Elettroforesi su Elettroforesi su gel d’agarosiogel d’agarosio

Istituto M. MontessoriA.S. 2010/2011

Esperimento effettuato il 3/2/2011 dalla classe 4°As con la Prof.ssa Lucia Capasso

Realizzazione grafica di Andrea D’Eusebi

ELETTROFORESI SU GELELETTROFORESI SU GEL

Permette la separazione di frammenti di DNA/RNA Permette la separazione di frammenti di DNA/RNA da una miscela complessada una miscela complessa

E’ una E’ una tecnica fondamentaletecnica fondamentale per: per:

•l’l’analisianalisi (elettroforesi (elettroforesi analitica analitica))

•la la purificazionepurificazione degli acidi nucleici (elettroforesi degli acidi nucleici (elettroforesi preparativapreparativa))

-- ++

RNA e DNA sono RNA e DNA sono carichi negativamentecarichi negativamente

catodocatodo anodoanodo

Effetto “setaccio” in un gel uniformeEffetto “setaccio” in un gel uniforme

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++

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

L’L’agarosioagarosio è un è un polisaccaridepolisaccaride

costituito da residui alternati costituito da residui alternati

di di D-galattosD-galattosiioo e e 3,6-anidro-L-3,6-anidro-L-

galattosgalattosiioo..

Celle elettroforetiche

Coloranti

Etidio bromuro Siringhe da 1 ml

Generatori di corrente- pile alcaline 9v

MATERIALIMATERIALI

PREPARAZIONE GEL D’AGAROSIOPREPARAZIONE GEL D’AGAROSIO

Alla soluzione d’agarosioAlla soluzione d’agarosiosi aggiunge si aggiunge Etidio Bromuro

Si scioglie l’agarosio inSi scioglie l’agarosio inpolvere in una soluzione polvere in una soluzione tampone a 100°Ctampone a 100°C

Dopo la solidificazione del Dopo la solidificazione del gel si può rimuovere il gel si può rimuovere il

Pettine. Pettine.

45V 0,2A

tampone elettroforetico

generatore di corrente

Polo +

Polo -

gel di agarosio 1.2%

scatola elettroforetica

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

45V 0,2A

Polo +

Polo -

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

45V 0,2A

Polo +

Polo -

ON

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

45V 0,2A

Polo +

Polo -

ON

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

1. Prelevare il colorante con la pipetta

2. Inserire il colorante in uno dei pozzetti

3. Colorazione dei pozzetti

4. Cella pronta per elettroforesi

5. Prendere delle lamine di carbonio

6. Inserire le lamine di carbonio nella fessura

7. Attaccare i coccodrilli degli elettrodi sulle lamine di carbonio

8. Verificare dopo pochi secondi la presenza delle bollicine vicino l’anodo

Elettroforesi in corso, i colori migrano verso il polo positivo

Gli acidi nucleici a Gli acidi nucleici a singolo filamentosingolo filamento (come l’RNA) (come l’RNA) tendono a formare tendono a formare complesse strutture secondariecomplesse strutture secondarie, , pertanto la loro “corsa elettroforetica” è fortemente pertanto la loro “corsa elettroforetica” è fortemente influenzata dal modo in cui si ripiegano.influenzata dal modo in cui si ripiegano.

NB

L’RNA prima di essere separato per elettroforesi deveL’RNA prima di essere separato per elettroforesi deveessere prima essere prima denaturatodenaturato, al fine di mantenere le molecole, al fine di mantenere le molecolein forma in forma linearelineare

NB

ELETTROFORESI IN CONDIZIONI ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTIDENATURANTI

Agenti denaturanti comunemente usati: Agenti denaturanti comunemente usati: calore, calore, formaldeideformaldeide, , formammideformammide, , ureaurea

TUTTI AL LAVORO!TUTTI AL LAVORO!