a: danno procurato da infezione di oidio.Foto b: classica macerazione degenerativadovuta allo sviluppodella botrite.

Rifermentazione in bottigliacon lievito a cellule disperse.Dopo agitazione, il vino siintorbida uniformemente.

Rifermentazione in bottiglia conlievito flocculento. Dopo agitazione, si sollevano aggregati dicellule che non intorbidano ilvino.

Cellule di Oenococcus oeni sviluppate inmezzo sintetico viste al 5EM. Le cellulesono tutte sferiche, singole, a coppie o incatenelle, uniformi e molto piccole (diametro 0,3 /-lm).

Il Il 132

Tavole illustrative

Oenococcus oeni è il batteriolattico eterofermentativo cheprovoca la fermentazione malolattica dei vini, cioè la conversione dell'acido malico ad acidolattico e anidride carbonica.Occasionaimente, accanto a O.oeni possono sviluppare anchealtri batteri lattici qualiLactobacillus plantarum, Lb.brevis, Lb. rhamnosus.

Cellule a bastoncino diLartobacillus rhamnosus visteal SEM.

Cellule a bastoncino diLactobacillus brevis viste alSEM.

Cellule a bastoncino diLactobacillus plantarum visteal SEM.

Nell'analisi del vino contenuto nelle bottiglie,prelevate a campione dalla linea di imbottigliamento, tutto il contenuto della bottiglia deveessere versato nell'apparato filtrante e filtratoper poter verificare, successivamente, lo sviluppodi eventuali microrganismi partendo dalle celluletrattenute dalla membrana porosa (Per gentileconcessione dello Sartorius S.p.A).

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I I

Ringraziamenti

"Per i consigli, le collaborazioni, i materiali e le autorizzazioni concesse"

Gli Autori: ringraziano tutti i rispettivi colleghi e collaboratori che con i loro consigli, aiuti e materialiconcessi, hanno contribuito ad una migliore realizzazione di questo volume.

In particolare:- i colleghi e collaboratori della Facoltà di Agraria, sedi di Bologna e Reggio Emilia;- i colleghi e collaboratori, dei vari settori, dell'Istituto Agrario di San Michele All'Adige;- i colleghi e collaboratori del Centro di Assistenza Tecnologico in Enologia e Viticoltura, sede di Tebano

(Faenza).

Inoltre ringraziamo, per i materiali e le autorizzazioni all'utilizzo, i responsabili dell'azienda SartoriusS.p.A. Italia, Divisione Biotecnologie, Via dell'Antella 76/A, 50011 Antella, Bagno a Ripoli (FI)[email protected] - www.sartorius.it

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L'editore ringrazia tutti coloro che si sono prodigati per la buona riuscita dell'Opera.

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€ 17,00

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""""-'""'I,. da-..;copa ~~ GRATUITO, fuori""""""'*> (Yefda.1IIri1Oi~<iIpooizlone_:'"17,c. 2 L 433119411. EsonIe da I.VA (D.P.R 26-11)-1972, n. 633,ll1l 2, leII. di. EsonIe da idi ~~ (D.P.R. 6-111-1978, n. 627, 1lIt. a, n. 6).

ISBN 88-8361-084-9

1I1111111111111111111119 788883 610844 •

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