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Elucigene® QST*R-PL (Aborto spontaneo) Istruzioni per l'uso del test

AN6XYB1IT 001 Mag. 2016 Pagina 1 di 37

Elucigene® QST*R-PL (Aborto spontaneo)

Istruzioni per l’uso del test

Codice cat.: AN6XYB1 – 25 test

Per uso diagnostico in vitro

Prodotto da: Elucigene Diagnostics Citylabs Nelson Street Manchester M13 9NQ

Vendita, assistenza clienti e assistenza tecnica: Tel.: +44 (0) 161 669 8122 Fax: +44 (0) 161 669 8129 E-mail: [email protected] E-mail: [email protected] Elucigene Diagnostics è il nome commerciale di Delta Diagnostics (UK) Limited, una società iscritta in Inghilterra e nel Galles al numero di iscrizione 8696299.

mailto:[email protected]


http://www.google.co.uk/url?sa=i&rct=j&q=manufacturer+symbol&source=images&cd=&cad=rja&docid=U3rWzPbRU_MhlM&tbnid=d2g2sAmvROYNkM:&ved=0CAUQjRw&url=http://fertipro.com/index.php?page=qc&sub=labels&ei=-dEsUaC2HeXP0QWPmICwCw&bvm=bv.42965579,d.d2k&psig=AFQjCNE3Pcqxmlq_UWpSP6GwfI-gXiiGyA&ust=1361978229710742

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Elucigene QST*R-PL

Uso previsto

Per la diagnosi routinaria in vitro delle sei più comuni trisomie autosomiche associate all'aborto

spontaneo: trisomia 13 (sindrome di Patau), trisomia 15, trisomia 16, trisomia 18 (sindrome di Edwards),

trisomia 21 (sindrome di Down) e trisomia 22. Il kit contiene anche i marker per i cromosomi X e Y e il

marker TAF9L per la determinazione dello stato dei cromosomi sessuali. La metodica impiegata dal kit

Elucigene QST*R-PL è la tecnica QFPCR (reazione a catena della polimerasi quantitativa in

fluorescenza). Il dispositivo è destinato all'uso su DNA estratto da materiale fetale ottenuto post-aborto

o sangue intero (di origine fetale). La popolazione target di interesse è costituita da soggetti che hanno

subito un aborto spontaneo. I risultati ottenuti con il kit QST*R-PL possono essere d'aiuto per stabilire

lo stato di aneuploidia del feto e sono destinati all'uso congiuntamente ad altre procedure diagnostiche

al fine di supportare o scartare la diagnosi clinica proposta. Il dispositivo è destinato esclusivamente

all’uso professionale in ambiente di laboratorio citogenetico o molecolare.

Riepilogo e spiegazione

Statisticamente, il 10-20% di tutte le gravidanze termina in un aborto spontaneo di cui la maggior parte

si verifica verso la fine del primo trimestre. Di questi, oltre il 50% di casi ha mostrato di essere causato

da un'anomalia cromosomica (1), primariamente da aneuploidia; le più comuni conosciute sono le

trisomie che rappresentano il 60% di tutte le anomalie cromosomiche nell'aborto spontaneo. La trisomia

più frequente trovata in prodotti del concepimento (POC) è la trisomia per il cromosoma 16, tuttavia,

anche le trisomie per i cromosomi 13, 15, 18, 21 e 22 sono tra le più comuni. Altre aneuploidie

comunemente riscontrate includono la monosomia del cromosoma X e la triploidia che rappresentano

ca. il 20% e il 15% di tutte le anomalie rispettivamente. Questi dati sono rappresentati in Figura 1 sotto

(2).

Figura 1: Mostra le individuazioni cromosomiche in prodotti del concepimento con 46N che rappresentano

risultati normali.



Principi della procedura

La metodica impiegata dai kit Elucigene QST*R è la tecnica QF-PCR (reazione a catena della

polimerasi quantitativa in fluorescenza) (3-6). Utilizzando l’amplificazione mediante PCR, i primer

marcati con un colorante fluorescente sono diretti a individuare le regioni altamente polimorfiche delle

sequenze di DNA denominate ripetizioni in tandem brevi (short tandem repeat, STR) che sono

localizzate sui cromosomi di interesse. Ogni marker STR individuato è specifico per il cromosoma su

cui si trova, pertanto il numero di copie del marker STR può essere indicativo del numero di copie del

cromosoma. Sono stati selezionati marker STR informativi che mostrano un’elevata eterogeneità, in

modo tale da determinare facilmente il numero di copie. Un campione diploide normale presenta il

normale complemento di due di ciascuno dei cromosomi somatici, pertanto i due alleli di un STR

specifico per un cromosoma vengono determinati dalla tecnica QF-PCR come due picchi in rapporto

1:1. L’osservazione di un allele STR in più come profilo a tre picchi in rapporto 1:1:1 o come profilo a

due picchi in rapporto 2:1 o 1:2 è indicativo della presenza di una sequenza aggiuntiva che a sua volta

rappresenta un cromosoma aggiuntivo, come nel caso di una trisomia.

I prodotti di amplificazione ottenuti con la tecnica QF-PCR vengono analizzati in modo quantitativo con

un analizzatore genetico mediante elettroforesi capillare per determinare il numero di copie dei marker

STR analizzati.

Avvertenze e precauzioni

1. Il DNA normale di controllo fornito all’interno dei kit è stato analizzato a parte ed è risultato negativo al virus dell’epatite B (HBV), al virus dell’epatite C (HCV) e al virus dell’immunodeficienza umana (HIV) 1 e 2.

2. Si consiglia di manipolare con cautela il materiale di origine umana. Tutti i campioni devono essere considerati potenzialmente infettivi. Nessun metodo di analisi può offrire la certezza assoluta dell’assenza dei virus HBV, HCV, HIV o di altri agenti infettivi.

3. La manipolazione dei campioni e dei componenti del test, il loro utilizzo, la conservazione e lo smaltimento devono avvenire in conformità con le procedure definite dalle linee guida o dai regolamenti nazionali appropriati in materia di sicurezza e rischio biologico.

4. In osservanza delle buone pratiche di laboratorio correnti, i laboratori devono analizzare in ciascun test i propri campioni di controllo qualità interno di tipo noto, in modo da poter valutare la validità della procedura.

5. Se la scatola del kit è danneggiata, anche il contenuto potrebbe essere danneggiato; non utilizzare il kit e contattare l’assistenza clienti.



Simboli usati sulle etichette

I simboli usati su tutte le etichette e le confezioni sono conformi alla norma armonizzata

ISO 15223

Produttore

Numero di test

Vedere le Istruzioni per l'uso

Conservare al di sotto della temperatura indicata

Utilizzare prima della data indicata

Codice catalogo

Numero di lotto o partita

Dispositivo medico-diagnostico in vitro

X°C

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http://www.google.co.uk/url?sa=i&rct=j&q=LOT+symbol&source=images&cd=&cad=rja&docid=62O-eE9sW05AOM&tbnid=ZDVfCSBll5ONyM:&ved=0CAUQjRw&url=http://www.cookmedical.com/help.do?id=452&ei=p2wvUdDfBenQ0QXu4IDIAw&bvm=bv.43148975,d.d2k&psig=AFQjCNF4yauw6bojoq3OD9AGuCtEfnLk4Q&ust=1362148901364130

http://www.google.co.uk/url?sa=i&rct=j&q=ivd+symbol&source=images&cd=&cad=rja&docid=U3rWzPbRU_MhlM&tbnid=vpxmkhuKXLCeNM:&ved=0CAUQjRw&url=http://fertipro.com/index.php?page=qc&sub=labels&ei=KGwvUeT4FNCV0QX714D4AQ&bvm=bv.43148975,d.d2k&psig=AFQjCNEDI1EBh3YPTlA0XP-KsTwfpDQ1lw&ust=1362148745765908



Materiali forniti

Conservare tutti i componenti a temperature inferiori a -20 °C.

Il kit Elucigene QST*R-PL IVD contiene:

450089 1 x 250µl Miscela di reazione (TA)

404485 1 x 50µl DNA di controllo (DC)

Sufficiente per 25 test.

Preparazione e conservazione del kit

All'apertura del kit si consiglia di dispensare la miscela di reazione in provette per PCR da 0.2ml in

volumi di 10µl e congelare a -20°C. Assicurarsi che il contenuto delle provette sia accuratamente

scongelato e mescolato prima di essere dispensato.

Il DNA di controllo deve essere congelato a -20°C.

Materiali necessari ma non forniti

Generali

Materiali di consumo di laboratorio: guanti, tubi per microcentrifuga con tappo a vite, provette per PCR

da 0.2ml o piastre di microtitolazione raccomandati dal produttore del termociclatore impiegato, puntali

per pipette.

Apparecchiature di laboratorio: pipette di precisione (2 set: 1 per la pre-amplificazione e 1 per la post-

amplificazione, preferibilmente pipette a spostamento positivo), indumenti di protezione, vortex,

microcentrifuga, centrifuga con piastra per microtitolazione a 96 pozzetti.

Amplificazione mediante PCR

Termociclatore adatto per piastre di microtitolazione a 96 pozzetti o provette da 0.2ml con accuratezza

di temperatura di +/-1°C tra 33°C e 100°C e uniformità di temperatura statica di +/-1°C. QST*R-21-PL

è stato convalidato e ha mostrato di soddisfare la specifica sulle seguenti piattaforme di termociclatore:

Life Technologies GeneAmp 9700

Life Technologies Veriti Dx (funzionamento in modalità standard)

Life Technologies Veriti Dx (funzionamento in modalità di simulazione 9700)

Life Technologies Proflex (funzionamento in modalità standard)

Life Technologies Veriti Dx (funzionamento in modalità di simulazione 9700) Nota: Le intensità dei segnali di picco possono aumentare con l'uso di piattaforme di termociclatore Veriti e Proflex rispetto alla piattaforma GeneAmp 9700.



Elettroforesi capillare

Elettroforesi capillare: size standard GeneScan 500 LIZ (ABI, n. cat. 4322682), polimero POP-7 (ABI,

n. cat. 4352759), standard per la matrice DS-33 (set di coloranti G5) (ABI n. cat. 4345833), tampone

per analizzatore genetico 10x (ABI, n. cat. 402824) e formammide Hi-Di (ABI, n. cat. 4311320).

Analizzatori genetici Applied Biosystems ABI 3130 e 3500 (con software GeneMapper), array di capillari

di 36 cm (array di capillari di 50 cm per l’analizzatore genetico 3500), piastre ottiche a 96 pozzetti, setti

per 96 pozzetti, cassette per 96 pozzetti.

Analisi dei dati

È richiesto uno dei seguenti pacchetti software per l’analisi dei dati: GeneMapper 4.1 (Applied

Biosystems Inc.) o versione successiva o GeneMarker 1.65 (SoftGenetics LLC) o versione successiva.

Documentazione aggiuntiva Elucigene QST*R

Queste Istruzioni per l'uso includono una sezione di base sull'interpretazione dei risultati ottenuti in

aggiunta a una guida al software di analisi con i pacchetti GeneMapper e GeneMarker. Una

documentazione aggiuntiva, Guide to interpretation (Guida all’interpretazione) con esempi e un

glossario sono disponibili sul sito web di Elucigene: www.elucigene.com.

Estrazione del DNA

Una metodica per l'estrazione del DNA per produrre un DNA di qualità amplificabile con la tecnica PCR

alla concentrazione compresa tra 0.5ng/µl e 4ng ng/µl.

Concentrazione del DNA

Utilizzando le condizioni consigliate per la PCR e le impostazioni di iniezione dei campioni* indicate nel

modulo di analisi per le colonne capillari (pag. 9), si ottengono risultati ottimali con un quantitativo di

DNA di input di 2.5ng. Tuttavia, risultati interpretabili si ottengono con la gamma di DNA di input

compresa tra 1.25ng e 10ng.

*Nota: È possibile modificare le impostazioni di iniezione dei campioni in funzione della quantità di

ampliconi prodotti durante la reazione di PCR, che può variare a seconda della quantità di DNA

genomico di input aggiunto. Riducendo il tempo di iniezione è possibile applicare una minore quantità

di ampliconi alla colonna di analisi. Aumentando invece il tempo o la tensione di iniezione è possibile

applicare una maggiore quantità di ampliconi alla colonna di analisi. È possibile reiniettare più volte i

campioni precedentemente amplificati per rianalizzarli.

http://www.elucigene.com/



Protocollo del test

Procedura di amplificazione

Nota: Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione, le operazioni descritte ai punti 3 - 5 devono

essere condotte in un’area priva di DNA. Queste operazioni devono essere eseguite anche per evitare

la contaminazione con il prodotto di PCR.

1. Programmare il termociclatore per un ciclo di un unico passaggio a 95 °C per 15 minuti per attivare la DNA polimerasi seguito da un programma ciclico di amplificazione di 30 secondi a 95 °C (denaturazione), 1 minuto e 30 secondi a 59 °C (annealing) e 1 minuto e 30 secondi a 72 °C (estensione) per 26 cicli. Questo ciclo deve essere collegato ad un file di ritardo di 30 minuti a 72 °C (estensione) sul ciclo finale.

2. Ciascun ciclo di PCR deve includere un controllo negativo (acqua). Può essere opportuno includere anche altri controlli, ad esempio un controllo positivo normale (DNA di controllo fornito) e un controllo positivo per la trisomia (DNA non fornito).

3. Scongelare un numero di provette contenenti la miscela di reazione QST*R-PL precedentemente suddivisa in aliquote, che sia sufficiente per il numero di campioni e controlli da analizzare (vedere la nota in Materiali forniti) e centrifugarle a 12.000 g per 10 secondi.

4. Utilizzando puntali per pipette diversi, aggiungere 2,5 µl di DNA da analizzare alla provetta del campione contenente 10 µl di miscela di reazione QST*R-PL e miscelare aspirando e rilasciando con la pipetta. Ripetere l’operazione per tutti i campioni da analizzare.

5. Nella provetta per PCR che verrà utilizzata per il controllo negativo non aggiungere DNA, ma aggiungere 2,5 µl di acqua distillata sterile.

6. Centrifugare brevemente le provette fino a quando tutto il liquido si sarà depositato sul fondo di ciascuna provetta.

7. Posizionare tutte le provette nel blocco del termociclatore in modo che siano ben ferme. Avviare il programma di attivazione a 95° C seguito dal programma di amplificazione (vedere il punto 1).

8. Al termine del programma di amplificazione, i campioni possono essere conservati a temperatura ambiente per tutta la notte oppure a 2° C - 8° C per un massimo di 7 giorni prima dell’analisi con elettroforesi capillare.



Elettroforesi capillare

Si raccomanda a ciascun utilizzatore di assicurarsi che l’apparecchiatura selezionata sia usata secondo

le istruzioni della ditta produttrice e che sia compatibile con questo test. In questo contesto, i parametri

chiave sono il polimero e l’array di capillari. Risultati ottimali si possono ottenere utilizzando le seguenti

condizioni per l’elettroforesi capillare sull’analizzatore genetico ABI3130 o ABI3500.

1. Combinare 6,85 µl di size standard con 250 µl di formammide Hi-Di e miscelare con cura (miscela sufficiente per 16 pozzetti). Dispensare 15 µl di miscela nel numero di pozzetti necessario su una piastra ottica a 96 pozzetti*.

2. Aggiungere 3 µl di prodotto di PCR del campione di analisi alla miscela di size standard (preparata come indicato al punto 1) precedentemente dispensata nella piastra e miscelare con la pipetta. Sigillare la piastra.

3. Denaturare il prodotto di PCR dispensato nella piastra ottica in un termociclatore utilizzando i seguenti parametri: 94 °C per 3 minuti e a seguire 4 °C per 30 secondi.

4. Centrifugare la piastra a 1.000 g per 10 secondi per rimuovere eventuali bolle nei pozzetti e caricarla sull’analizzatore genetico.

*Nota: È essenziale che i pozzetti non utilizzati (cioè i pozzetti in cui è caricato il campione di DNA)

siano sempre caricati con formammide Hi-Di per garantire che i capillari non si asciughino.

Analisi dei dati post-PCR

ABI3130 GENETIC ANALYZER (ANALIZZATORE GENETICO)

Creare una scheda campione utilizzando il software di raccolta dati 3130 con le seguenti impostazioni:

• Nome campione: deve essere lo stesso nome o numero specifico del campione.

• Responsabile analisi: selezionare il responsabile predefinito del laboratorio.

• Protocollo di analisi: QSTR (contiene il modulo di analisi QST*R 3130 – vedere sotto)*.

*Nota: È necessario creare un modulo di analisi elencando le impostazioni dello strumento e

successivamente assegnare questo modulo a un protocollo di analisi in cui sia stato selezionato il set

di coloranti G5. Per ulteriori informazioni sulla creazione dei moduli di analisi, consultare il manuale

d’uso dello strumento in dotazione.



3130 RUN MODULE (MODULO DI ANALISI)

PER IL POLIMERO POP7

Modulo per capillare da 36 cm: QSTR

# Nome del parametro Valore Intervallo

1. Temperatura forno 60 int 18…65 gradi C 2 Poly_fill_Vol. 6500 6500…38000 fasi 3 Stabilità corrente 5.0 int 0…2000 uAmp 4 PreRun_Voltage 15.0 0 …15 kvolt 5 Pre_Run_Time 180 1…1000 s 6 Injection_Voltage 3,0 1 …15 kvolt 7 Injection_Time 15 1…600 s 8 Voltage_Number_of_Steps 20 1…100 nk 9 Voltage_Step_Interval 15 1…60 s 10 Data_Delay_Time 60 1…3600 s 11 Run_Voltage 15,0 0 …15 kvolt 12 Run_Time 1200 300…14000 s.

ABI3500 GENETIC ANALYZER (ANALIZZATORE GENETICO)

È necessario creare un protocollo dello strumento per QST*R che può essere usato

successivamente per ciascuna analisi QST*R. Creare il protocollo dello strumento per QST*R

mediante la libreria dei protocolli dello strumento 3500.

Assicurarsi che siano selezionate le seguenti voci:

• Run Module (Modulo di analisi): FragmentAnalysis50_POP7

• Immettere le impostazioni illustrate nell’immagine qui sotto:



Per analizzare i campioni, creare una piastra del campione facendo clic su "Create Plate from

Template" (Crea piastra da modello) nel "Dashboard", assicurarsi che sia stato assegnato il protocollo

dello strumento corretto per QST*R (vedere sopra).

Analisi e interpretazione dei risultati

È consigliabile che ogni laboratorio sviluppi le proprie procedure e i propri criteri di interpretazione e

refertazione dei risultati. Le linee guida di miglior pratica per la QF-PCR sono state documentate dalla

Association for Clinical Genetic Science del Regno Unito e sono disponibili sul sito:

www.acgs.uk.com

I prodotti di PCR vengono osservati in un sistema marcato con 5 coloranti utilizzando il set di filtri G5.

Il set di filtri G5 permette di rilevare i frammenti marcati con 6-FAM (blu), VIC (verde), NED (giallo) e

PET (rosso) più il marker size standard marcato con LIZ (arancione) su un elettroferogramma con il

programma GeneMapper o GeneMarker.

Una guida all'interpretazione QST*R è disponibile sul sito web di Elucigene: www.elucigene.com.

Nota importante: Le diverse combinazioni di strumenti, polimeri e size standard possono causare lievi

variazioni nell’assegnazione delle dimensioni. Durante la convalida del kit, l’utente deve verificare che

le impostazioni del file bin predefinite consentano un’etichettatura accurata dei picchi e, se necessario,

deve regolarle. In caso di difficoltà, contattare l’assistenza tecnica. ([email protected]).

Linee guida generali per QST*R-PL

1. Il controllo negativo non deve mostrare picchi alti e stretti nell’intervallo di valori compreso tra 100 bp e 510 bp.

2. Il controllo positivo deve mostrare i risultati attesi e tutti i picchi devono soddisfare i criteri riportati di seguito.

3. Per l’analisi dei campioni di DNA si deve osservare almeno 1 picco per ogni marker analizzato. L’intervallo accettabile per i picchi dei marker analizzati con l’analizzatore genetico 3130 è compreso tra 50 e 6000 unità di fluorescenza relativa (rfu), mentre per i marker analizzati con gli analizzatori genetici 3500 è compreso tra 175 e 32000 rfu. Le altezze dei picchi che non rientrano in questo intervallo non devono essere analizzate.

4. Gli elettroferogrammi di scarsa qualità dovuta ad eccessivo spargimento (bleedthrough) tra i coloranti (fenomeno noto anche col termine di "pull-up") o "spikes elettroforetici" (picchi alti e stretti presenti in più di un colorante) non devono essere interpretati. I prodotti di PCR devono essere reiniettati e rianalizzati.

5. L’analisi viene eseguita valutando il rapporto tra i picchi (A1/A2), dove A1 è l’area del picco del frammento più corto e A2 è l’area del picco del frammento più lungo. Il rapporto che ne deriva è indicativo del numero di copie dei loci. Per le disomie cromosomiche, i marker eterozigoti devono mostrare due picchi con altezze simili. Un’analisi completa dello stato del numero di copie dei cromosomi viene eseguita dal confronto tra i rapporti dell’area dei picchi.

6. I marker eterozigoti diallelici (cioè due alleli) devono rientrare in un intervallo di rapporti compreso tra 0,8 e 1,4. Tuttavia, per due alleli le cui dimensioni si discostano di più di 24 bp, è accettabile un rapporto non superiore a 1,5. Qualunque valore che cade all'interno di questo intervallo viene considerato rientrante nel rapporto 1:1. Se il bilanciamento dei rapporti non rientra in questo intervallo, la causa potrebbe essere attribuita a vari fattori, tra cui:

http://www.acgs.uk.com/





Trisomia cromosomica completa

Trisomia cromosomica parziale (incluse le duplicazioni submicroscopiche)

Mosaicismo

Secondo genotipo contaminante (ad es., materno, gemello, esterno)

Stutter che causano "skewing" (deviazioni significative del rapporto 1:1);

Amplificazione preferenziale di un allele che causa "skewing"

Polimorfismo in corrispondenza dei siti di legame dei primer

Mutazioni somatiche nelle regioni microsatelliti. La Guide to Interpretation (Guida all’interpretazione) contiene degli esempi di profili tipici per molti

di questi casi. I marker omozigoti risultano non informativi perché non può essere determinato un

rapporto.

7. Per poter interpretare un risultato come anomalo (ossia, presenza di una trisomia), è necessario individuare almeno due marker informativi coerenti con il genotipo a tre alleli mentre tutti gli altri marker possono risultare non informativi. Non è consigliabile interpretare un risultato come anomalo basandosi sulle informazioni ottenute da un unico marker. Se necessario, i test di controllo effettuati con i kit per singoli cromosomi (ossia, Elucigene QST*R-13, Elucigene QST*R-18, Elucigene QST*R-21) possono fornire informazioni sufficienti per l’interpretazione. La trisomia è determinata dalle seguenti condizioni: 7.1. Due picchi di altezza diversa. Tale condizione è dovuta al fatto che uno dei picchi rappresenta

due alleli presenti in uno o in entrambi i genitori. In tal caso, il rapporto tra i due picchi verrà classificato come 2:1 o 1:2 tale che A1/A2 fornirà un risultato nella regione compresa tra 1.8 e 2.4 quando il picco che rappresenta l’allele più corto ha un’area più grande rispetto al picco che rappresenta l’allele più lungo, oppure A1/A2 fornirà un risultato nella regione compresa tra 0.45 e 0.65 quando il picco che rappresenta l’allele più corto ha un’area più piccola rispetto al picco che rappresenta l’allele più lungo.

7.2. Presenza di tre picchi di altezza comparabile. Il rapporto dei picchi verrà classificato come 1:1:1 e i rispettivi valori rientrano nell'intervallo normale 0.8 – 1.4 (sebbene, per gli alleli che si discostano tra loro di più di 24 bp, si considera accettabile un rapporto con valore fino a 1.5). Se ciò non si verifica, la causa potrebbe essere attribuita ad uno dei fattori menzionati al punto 6.

8. Per interpretare un risultato come normale, è necessario individuare almeno due marker informativi coerenti con un genotipo a due alleli mentre tutti gli altri marker possono risultare non informativi. Un risultato normale indica il normale complemento di due per i cromosomi analizzati.

9. I rapporti dell’area dei picchi che rientrano negli intervalli normale e anomalo vengono classificati come inconcludenti. I risultati inconcludenti possono essere risolti utilizzando i kit per singoli cromosomi.

10. Se per un singolo cromosoma si ottengono entrambi i profili allelici normale e anomalo, prima di

trarre qualunque conclusione si consiglia di approfondire le ricerche con test di controllo per identificare il motivo della discrepanza fra i risultati.

11. In rari casi, gli intervalli delle dimensioni alleliche per i marker possono sovrapporsi. Se si sospetta

tale circostanza, un’analisi con i kit per singoli cromosomi può essere risolutiva.

Analisi di marker di cromosomi sessuali AMEL, TAF9 e SRY:

1. Il marker AMEL amplifica le sequenze non polimorfiche sui cromosomi X (104 bp) e Y (110 bp), può essere utilizzato per determinare la presenza o l’assenza di un cromosoma Y e rappresenta la quantità di sequenze X rispetto alle sequenze Y. In rare occasioni è stato segnalato che l’amplificazione non avviene a causa di una mutazione nella sequenza AMEL-Y.



2. TAF9L è un marker paralogo invariabile con sequenze sui cromosomi 3 e X. Il picco specifico per il cromosoma 3 (116 bp, che rappresenta 2 copie del cromosoma 3) può essere quindi usato come picco di riferimento per determinare il numero di cromosomi X presenti (picco da 121 bp). Analizzato in combinazione con l’amelogenina e con gli altri marker dei cromosomi sessuali, è particolarmente utile nella diagnosi dell’aneuploidia dei cromosomi sessuali. In un individuo normale di sesso femminile i marker devono cadere nell’intervallo di rapporti compreso tra 0.8 e 1.4. In un individuo normale di sesso maschile, i marker devono fornire un rapporto maggiore o uguale a 1.8. Ulteriori dettagli sull’interpretazione del marker TAF9L sono disponibili nella Guide to Interpretation (Guida all’interpretazione).

3. Il marker specifico per il cromosoma Y, SRY, fornirà un singolo picco negli individui normali di sesso maschile e non verrà amplificato negli individui normali di sesso femminile.

Caratteristiche dell’esecuzione del test

CONVALIDA INTERNA

Sono stati sottoposti a test 125 tessuti di derivazione fetale utilizzando Elucigene QST*R-PL. Di questi,

34 sono risultati normali/XY, 40 normali/XX, 5 T22/XY, 1 T22/XX, 3 T21/XY, 4 T21/ XX, 3 T18/XY, 5

T18/XX, 6 T16/XY, 2 T16/XX, 1 T15/XY, 1 T15/XX, 2 T13/XY, 2 T13/XX, 7 con monosomia del

cromosoma X, 8 sono risultati triploidi per tutti i cromosomi analizzati. Un campione ha fornito un

risultato non informativo a causa di omozigosità all'interno del set di marker. Questo campione è stato

successivamente analizzato con QST*R-18 e si è mostrato T18/XX. Tutti i risultati analizzabili hanno

mostrato una concordanza del 100% con i risultati precedentemente ottenuti con altri metodi già stabiliti.



Guida all'Analisi GeneMapper

Nota: I seguenti screenshot GeneMapper sono riferiti a GeneMapper v5.0

Importazione e analisi di file QST*R

1. Aprire il file del programma GeneMapper

2. Fare clic su per aggiungere file di dati a un nuovo progetto. Navigare dove sono salvati i file di dati raw .fsa, evidenziare i file di dati appropriati e fare clic su "Add to List>>". (Aggiungi a lista>>)

3. La cartella di analisi apparirà ora nella finestra "Samples to Add" (Campioni da aggiungere) Facendo doppio clic sull'icona della cartella di analisi in questa finestra apparirà ogni file .fsa da importare. I campioni vengono poi aggiunti facendo clic su

in basso nello schermo. I file di dati verranno ora visualizzati nello schermo principale di GeneMapper (figura 2)

Figura 2: Campioni pronti da aggiungere al progetto



Importazione delle impostazioni di analisi di QST*R GeneMapper in GeneMapper

Manager

È necessario importare le impostazioni QST*R per GeneMapper. Questo processo viene controllato

tramite l’interfaccia "GeneMapper Manager". Le impostazioni QST*R GeneMapper sono disponibili

sul sito web di Elucigene: www.elucigene.com/product-category/rapid-aneuploidy-analysis/

1. Aprire il programma "GeneMapper Manager" facendo clic sull'icona .

2. Selezionare la scheda ‘Analysis Methods’ (Metodiche di analisi), quindi fare clic sul pulsante di

importazione

3. Cercare i file delle impostazioni dell’analisi QST*R necessari (3130 o 3500) e importarli.

4. Ripetere il processo selezionando la scheda corretta e importando i rispettivi file per:

• Table Settings (Impostazioni tabelle)

• Plot Settings (Impostazioni grafico)

• Size Standards (Size standard)

Nota: Cluster Plot Settings (Impostazioni grafico cluster), Matrices (Matrici), SNP Sets (Set

SNP) e Report Settings (Impostazioni rapporti) non richiedono l’importazione di file.

Importazione delle impostazioni dei pannelli QST*R-PL in Panel Manager (Gestione

pannelli)

È necessario importare le impostazioni del file bin e dei pannelli QST*R-PL per GeneMapper. Questo processo viene controllato tramite l’interfaccia "Panel Manager" (Gestione pannelli). Il pannello GeneMapper specifico per QST*R-PL e le impostazioni del file bin sono disponibili sul sito web di Elucigene: www.elucigene.com/product-category/rapid-aneuploidy-analysis/

1. Aprire il programma Panel Manager facendo clic sull’icona .

2. Fare clic su "Panel Manager" (Gestione pannelli) nella finestra di navigazione sinistra. La voce appare ora evidenziata in celeste.

3. Selezionare "File/Import Panels" (File/Importa pannelli). Cercare il file dei pannelli

GeneMapper "QSTRPL Panel.txt" e importarlo (Figure 3).

4. Il file dei pannelli verrà ora visualizzato nella finestra di navigazione sinistra. Fare clic sul file dei pannelli per accertarsi che sia evidenziato in celeste.

5. Selezionare "File/Import Bin Set" (File/Importa set bin). Cercare il file bin GeneMapper

"QSTRPL Bins.txt" e importarlo (Figura 4).

6. Fare clic su "Apply" (Applica) e poi su "OK".

http://www.elucigene.com/product-category/rapid-aneuploidy-analysis/




7. Figura 3: Importazione del file dei panelli QST*R-PL

Figura 4: Importazione del file bin QST*R-PL



Modifica del file dei parametri di analisi

Potrebbe essere necessario modificare la voce predefinita "Analysis Ranges" (Intervalli di Analisi) nelle impostazioni di analisi QST*R in previsione di variazioni a livello locale delle condizioni di analisi. L’intervallo minimo di analisi dipenderà dal capillare e dal polimero utilizzati durante l’acquisizione dei dati. Per visualizzare le attuali impostazioni di analisi:

1. Aprire il programma "GeneMapper Manager" facendo clic sull'icona .

2. Selezionare la scheda "Analysis Methods"(Metodiche di analisi). Il file QST*R importato sarà elencato come "QSTR Analysis v02" (Analisi v02 QSTR).

3. Fare clic su "QSTR Analysis v02" (Analisi v02 QSTR). La riga appare ora evidenziata.

4. Fare clic sul pulsante "Open" (Apri) e selezionare la scheda "Peak Detector" (Rivelatore

picco) (Figura 5).

Per impostazione predefinita, gli intervalli di analisi sono impostati in modo da iniziare a 2.000 e finire

a 18.000.

Figura 5: Intervalli di analisi.



Per individuare il corretto intervallo di analisi per il proprio laboratorio:

1. Nella finestra principale di GeneMapper, fare doppio clic sulla cartella di analisi importata per visualizzare l'elenco dei file .fsa in essa contenuti.

2. Selezionare un file .fsa.

3. Facendo clic sulla scheda "Raw data" (Dati grezzi) viene visualizzato un elettroferogramma dei dati grezzi.

4. Utilizzando come guida il primo picco del size standard (ad es., 75 bp di GS500LIZ),

selezionare un punto di dati di circa 100 punti più largo (Figura 6). In questo modo si determina il punto più basso nell’intervallo analizzabile.

5. Assicurarsi che il massimo intervallo dell'analisi comprende il più grande picco del size

standard (ad es. 500bp di GS500LIZ o 600bp di GS600LIZv2).

6. Inserire i nuovi valori nel file di analisi QST*R (accedendovi come indicato sopra). Figura 6: Individuazione dell’intervallo minimo utilizzando i dati grezzi dei campioni



Analisi dei file importati QST*R-PL

1. Nella finestra principale di GeneMapper selezionare "QST*R Table Settings v02"(Figure 7)

Figura 7: Impostazioni impostazione tabella QST*R

2. In "Analysis Method" (Metodica di analisi) selezionare "QSTR Analysis v02". Riempire ciascuna colonna premendo "Ctrl+D". Ripetere questo processo selezionando "QSTR-PL" nel titolo "Panel" (Pannello) e "QSTR" nel titolo "Size Standard". Ricordarsi ogni volta di riempire premendo "Ctrl+D" per garantire che ogni impostazione venga applicata all'intera lista di campioni.

3. Fare clic su per avviare l’analisi dei campioni. Assegnare un nome al progetto quando viene richiesto.

Esame dei dati QST*R

1. Selezionare il campione da analizzare (evidenziare la riga del campione).

2. Fare clic su per "Display Plots" (Visualizzare i grafici).

3. Selezionare "QST*R Plot settings" (Impostazioni del grafico QST*R) (Figura 8).

Figura 8: Impostazioni del grafico QST*R, menu a discesa.

4. Nella finestra del grafico viene visualizzato il profilo del campione con i dati tabellari (Figura 9). GeneMapper assegna automaticamente le etichette a non più di due picchi per ciascun marker. Se per un marker sono presenti tre alleli, il terzo picco non etichettato dovrà essere etichettato manualmente (vedere: Modifica manuale dei profili, sotto)

Nota: Gli intervalli delle dimensioni alleliche di ciascun marker si basano sui dati precedentemente osservati. Raro Gli alleli rari potrebbero cadere al di fuori di un dato intervallo dell’entità del marker e potrebbe essere necessario regolare il set bin di conseguenza.

5. Si consiglia di attivare l’opzione "Single click editing" (Modifica con singolo clic). A tal fine selezionare "Alleles/set click editing" (Alleli/imposta modifica con clic) e assicurarsi che questa opzione sia selezionata..



Figura 9: Finestra dei grafici dei campioni in cui sono visualizzati i dati dei tracciati etichettati

e la relativa tabella dei genotipi

Modifica manuale dei profili

AVVERTENZA!

GeneMapper assegnerà le etichette solo a non più di due picchi per marker. Pertanto, potrebbe essere necessario modificare i profili manualmente, cioè quando occorre assegnare le etichette ai terzi picchi (se presenti) o quando occorre rimuovere le etichette dai picchi "stutter". Per aggiungere l’etichetta a un picco, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul picco non etichettato. Viene visualizzata l’opzione che consente di aggiungere un commento ad un allele. Fare clic su "OK". Il picco viene ora etichettato con le informazioni relative alle dimensioni, espresse in paia di basi, e all’area del picco. Il picco appena etichettato verrà incorporato automaticamente nella tabella. Per rimuovere l’etichetta da un picco, fare clic con il pulsante sinistro del mouse sull’etichetta del picco. Viene visualizzata l’opzione che consente di eliminare il commento relativo ad un allele. Fare clic su "OK". L’etichetta del picco viene ora rimossa. I dati eliminati relativi al picco verranno automaticamente rimossi dalla tabella. Copiatura dei dati tabellari

1. Evidenziare tutte le righe con la tabella in basso nella finestra dei grafici.

2. Copiare le righe selezionate premendo i tasti "Ctrl+C".



Modello di rapporto QST*R-PL

Il modello di rapporto associato a QST*R-PL può essere utilizzato per determinare i rapporti dei picchi per un marker e assistere nell'analisi dei dati. Il modello di rapporto specifico per QST*R-PL è disponibile sul sito web: www.elucigene.com/product-category/rapid-aneuploidy-analysis/

1. Aprire il file Modello di rapporto QST*R-PL (QSTR-PL Report Template.xlsm).

2. Se il modello di rapporto visualizza un avvertimento che indica che i macro sono stati disattivati, fare clic su "Enable Content" (Attivare contenuto) per attivare i macro (Figure 10).

Figura 10: Attivazione della funzione dei macro nel modello di rapporto QST*R-PL

3. Se viene visualizzato un avvertimento di protezione (come illustrato in Figura 11), fare clic su "Yes" (Si) per procedere.

Figura 11: Consenso all'accesso di sicurezza

4. Incollare i dati copiati dalla tabella di dati GeneMapper (vedere sopra, "Copying Data Table" - Copiatura tabella dati) usando "Ctrl+V" nella cella in alto a sinistra nell'area con contorno (vedere Figura 12).




Figura 12: Importazione di dati grezzi GeneMapper nel modello di rapporto QST*R-PL.

5. I rapporti calcolati per ciascun marker saranno ora visualizzati nella tabella di dati a sinistra.

La tabella di dati può essere stampata o salvata come nuovo file per ciascun campione specifico.

6. Per analizzare i campioni successivi è importante che tutti i dati siano completamente cancellati dal modello di rapporto. A tale scopo, fare clic sul tasto "CLEAR DATA" (Cancella dati) ubicato sotto la tabella dei dati grezzi all'interno del modello di rapporto QST*R-PL. A questo punto è possibile importare nuovi dati di campione seguendo la procedura descritta sopra.



Valutazione del rapporto

1. La trisomia è determinata dalle seguenti condizioni:

a. Due picchi di altezza diversa. Tale condizione è dovuta al fatto che uno dei picchi rappresenta due alleli comuni a entrambi i genitori. In questo caso il rapporto tra i due picchi sarà classificato come 2:1 o 1:2. Dove A1/A2 fornirà un risultato nella regione compresa tra 1.8 e 2.4 quando il picco che rappresenta l’allele più corto ha un’area più grande rispetto al picco che rappresenta l’allele più lungo, oppure dove A1/A2 fornirà un risultato nella regione compresa tra 0.45 e 0.65 quando il picco che rappresenta l’allele più corto ha un’area più piccola rispetto al picco che rappresenta l’allele più lungo.

In entrambi i casi nella colonna "Warning" (Avvertimento) verrà visualizzata la scritta "Ratio" (Rapporto).

b. Presenza di tre picchi di altezza comparabile. Il rapporto dei picchi verrà classificato come 1:1:1 e i rispettivi valori rientrano nell'intervallo normale 0.8 – 1.4 (sebbene, per gli alleli che si discostano tra loro di più di 24 bp, si considera accettabile un rapporto con valore fino a 1.5).

In questo caso, nella colonna "Warning" (Avvertimento) verrà visualizzata la scritta "3 Alleles" (3 alleli).

2. Per poter interpretare un risultato come anomalo (cioè, presenza di una trisomia), è necessario individuare almeno due marker informativi coerenti con il genotipo a tre alleli, mentre tutti gli altri marker possono risultare non informativi. Non è consigliabile interpretare un risultato come anomalo basandosi sulle informazioni ottenute da un unico marker.

3. Per interpretare un risultato come normale, è necessario individuare almeno due marker informativi coerenti con un genotipo diallelico, mentre tutti gli altri marker possono risultare non informativi. Un risultato normale indica il normale complemento di due per i cromosomi analizzati.

4. I rapporti dell’area dei picchi che rientrano negli intervalli normale e anomalo vengono classificati come inconcludenti. I risultati inconcludenti possono essere risolti utilizzando i kit per singoli cromosomi.

In assenza di qualunque dato sui picchi relativo a un marker, nella colonna Warning (Avvertimento) verrà visualizzata la scritta "Absent" (Assente). Questo avvertimento verrà osservato regolarmente in assenza dei marker del cromosoma Y.



Guida all'analisi GeneMarker

Nota: I seguenti screenshot sono stati presi da GeneMarker v2.6.3. Aggiunta di file dei campioni a GeneMarker Aprire il file del programma GeneMarker e selezionare ‘Open Data’ quando richiesto. Viene visualizzata la finestra Open Data Files (Apri file di dati). Fare clic sul pulsante "Add" (Aggiungi). Viene visualizzata la finestra di dialogo Open (Apri). Cercare la directory contenente i file di dati grezzi.

1. Selezionare tutti i file premendo i tasti CTRL+A o utilizzare i tasti CTRL e/o MAIUSC per selezionare singoli campioni.

2. Fare clic sul pulsante "Open" (Apri) nella finestra di dialogo Open (Apri). I file selezionati verranno visualizzati nel campo Data File List (Elenco file di dati) (Figura 13). Figura 13: Campioni aggiunti all’elenco dei file di dati.

Fare clic sul pulsante "OK" nella finestra Open Data Files (Apri file di dati) e i campioni saranno caricati in GeneMarker. Il software apre quindi automaticamente la finestra Raw Data Analysis (Analisi dati grezzi) (Figura 14).



Figura 14: Finestra Raw Data Analysis (Analisi dati grezzi)



Importazione delle impostazioni dei pannelli QST*R-PL GeneMarker

È necessario importare le impostazioni dei pannelli QST*R per GeneMarker. Questo processo viene controllato tramite l’interfaccia "Panel Editor" (Editor pannelli). Le impostazioni dei pannelli QST*R-PL di GeneMarker sono disponibili sul sito web di Elucigene: www.elucigene.com/product-category/rapid-aneuploidy-analysis/

1. Aprire "Panel Editor" (Editor pannelli) dal menu a discesa "Tools" (Strumenti) (Figura 15). Figura 15: Selezione di Panel Editor (Editor pannelli)

2. Selezionare "Import Panels" (Importa pannelli) dal menu a discesa "File" (figura 16). Figura 16: Importazione dei pannelli

3. Cercare, ad esempio, il pannello QSTR-PL.xml e importarlo.

4. Ripetere il processo come indicato per gli altri rispettivi file dei pannelli.




Elaborazione dei dati Dopo il caricamento in GeneMarker, i file di dati grezzi sono pronti per essere elaborati. La fase di elaborazione include l’applicazione di un size standard, l’applicazione di filtri ai picchi che generano interferenze e, volendo, il confronto con un pannello di alleli noto. GeneMarker combina tutte queste fasi in un unico semplice strumento denominato "Run Wizard" (Procedura guidata di analisi) (Figura 17). Per accedere alla procedura guidata di analisi basta fare clic sull’icona "Run Project" (Progetto di analisi) nella barra degli strumenti principale.

Run Wizard (Procedura guidata di analisi) – Creazione di un modello di analisi Per poter analizzare i dati QST*R-PL, è necessario creare un modello di analisi al primo utilizzo del software. Tale operazione viene eseguita tramite la Run Wizard (Procedura guidata di analisi).

1. Per accedere alla Run Wizard (Procedura guidata di analisi) basta fare clic sull’icona "Run Project" (Progetto di analisi) nella barra degli strumenti principale.

2. Assegnare un nome al modello, ad es. QSTR-PL.

3. Selezionare il Panel (pannello), il Size Standard, lo Standard Colour (colore dello standard) e il Analysis Type (tipo di analisi) nei rispettivi campi come illustrato sotto nella Figura 17.

4. Fare clic su "Save" (Salva) per memorizzare il modello da utilizzare nelle analisi successive.

5. Fare clic su "Next" (Avanti) per continuare.

Figura 17: Run Wizard (Procedura guidata di analisi) - Finestra Template Selection (Selezione del

modello)



Run Wizard (Procedura guidata di analisi) - Data Process (Elaborazione dati) La finestra Data Process (Elaborazione dati) della Run Wizard (Procedura guidata di analisi) consente di selezionare i parametri dei filtri da applicare ai picchi.

1. Selezionare le impostazioni di analisi appropriate nella finestra Data Process (Elaborazione dati) come illustrato nella figura sotto (Figura 18).

2. Fare clic su "Next" (Avanti) per continuare Nota: L’impostazione dell’intervallo di analisi nella finestra di analisi dei dati grezzi varia in base al polimero utilizzato durante la raccolta dei dati. L’operatore deve selezionare un valore di partenza del punto di dati che includa il picco del size standard di 75 bp..

Figura 18: Run Wizard (Procedura guidata di analisi) - Finestra Data Process (Elaborazione dati)

Nota: Per 3500 dati, aumentare l’intensità minima a 150.



Run Wizard (Procedura guidata di analisi) – Additional Settings (Altre impostazioni)

Quando si esegue l’analisi QST*R, non sono richieste altre impostazioni (Figura 19).

1. Fare clic su "OK" per continuare.

Figura 19: Run Wizard (Procedura guidata di analisi) – Additional Settings (Altre impostazioni)

Finestra Data Processing (Elaborazione dei dati)

Dopo aver fatto clic su "OK", nella finestra Run Wizard Additional Settings (Procedura guidata di analisi - Altre impostazioni), viene visualizzata la finestra Data Processing (Elaborazione dei dati) (Figura 20) I dati grezzi vengono elaborati e calibrati, vengono applicati i parametri dei filtri, quindi viene applicato il pannello QST*R selezionato.

1. Al termine dell’analisi, fare clic su "OK" nella finestra Data Processing (Elaborazione dei dati). Figura 20: Finestra Data Processing (Elaborazione dei dati)



Finestra di analisi principale

La finestra di analisi principale (Figura 21) di GeneMarker presenta un formato facile da usare. Questo formato include:

elenco dei file dei campioni: visualizzato a sinistra nella finestra;

immagine gel sintetica: visualizzata nella parte superiore della finestra;

elettroferogrammi dei dati: sotto l’immagine gel;

tabella dei rapporti: visualizzata sul lato destro della finestra. In questa finestra è importante verificare che tutti i picchi appropriati in ciascun profilo siano stati assegnati correttamente.

1. Fare doppio clic su ciascun campione in sequenza nell’elenco dei file dei campioni sul lato sinistro della schermata. Fare clic con il pulsante destro del mouse su qualsiasi picco in questione e scegliere tra le opzioni nella finestra di dialogo, ad esempio modificare o eliminare alleli, confermare o meno come pertinente.

2. Nella finestra di analisi principale selezionare l’opzione del menu a discesa "Applications" (Applicazioni) nella parte superiore della schermata. Selezionare "Analisi trisomia". Verrà visualizzata la finestra Trisomy Analysis Settings (Impostazioni analisi trisomia) (Figura 22).

Figura 21: Finestra di analisi principale

Figura 22: Finestra Trisomy Analysis Settings (Impostazioni analisi trisomia)



Trisomy Analysis Settings (Impostazioni per analisi trisomia) Nella finestra Trisomy Analysis Settings (Impostazioni analisi trisomia) sono disponibili due schede:

1. Scheda Analysis (Analisi)

2. Scheda Statistics Plot (Grafico statistico) Scheda Analysis (Analisi) La scheda Analysis (Analisi) fornisce le opzioni di impostazione soglia per l’analisi della trisomia. Assicurarsi che nella finestra di analisi sia selezionato "BPG"e che siano visualizzate le seguenti impostazioni:

Peak Height (Altezza picco) 50: altezza minima di 50 per l’assegnazione dei picchi. (150 se si usano 3500 dati)

Height Ratio (Rapporto altezze) 30%: massima percentuale del picco principale che il secondo picco deve raggiungere affinché possano essere identificati due alleli.

Quantification by Peak Area (Quantificazione per Area picco).

Casella di controllo Shorter Length/Longer Length (Lunghezza maggiore/minore) selezionata.

Valori soglia del Trisomy Ratio (Rapporto della trisomia) compresi tra 0.80 e 1.40.

Casella di controllo Apply Linear Correction (Applica correzione lineare) deselezionata.

Fare clic su "OK"

Finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia) La finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia) (Figura 23) permette all'operatore di esaminare i dati relativi al campione QST*R e di visualizzare il rapporto dei picchi per ciascun marker nonché di accedere al rapporto GeneMarker. Nella finestra vengono visualizzate numerose funzioni che assistono l’operatore nell’analisi dei dati. Esse sono:

Elenco dei campioni

Elettroferogramma

Grafico dei rapporti

Tabella dei rapporti

Figura 23: Finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia)



Per informazioni più dettagliate sulle funzioni di analisi della trisomia e sul loro utilizzo, consultare il GeneMarker Manual (Manuale GeneMarker). Rapporto GeneMarker GeneMarker include un modello di rapporto compatibile con i kit Elucigene QST*R. Per accedere al rapporto fare clic sull’icona "Print" (Stampa) che si trova in alto a sinistra nella barra degli strumenti della finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia).

Verrà visualizzata la finestra delle Trisomy Print Settings (Impostazioni di stampa della trisomia) (Figura 24).

Finestra delle Trisomy Print Settings (Impostazioni di stampa della trisomia) Nella finestra delle impostazioni di stampa della trisomia sono elencate le opzioni per l’inclusione e la visualizzazione dei dati dei campioni nel rapporto GeneMarker. Selezionare le opzioni come illustrato nella Figura 24. Assicurarsi che le impostazioni relative alla casella "Custom Size Range" (Mostra intervallo dimensioni personalizzate) siano comprese tra 98 bp (Start [Inizio]) e 510 bp (End [Fine]). Figura 24: Finestra delle Trisomy Print Settings (Impostazioni di stampa della trisomia)



Anteprima del rapporto GeneMarker Fare clic su "Preview" (Anteprima) per visualizzare il rapporto GeneMarker (Figura 25). Da questa finestra l’operatore può controllare e stampare tutti i dati relativi al picco del campione attraverso tutti i marker, ottenendo un semplice rapporto del campione di una o due pagine. Figura 25: Rapporto GeneMarker

Il rapporto GeneMarker include le seguenti funzioni:

Titolo del rapporto: contiene informazioni sull’analisi, sul progetto, sul campione e sui parametri.

Casella delle firme: data e spazio per le iniziali dei revisori del rapporto.

Elettroferogramma: simile a quello della finestra Trisomy Analysis (Analisi trisomia); in esso vengono visualizzati tutti i coloranti del tracciato del campione.

Tabella dei rapporti: vengono visualizzati i valori relativi ai picchi e ai marker selezionati per il campione corrente. I riferimenti alla trisomia sono evidenziati in grigio. La tabella contiene anche una colonna di controllo per le iniziali dei revisori.

Grafico dei rapporti corretto: contiene i punti del grafico dell’intero set di dati per tutti i marker presenti nel colorante. Le forme dei simboli rappresentano i diversi marker e possono essere decifrate dalla riga "Symbol" (Simbolo) nella "Report Table" (Tabella dei rapporti). I simboli con sfondo giallo rappresentano i punti di dati relativi al campione corrente. I simboli con contorno rosso rappresentano i riferimenti alla trisomia.



Nota: Il grafico dei rapporti corretto appare in una seconda pagina per ogni campione solo quando Ratio Plot (Grafico dei rapporti) è selezionato nella finestra delle impostazioni di Trisomy Print Report Settings (Stampa del rapporto della trisomia).

APPENDICE 1: Etichette del colorante

I marker sono contrassegnati come segue:

6-FAM VIC NED PET

D16S2624 D16S539 AMEL FES FPS

D22S683 D15S1515 TAF9L D15S822

D21S11 D22S685 SRY D21S1442

D21S1437 D13S325 D22S686 D18S819

D18S1002 D18S386 D22S689 D16S753

D13S634 D13S305 D16S2621

D18S535 D21S1411

D15S659

D13S628

Vedere l’Appendice 2 per ulteriori dettagli sui marker STR inclusi gli intervalli delle dimensioni.



APPENDICE 2: - Tabella della posizione del marker, eterozigosità osservata, intervallo

delle dimensioni alleliche

Note: Il colorante NED utilizzato nei kit viene identificato a livello spettrale come colorante giallo.

Convenzionalmente per chiarezza viene visualizzato in nero.

Marker Posizione Eterozigosità

osservata*

Intervallo

dimensioni alleli

(bp)

Colorante del

marker

D13S305 13q13.3 0.79 453-504. verde

D13S325 13q14.11 0.80 292-343 verde

D13S634 13q21.33 0.84 396-453 blu

D13S628 13q31.1 0.75 451-499 giallo

D15S822 15q12 0.86 247-308 rosso

D15S659 15q21.1 0.86 395-441 giallo

FESFPS 15q25.2 0.61 202-243 rosso

D15S1515 15q26.3 0.81 181-209 verde

D16S753 16p11.2 0.77 442-477 rosso

D16S2624 16q22.3 0.71 110-140 blu

D16S2621 16q23.2 q24.2 0.79 268-308 giallo

D16S539 16q24.1 0.76 130-166 verde

D18S1002 18q11.2 0.76 343-380 blu

D18S819 18q11.2 0.73 401-435 rosso

D18S535 18q12.3 0.77 462-503 blu

D18S386 18q22.1 0.92 353-440 verde

D21S11 21q21.1 0.82 234-283 blu

D21S1437 21q21.1 0.76 291-332 blu

D21S1442 21q21.3 0.85 328-394 rosso

D21S1411 21q22.3 0.83 319-389 giallo

D22S686 22q11.2 0.69 146-199 giallo

D22S685 22q11.23 0.77 222-264 verde

D22S689 22q12.1 0.74 209-254 giallo

D22S683 22q12.3 0,87 152-223 blu

AMEL Xp22.22 Yp11.2 n/a 104…110 nk giallo

TAF9 3p24.2 Xq21.1 n/a 116…121 nk giallo

SRY Yp11.31 n/a 124-145 giallo

*Le eterozigosità osservate si basano sul numero di alleli osservati con il pannello di convalida di

Elucigene Diagnostics. Questi numeri potrebbero quindi differire dai dati pubblicati e potrebbero anche

variare in base alla popolazione analizzata.



APPENDICE 3: Profilo GeneMapper

Profilo normale GeneMapper per un individuo di sesso maschile che mostra le relative posizioni dei

marker rilevati da QST*R-PL



Limiti della procedura

Questo test è concepito per l’individuazione di specifiche trisomie cromosomiche e aneuploidie dei

cromosomi sessuali come riportato nelle Instructions for Use (Istruzioni per l’uso). Potrebbe non

individuare i riarrangiamenti strutturali che coinvolgono i cromosomi analizzati né le anomalie in ogni

altro cromosoma. Il mosaicismo potrebbe non essere individuato nei cromosomi analizzati. Un risultato

QST*R-PL può essere applicato direttamente solo al tessuto analizzato e potrebbe non rappresentare

il cariotipo fetale. La contaminazione da parte di cellule materne (Maternal cell contamination, MCC)

e il mosaicismo confinato alla placenta (Confined placental mosaicism, CPM) potrebbero dar luogo a

discrepanze tra i risultati QST*R-PL e i risultati del cariotipo.

Nota: Le eterozigosità dei marker utilizzati sono derivate da un set casuale di campioni inviati per le

analisi routinarie ottenuti da una popolazione in prevalenza caucasica dell’Europa settentrionale. Tutti

i calcoli in cui vengono utilizzate queste eterozigosità si applicano strettamente alla popolazione da cui

sono stati prelevati i campioni. Si può condurre un piccolo studio in cui si utilizzano i campioni derivati

dalla popolazione locale come parte di uno studio di convalida per stabilire le eterozigosità nella

popolazione da analizzare. Si ritiene che le variazioni nella popolazione non alterino in modo

significativo il grado di informazione complessivo del test.

Dichiarazione di non responsabilità

I risultati di questo test diagnostico devono essere interpretati congiuntamente agli altri dati clinici e di laboratorio a disposizione del medico. Questi reagenti Elucigene vengono forniti per l’esecuzione di test diagnostici In Vitro. Ulteriori dettagli sui prodotti Elucigene QST*R sono disponibili sul sito: www.elucigene.com.




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Deutsch S, Choudhury U, Merla G, Howald C, Sylvan A, Antonarakis SE. Detection of aneuploidies by

paralogous sequence quantification. Journal of Medical Genetics 2004 41: 908-915

ELUCIGENE e QST*R sono marchi commerciali di Delta Diagnostics (UK) Ltd.

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VIC, PET, NED, LIZ, POP-7 e HI-DI sono marchi commerciali di Life Technologies Corporation.

Nota per l’acquirente: Licenza limitata

Questo prodotto è venduto conformemente a un contratto stipulato con Life Technologies Corporation.

L'acquisto del prodotto trasmette all'acquirente il diritto non trasferibile di utilizzare esclusivamente la

quantità acquistata del prodotto e i suoi componenti per uso diagnostico in vitro, unicamente per

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all'ottenimento di diritti aggiuntivi per utilizzare il prodotto o i suoi componenti, contattare

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Goddijn%20M%5bAuthor%5d&cauthor=true&cauthor_uid=11023805

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