Discriminazione Tra Due Punti

Laboratorio di Fisiologia Applicata

MISURA DEL POTERE RISOLUTIVO TATTILE

(DISCRIMINAZIONE DI DUE PUNTI) IN DIVERSE ZONE

DELLA CUTE DEL BRACCIO.

INTRODUZIONE

La discriminazione tattile fine, come per esempio la lettura del braille,

richiede di percepire come distinti gli stimoli tattili molto vicini tra di loro

nello spazio. Il potere risolutivo tattile o acuità tattile si può misurare

utilizzando il test di discriminazione di due punti che consiste appunto nel

riconoscere come distinti due stimoli tattili puntiformi applicati in due punti

della cute molto vicini tra loro. Per capire quali sono i fattori che determinano

l'acuità tattile ricordiamo brevemente le caratteristiche dei campi recettivi nelle

vie somatosensoriali che mediano il senso del tatto.

I recettori tattili sono meccanocettori posti nella pelle capaci di

convertire la deformazione meccanica della pelle in segnale elettrico. La parte

recettoriale è costituita dal terminale specializzato del neurone sensitivo

primario. Si tratta di un neurone a T il cui corpo cellulare si trova nei gangli

delle radici dorsali. Questi recettori, a seconda delle caratteristiche

morfologiche, prendono il nome di corpuscoli di Meissner e recettori di Merkel

(a localizzazione cutanea superficiale) e corpuscolo del Pacini e del Ruffini (a

localizzazione più profonda). La cute della mano, che è densamente innervata,

contiene da 15.000 a 20.000 meccanocettori. La densità dei recettori più

superficiali è di circa 100/cm2 sulla punta delle dita, tre o quattro volte più

bassa sul palmo della mano e quasi dieci volte più bassa sulla cute della spalla.

Le informazioni tattili captate dai meccanocettori vengono inviate alla

corteccia mediante la via colonne dorsali – lemnisco mediale. Tale via può

essere così schematizzata: i rami centripeti della fibre delle cellule dei gangli

delle radici dorsali entrano nel midollo spinale e ascendono ipsilateralmente

fino al bulbo dove contraggono sinapsi con i neuroni dei nuclei gracile e

cuneato (neuroni del secondo ordine). Gli assoni dei neuroni del secondo

ordine decussano e ascendono nel lemnisco mediale andando a contrarre

sinapsi con i neuroni del nucleo ventrale posteriore del talamo (neuroni del

terzo ordine). Le fibre del terzo ordine proiettano poi alla corteccia

somatosensoriale primaria dove è presente una mappa somatotopica della

superficie corporea. La mappa somatotopica (homunculus sensitivo) è

vistosamente distorta, con le regioni a più alta densità recettoriale (come la

mano ed il viso) più estesamente rappresentate rispetto a regioni fisicamente

più grandi (come il dorso), ma a più bassa densità recettoriale.

Il campo recettivo di una neurone del sistema somatosensoriale è

quell’area della pelle entro la quale una stimolo meccanico evoca una risposta.

Le fibre afferenti primarie hanno campi recettivi la cui stimolazione ha effetto

eccitatorio. La localizzazione e la dimensione di questi campi recettivi è

semplicemente determinata dalla localizzazione del terminale recettoriale

stesso e dalla sua sensibilità a stimoli applicati a distanze crescenti da esso. I

campi recettivi dei neuroni del secondo ordine sono invece più complessi e

ancora più complessi sono quelli della corteccia somatosensitiva. Infatti è

presente il fenomeno dell’inibizione laterale: i neuroni aumentano la loro

frequenza di scarica quando lo stimolo tattile è applicato al centro del campo

recettivo, ma diminuiscono la frequenza di scarica se lo stimolo è applicato

nella zona circostante.

Perché due punti di contatto vengano riconosciuti come distinti è necessario

che vengano stimolati due recettori tattili diversi. Ciò però non è sufficiente;

infatti la precisione con cui il punto stimolato viene localizzato sulla cute

dipende da due fattori:

1. il grado di convergenza rispetto all'ingresso dal recettori stimolati: più

alta è la convergenza, più imprecisa è la localizzazione. La convergenza

determina la grandezza del campo recettivo nella corteccia

somatosensitiva.

2. l'entità dell'inibizione laterale: più forte è l'inibizione laterale, più

precisa è la localizzazione. L’inibizione laterale determina l’entità

dell’inibizione periferica del campo recettivo nella corteccia

somatosensitiva.

Possiamo concludere dicendo che la discriminazione di due punti sarà migliore

in quelle zone della cute dove:

1. la densità recettoriale è più alta; infatti una piccola separazione fra i

due punti è sufficiente a collocarli su campi recettivi di recettori diversi.

2. il grado di convergenza è più basso.

3. l'inibizione laterale è ben sviluppata.

L’acuità tattile sarà quindi maggiore nelle zone che hanno una

rappresentazione corticale grande (mano, viso) rispetto a zone con

rappresentazione corticale più piccola.

ESECUZIONE DELLA MISURA DEL POTERE RISOLUTIVO

TATTILE

L'acuità tattile verrà misurata in cinque parti della cute del braccio: la

punta del dito indice, la falange del dito indice, il palmo della mano, il centro

dell'avambraccio e la cute del braccio subito sopra il gomito.

Per misurare l'acuità tattile si userà un semplice compasso. Si

posizioneranno le punte del compasso perpendicolari rispetto alla cute del

soggetto e si farà in modo di toccare la cute con le due punte

contemporaneamente mentre al soggetto sarà impedito di osservare la zona in

esame. Per ogni zona cutanea, l’acuità tattile verrà presa come l’inverso della

minima distanza tra le punte del compasso alla quale il soggetto è ancora in

grado di percepire di essere stato toccato in due punti separati.

Il metodo di misura utilizzato sarà quello detto “dei limiti”. Per ogni zona

cutanea, si effettueranno quattro serie di prove in cui la separazione delle

punte, inizialmente troppo piccola per essere percepita, viene aumentata di un

fattore fisso, fino a che il soggetto percepisce la doppia stimolazione per due

prove consecutive. Successivamente saranno effettuate quattro serie di prove in

cui la separazione, inizialmente abbastanza grande per essere ben percepibile,

viene diminuita di un fattore fisso fino a che il soggetto percepisce una

stimolazione singola per due prove consecutive. Per ogni serie di misure si

prenderà come minimo percepibile il primo valore della coppia consecutiva. Si

calcolerà quindi, per ogni zona cutanea, un valore medio di separazione

minima con il relativo errore standard.

Questi valori verranno utilizzati per costruire il grafico "acuità tattile verso

regione cutanea stimolata”.

SECONDA SIMULAZIONE IL MODELLO DI HODGKIN-HUXLEY DEL POTENZIALE DI AZIONE Il programma simula le proprietà attive di un assone secondo il modello di

Hodgkin-Huxley. L’assone è space-clamped, cioè la stimolazione non è

puntiforme, ma avviene simultaneamente in tutti i punti dell’assone stesso.

La simulazione può essere effettuata in due modi: normale e a voltaggio bloccato (clamped-voltage). Nel primo modo uno o due impulsi successivi di corrente, di definita ampiezza e durata, sono iniettati nell’assone e sono osservate le variazioni temporali di voltaggio, corrente ionica e conduttanza. Nel secondo modo il potenziale è bloccato a valori definiti per tempi definiti. E’ anche possibile variare il potenziale di membrana di partenza ( holding potential ). E’ possibile inoltre simulare l’effetto sia sul potenziale di azione che in condizioni di voltage-clamp dei farmaci inibitori di canali specifici ( TTX TEA ). La simulazione fornisce anche un modello che mostra un singolo canale del sodio ed un singolo canale di potassio le cui porte ( gates ) si aprono e chiudono in maniera probabilistica, associato ad un grafico delle variabili di attivazione ed inattivazione ed alla simulazione di un esperimento di patch clamp sui canali di azione.

MECCANISMO DI BASE DEL POTENZIALE DI AZIONE ( FILE spike-1 ) Osservando attentamente la finestra dei parametri del sistema ( SYSTEM PARAMETERS ) vediamo che non siamo né in condizione di blocco del voltaggio né sono stati utilizzati inibitori dei canali ionici. Sono stati utilizzati due stimoli successivi. AVVIARE L’ESPERIMENTO INDIVIDUARE I VARI PARAMETRI IN FUNZIONE DEL TEMPO

INTENSITA’ DELLO STIMOLO IL POTENZIALE DI MEMBRANA LA CORRENTE DEL SODIO LA CORRENTE DEL POTASSIO LA CORRENTE TOTALE LA CONDUTTANZA DEL SODIO LA CONDUTTANZA DEL POTASSIO DOMANDA La fase di depolarizzazione del potenziale di azione presenta una gobba iniziale.

Spiegarne la causa.

MISURARE IL POTENZIALE AL PICCO DEL POTENZIALE DI AZIONE

MISURARE I VALORI DELLE CORRENTI DEL SODIO E DEL POTASSIO NELL’ISTANTE DEL PICCO

CALCOLARE I POTENZIALI DI EQUILIBRIO DALLE CONCENTRAZIONI IONICHE

DOMANDA Confrontare il valore del picco con i potenziali di equilibrio del sodio e del

potassio. Cosa determina il mancato raggiungimento da parte del potenziale di

azione del valore del potenziale di equilibrio del sodio?

Cosa si può dire a proposito delle correnti di sodio e potassio al momento del picco? MISURARE LE CORRENTI DI SODIO, POTASSIO E TOTALE IN UN ISTANTE QUALSIASI DURANTE LA FASE DI DEPOLARIZZAZIONE.

RIPETERE PER LA FASE DI RIPOLARIZZAZIONE

DOMANDA Quale corrente prevale durante la fase di depolarizzazione? E durante la fase di ripolarizzazione?

La corrente del sodio ha un andamento apparentemente

irregolare: quando la gNa comincia a diminuire, anche la corrente

diminuisce; tuttavia dopo poco riprende ad aumentare. Spiegarne

il perché.

La gNa rimane superiore alla gK per diverso tempo dopo il picco del potenziale di azione. Tuttavia la corrente del potassio è superiore a quella del sodio. Come mai? SOGLIA DI ECCITABILITA’ PROVARE A RIDURRE L’INTENSITA’ DELLO STIMOLO SENZA MODIFICARE ALTRO. ( SI CONSIGLIANO I SEGUENTI VALORI: 40, 30, 20, 10 µA ) AVVIARE L’ESPERIMENTO

DOMANDA Descrivere le differenze nella risposta rispetto a quella iniziale. ( intensità 50 µA ).

Individuare il possibile range di valori che include l’intensità

soglia.

CERCARE LA MINIMA INTENSITA’ DI STIMOLO NECESSARIA PER AVERE IL POTENZIALE D’AZIONE, MODIFICANDO L’INTENSITA’ DI STIMOLO DI 1 µA ALLA VOLTA, DOPO AVER INDIVIDUATO IL RANGE MINIMO DI VALORI CHE INCLUDE L’INTENSITA’ SOGLIA.

DOMANDA Qual è il valore del potenziale soglia ( utilizzare l’opzione misura )? ACCOMODAZIONE ( FILE accom-1 )

Osservare i system parameters, in particolare le caratteristiche di stimolazione. Notare che è utilizzato solo il secondo stimolo, di intensità di poco sopra la soglia. AVVIARE L’ESPERIMENTO

Constatare che si ha un potenziale d’azione normale dopo 7 ms dall’inizio dell’esperimento. USCIRE DAL DISPLAY DEI GRAFICI FISSARE UNA INTENSITA’ DI 1.5 µA PER IL PRIMO STIMOLO AVVIARE L’ESPERIMENTO USCIRE DAL DISPLAY DEI GRAFICI RIDURRE LA DURATA DEL PRIMO STIMOLO E L’INTERVALLO TRA I DUE STIMOLI A 3 ms AVVIARE L’ESPERIMENTO

DOMANDA Come si possono interpretare le risposte ottenute?

SOMMAZIONE ( FILE sum-1 )

Osservare le condizioni di stimolazione: l’esperimento consiste stavolta nello

stimolare con due stimoli sottosoglia ( 19 µA ) e di breve durata ( 0.25 µA ),

inviati a breve distanza l’uno dall’altro ( 2 ms ).

AVVIARE L’ESPERIMENTO TORNARE AL MAIN MENU AUMENTARE L’INTENSITA’ DEL SECONDO STIMOLO A 24 µA E L’INTERVALLO FRA GLI STIMOLI A 5 ms. DA NOTARE CHE STAVOLTA LO STIMOLO è SOPRA SOGLIA. MODIFICARE IL TIMEBASE DA 10 ms a 30 ms

DOMANDA Nel primo esperimento il primo stimolo non dà potenziale d’azione, mentre il

secondo, nonostante sia identico al primo, induce uno spike. Come mai?

Nel secondo esperimento nonostante il secondo stimolo sia stavolta sopra soglia, esso non induce affatto al potenziale d’azione. Perché? PERIODO REFRATTARIO

( FILE refr-1 )

Osservare le condizioni di stimolazione: si danno due stimoli di

diversa intensità di cui il secondo in pieno periodo refrattario

relativo.

AVVIARE L’ESPERIMENTO

TORNARE AL MAIN MENU

DARE DUE STIMOLI UGUALI ED AMPIAMENTE

SUFFICIENTI A GENERARE POTENZIALE DI AZIONE,

DISTANTI 20 ms. ( si consiglia una intensità di 50 µA ).


Si possono osservare due spike distanti per l’appunto 20 ms.

RIDURRE L’INTERVALLO TRA I DUE STIMOLI A 2 ms



AUMENTARE L’INTERVALLO TRA I DUE STIMOLI A 9

ms



AUMENTARE L’INTENSITA’ DEL SECONDO STIMOLO A

150 µA


DOMANDA

Comparare i due potenziali ottenuti, in particolare misurare i

seguenti parametri: picco del potenziale, e valori massimi di gNa e

gK.

Nel secondo potenziale si osserva una gobba durante la fase di

depolarizzazione più alta che nel primo. Come si può interpretare

questa differenza?


RIDURRE L’INTERVALLO TRA I DUE STIMOLI A 2 ms


DOMANDA

Sulla base di questo gruppo di osservazione dare una definizione

di periodo refrattario assoluto e relativo.

EFFETTO DELLE CONCENTRAZIONI IONICHE SUL POTENZIALE

D’AZIONE

( FILE spike-1 )

VARIAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DEL SODIO


USCIRE DAL DISPLAY DEI GRAFICI ( ESC )

RIDURRE LA CONCENTRAZIONE ESTERNA DI Na A 150

mM

CALCOLARE IL NUOVO VALORE DEL POTENZIALE DI

EQUILIBRIO DEL SODIO

AVVIARE DI NUOVO L’ESPERIMENTO

DOMANDA

Misurando il valore del potenziale al picco del potenziale d’azione

si può spiegare l’effetto che ha avuto la riduzione della

concentrazione esterna del sodio.

VARIAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DEL POTASSIO


RIPORTARE LA CONCENTRAZIONE ESTERNA DEL

SODIO A 418 mM

AUMENTARE LA CONCENTRAZIONE ESTERNA DI K A

30 mM

CALCOLARE IL NUOVO VALORE DEL POTENZIALE DI

EQUILIBRIO DEL k


EFFETTO DEL TRATTAMENTO CON TEA E TTX

( FILE spike-1 )


USCIRE DAL DISPLAY DEI GRAFICI ( ESC )

APPLICARE AL SISTEMA IL FARMACO TTX


DOMANDA

Con l’opzione MODEL si vedrà come una molecola blocca il

canale specifico.

Confrontando i due tracciati come si spiega l’andamento della

curva?


APPLICARE AL SISTEMA IL FARMACO TEA


BLOCCO DEL VOLTAGGIO ( VOLTAGE-CLAMP )

( FILE vccp-1)

Osservare attentamente la finestra dei parametri del sistema

(system parameters); in particolare si noti che siamo in condizioni

di blocco del voltaggio ( voltage-clamp on ), con potenziale di

partenza (holding potential) di –70 mV ed un potenziale di blocco

di – 40 mV. Si noti inoltre che nella sezione dei “trace display” è

selezionata la corrente totale, la corrente del sodio e quella del

potassio, e le conduttanze.

MODIFICARE IL CLAMP POT DA –40 a –10 mV

MANTENERE SELEZIONATA SOLO LA CORRENTE

TOTALE

Si simula in tal modo un esperimento in cui il voltaggio è bloccato

a –10 mV e si misura la corrente ionica totale che attraversa la

membrana durante il periodo di blocco.


DOMANDA

Descrivere il tracciato della corrente totale. Qual è il massimo valore della corrente diretta verso l’interno? E di quella diretta verso l’esterno? ( utilizzare l’opzione misura ). TORNARE AL MAIN MENU [C] SELEZIONARE IL TRATTAMENTO CON TTX AVVIARE L’ESPERIMENTO

DOMANDA Paragonare la corrente con quella registrata in assenza di farmaci. Sapendo che il TTX blocca i canali del sodio, che conclusioni se ne traggono? TORNARE AL MAIN MENU [C] SELEZIONARE IL TRATTAMENTO CON TEA


DOMANDA

Paragonare la corrente con quella registrata in assenza di farmaci. Sapendo

che il TEA blocca i canali del potassio, che conclusioni se ne traggono?

SELEZIONARE LE CORRENTI DEL SODIO E DEL POTASSIO.

SELEZIONARE LE CONDUTTANZE


DOMANDA

Notare che l’andamento delle conduttanze è simile a quello delle correnti.

Spiegarne il perché.

POTENZIALE DI INVERSIONE

( FILE vccp-2 )

CAMBIARE IL POTENZIALE DI BLOCCO ( CLAMP POT ) DALLO

ZERO FINO A VALORI FORTEMENTE POSITIVI.

(segui il grafico allegato)

MISURARE OGNI VOLTA IL VALORE MASSIMO DELLA

CORRENTE DEL SODIO.

COSTRUIRE UN GRAFICO DELLA CORRENTE MASSIMA DEL

SODIO IN FUNZIONE DEL POTENZIALE DI BLOCCO.

MISURARE IL POTENZIALE DI EQUILIBRIO DEL SODIO

DOMANDA

L’intercetta sull’asse delle x di questo grafico rappresenta il potenziale di

inversione della corrente. Confrontare il potenziale di inversione trovato

con il potenziale di equilibrio del sodio. Cosa si può dire a riguardo?

PRIMA SIMULAZIONE

EQUAZIONE DI GOLDMAN E POTENZIALE DI MEMBRANA A RIPOSO Questa simulazione calcola il potenziale di membrana a riposo di un neurone, in

base ai valori delle concentrazioni, interna ed esterna, e delle permeabilità dei

principali permeanti:

SODIO, POTASSIO E CLORO.

La simulazione non include il contributo della pompa elettrogenica Na-K al

potenziale di membrana e permette di decidere sul contributo degli ioni cloro

al potenziale di membrana, potendo scegliere se gli ioni cloro sono distribuiti

passivamente ( all’equilibrio ) o attivamente. Inoltre si assume che i canali

ionici non siano voltaggio-dipendenti.

Variando o le concentrazioni o la permeabilità di un determinato

ione, il programma consente di valutare le conseguenti variazioni

del potenziale di membrana.

A.

CONDIZIONI DI PARTENZA:

POTENZIALE DI MEMBRANA BASALE

Situazione di un assone tipico a riposo, con sodio e cloro più

concentrati all’esterno e potassio in concentrazione maggiore

all’interno della cellula.

I RAPPORTI DI PERMEABILITA’ SONO I SEGUENTI:

K>>Cl>Na.

Il cloro è distribuito attivamente e quindi contribuisce anch’esso

al potenziale di membrana.

Il programma fornisce i valori del potenziale di equilibrio per i tre

ioni e quello del potenziale di membrana.

RIPORTARE IN TABELLA IL POTENZIALE DI

MEMBRANA

MISURARE I POTENZIALI DI EQUILIBRIO DEGLI IONI

E RIPORTARLI IN TABELLA

TRASCRIVERE I VALORI DELLE CONDUTTANZE DEL

SODIO E POTASSIO

TRASCRIVERE IL TIPO DI DISTRIBUZIONE DEL CLORO

B.

EFFETTO DELLE VARIAZIONI DELLE

CONCENTRAZIONI DI K+

AUMENTARE LA CONCENTRAZIONE ESTERNA DI K+ 20

mM a 200 mM

TRASCRIVERE IN TABELLA I VALORI DELLE

CONDUTTANZE DI Na E K

( SYSTEM PARAMETERS )

TRASCRIVERE IL TIPO DI DISTRIBUZIONE DEL Cl


MISURARE I VALORI DI POTENZIALE DI EQUILIBRIO

DELLO IONE K

MISURARE IL POTENZIALE DI MEMBRANA

DOMANDA

Da questo risultato si può capire come erroneamente il potenziale

di membrana sia stato interpretato in un primo momento come il

potenziale di equilibrio per il potassio. Sei in grado di dare una

spiegazione del fenomeno tenendo presente l’equazione di

Goldman?

C.


CONCENTRAZIONI DI Na+

RIPORTARE LA CONCENTRAZIONE ESTERNA DEL K

DA 200 mM a 20 Mm

( SQUID VALUES)

DIMINUIRE QUELLA DEL Na DA 440 mM a 200 mM

TRASCRIVERE IN TABELLA IL VALORE DELLE

CONDUTTANZE DI Na e K

TRASCRIVERE IL TIPO DI DISTRIBUZIONE DEL Cl


MISURARE I L VALORE DI POTENZIALE DI

EQUILIBRIO DELLO IONE Na


DOMANDA

Il potenziale di membrana è variato poco rispetto al potenziale

basale ed anche rispetto alla variazione che invece si è avuta

variando le concentrazioni del potassio. Perché?

D.


CONCENTRAZIONI DI Cl

RIPORTARE LA CONCENTRAZIONE ESTERNA DEL Na

DA 200 a 440 Mm

( SQUID VALUES)

DIMINUIRE QUELLA DEL CLORO DA 560 a 200 Mm

TRASCRIVERE IN TABELLA IL VALORE DELLE

CONDUTTANZE DI Na e K

RIPORTARE IL TIPO DI DISTRIBUZIONE DEL Cl





DOMANDA

Perché per ottenere lo stesso tipo di variazione del

potenziale di membrana devo o diminuire la

concentrazione esterna del cloro o aumentare quella del

potassio?

E.

DISTRIBUZIONE PASSIVA DEL CLORO

RIPORTARE LA CONCENTRAZIONE ESTERNA DI

CLORO DA 200 a 560 Mm

( SQUID VALUES)

SELEZIONARE LA DISTRIBUZIONE PASSIVA DEL

CLORO


CONDUTTANZE DI Na e K ED IL LORO RAPPORTO


MISURARE IL VALORE DI POTENZIALE DI



DOMANDA

Variando il tipo di distribuzione del cloro perché ne cambia la

concentrazione interna?

F.

EFFETTO DEL RAPPORTO FRA LE CONDUTTANZE

DEL Na+ E K+

1. VARIAZIONE DELLA CONDUTTANZA DEL POTASSIO

AUMENTARE LA CONDUTTANZA DEL K DA 8 A 40 µS







2. VARIAZIONE DELLA CONDUTTANZA DEL SODIO

RIDURRE LA CONDUTTANZA DEL POTASSIO AL

VALORE ORIGINARIO 8 µS

( SQUID VALUES)

AUMENTARE LA CONDUTTANZA DEL SODIO DA 0.32 A

90 µS







DOMANDA

Come è cambiato il potenziale di membrana? Cosa si può dire sui

potenziali di equilibrio degli ioni?

TABELLA DATI

A B C D E F1 F2

E m

E K

E Na

E Cl

DIST.Cl

gNa

g K

gNa/gk

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