Paglia Maria Grazia Paglia Maria Grazia

INMIINMI--Lazzaro SpallanzaniLazzaro Spallanzani

Diagnostica di laboratorio della tubercolosi: le antiche certezze e le nuove frontiereIl laboratorio di MicrobiologiaIl laboratorio di Microbiologia

26 novembre 201126 novembre 2011Co.Pr. CRICo.Pr. CRI--RomaRoma

L’analisi fenotipica (caratteri colturali e biochimici)

e genotipica (regioni conservate)

ci consente di identificare circa130 specie nel genere

Mycobacterium

Mycobacterium tuberculosis complex e

Micobatteri non tubercolari (MNT)*

� patogenicità

� habitat

� contagiosità

� sensibilità ai chemioterapici

*L’acronimo MOTT (Mycobacteria other than tuberculosis) è meno usato

Identificazione dei MicobatteriIdentificazione dei Micobatteri

RACCOMANDAZIONI GENERALI

• Ogni test e procedura relativa deve essere eseguita dapersonale adeguatamente formato

• Seguire le Standard Operating Procedures (SOPs) interne

• Svolgere i test in laboratori equipaggiati

• Partecipare a “Controllo di Qualità” nazionale ed internazionale

La tubercolosi è causata da Mycobacterium tuberculosiscomplex (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. caprae, M. pinnipedii, M. microti e M. canettii)

Mycobacterium bovisMycobacterium bovis BCG BCG e Mycobacterium microtiMycobacterium microti causano malattia occasionalmente

La diagnosi microbiologica di tubercolosi o di micobatteriosi richiede un campione biologico in cui:

� rilevare la presenza di micobatteri

� isolarli ed identificarli

� determinarne la sensibilità agli antimicobatterici.

L’attendibilità dei risultati dipende dalle modalità con cui i campioni sono stati raccolti, conservati e trasportati.

Il laboratorio deve fornire istruzioni operative per la raccolta, la conservazione e il trasporto dei campioni.

Tipo di campione Requisiti Istruzioni speciali Campioni non idonei

Aspirato gastrico ≥ 5-10 mL raccolto al mattino, dopo almeno 8 ore di digiuno, per 3 giorni consecutivi

neutralizzare (pH 7) con carbonato di sodio

campioni non neutralizzati

Broncoaspirato, lavaggio bronco-alveolare, spazzolatura bronchiale, aspirato trans-tracheale

≥ 3 mL disinfettare accuratamente il broncoscopio

Espettorato 5-10 mL raccolto al mattino da espettorazione profonda, per 2-3 giorni consecutivi

istruire il paziente su come espettorare correttamente

saliva; pool di campioni

Espettorato indotto 5-10 mL raccolto al mattino, per 3 giorni consecutivi

specificare chiaramente nella richiesta, e sul contenitore, che si tratta di espettorato indotto

Feci almeno 1 g in contenitore senza conservanti

per la diagnosi di tubercolosi intestinale ricorrere al prelievo bioptico

Linfonodo linfonodo o porzione di esso in contenitore sterile, senza fissativi o conservanti

aggiungere una piccola quantità di fisiologica sterile

campioni in formalina o altri fissativi; campioni inclusi in paraffina

Procedure operative per la raccolta dei campioni biologici (I)

Tipo di campione Requisiti Istruzioni speciali Campioni non idonei

Liquidi cavitari: pleurico, pericardico, peritoneale ecc.

10-15 mL in provetta sterile (con eparina o citrato)

per la diagnosi di pleurite tubercolare sono piùindicati biopsia pleurica ed espettorato indotto

Liquor ³ 2 mL

Materiale da lesioni cutanee

la massima quantitàpossibile

utilizzare tamponi senza terreno di trasporto solo se non è possibile eseguire il prelievo con siringa o biopsia

tamponi con terreno di trasporto

Materiali necrotico-ascessuali

la quantità massima possibile in siringa con copriago

se non è possibile usare la siringa utilizzare piùtamponi ed inserirli in un contenitore sterile con una piccola quantità di fisiologica sterile

Midollo emopoietico la massima quantitàpossibile, direttamente nel flacone da emocoltura, o in provetta con eparina, o in provetta Isolator

campione coagulato; campione in provetta con EDTA

Procedure operative per la raccolta dei campioni biologici (II)

Tipo di campione Requisiti Istruzioni speciali Campioni non idonei

Prelievi tissutali e biopsie almeno 1 g di tessuto in contenitore senza fissativi o conservanti

aggiungere una piccola quantità di fisiologica sterile

campioni in formalina o altri fissativi; campioni inclusi in paraffina

Sangue mestruale alcuni mL, raccolti al 2°-3°giorno del flusso mestruale, in provetta con eparina

sangue coagulato

Sangue periferico direttamente nel flacone da emocoltura, o in provetta con eparina od in provetta Isolator

sangue coagulato; sangue in provetta con EDTA

Urine la prima urina del mattino ottenuta anche mediante cateterizzazione (almeno 50 mL)

un campione in 3 giorni consecutivi; il mitto intermedio è sconsigliato

urine delle 24 ore; urine da sacca; volumi inferiori a 50 mL

Procedure operative per la raccolta dei campioni biologici (III)

Conservazione e trasporto dei campioni biologici:

� conservare il campione a 4°C , non congelare

� spedire secondo le modalità previste dalla Circolare del Ministero della Sanità N° 16del 20/07/1994.

MICROSCOPIAPos

• Rapido• Poco costoso• Specificità > 95%• Ottimo test per il controllo della TB in Paesi ad alta incidenza

Neg• Non permette l’identificazione di specie• Non fornisce informazioni sulla vitalità dei micobatteri• Sensibilità 25-65%• Anche dopo tecniche di concentrazione del campione biologicola soglia di positività rimane alta (1.000-10.000 batteri/ml)

• La sensibilità aumenta con il numero dei campioni esaminati

1° diretto AAR 80-82%

2° diretto AAR 10-14%

3° diretto AAR 5-8%

Definizione di caso (Microscopia)

Secondo OMS (2007): “Soggetto con almeno 1 vetrino positivo (1 bacillo è sufficiente) su un totale di due esaminati”.

Tale definizione è applicabile a Paesi assistiti da un buonsistema di controllo qualità.

COLTURA: IL “GOLD-STANDARD”Pos

• E’ il test di riferimento• Richiede 10-50 micobatteri vivi• Comporta un aumento dei casi di TB rilevati (30-50%)• Diagnosi definitiva di TB• Punto di partenza per i saggi di sensibilità ai farmaciNeg

• Tempi lunghi di risposta (6-8 settimane se negativo)• Alto livello di bio-sicurezza: per colture da campione BSL2,per antibiogrammi BSL3

Gli attuali standard internazionali raccomandano l’uso di due terreni (terreno liquido e terreno solido) per l’isolamento dei micobatteri da campioni biologici.

Terreni allTerreni all’’uovo: uovo: LLööwensteinwenstein--JensenJensenContengono uova fresche, fecola di patate, sali e glicerolo, preparati a becco di clarino, in provette con tappo a vite, e fatti solidificare per coagulazione al calore. Contengono come inibitore della flora residente verde di malachite (0,025%).

Terreni liquidi: Terreni liquidi: Mycobacterial Growth Indicator Tube (MGIT) Mycobacterial Growth Indicator Tube (MGIT) Consentono un rilevamento più sensibile e precoce della crescita rispetto ai terreni solidi. Abbreviano sensibilmente i tempi della coltura (15-20 giorni).

Test Immunocromatografici perl‘identificazione di M.tuberculosis complex

• Semplici da eseguire e rapida risposta (15 minuti)• Rilevano l’antigene MPB64 specifico per TB complex• Antigene trattenuto da un anticorpo monoclonale anti-MPB64

• Non richiedono strumentazioni particolari• Sensibilità del 100% (da coltura)

Metodi Molecolari (Nucleic acid Amplification test, NAAT) per la ricerca e l’identificazione dei Micobatteri

(campione biologico e coltura)

�Identificazione attraverso test commerciali:- Ibridazione in fase liquida

Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test (MTD), Gen-Probe

- Ibridazione in fase solidaInnoLipa, InnogeneticsGenoType Mycobacterium, Hain Diagnostika

- PCRCobas Amplicor, Roche

- Strand Displacement Amplification (SDA)BD ProbeTec ET assay (Becton Dickinson)

- Real Time�Identificazione attraverso test “in-house”�Identificazione attraverso analisi di restrizione (PRA)�Identificazione per sequenziamento

Tutti i metodi molecolari necessitano di DNA estratto

PCR real timeVantaggi:• Rapidità• Ampio range di quantificazione del target• Riduzione della contaminazione• Alta sensibilità intesa come piu basso limite di detection

American Thoracic Society. Am.J.Respir.Crit.Care Med.2000

Campioni di materiale respiratorio con batterioscopico positivoSENSIBILITA’ 95% SPECIFICITA’ 98%

Campioni di materiale respiratorio con batterioscopico negativoSENSIBILITA’ 48-53% SPECIFICITA’ 95%

Amplificazione genica, alternativa all’esame:

Microscopico ? Colturale ?

Vantaggi

-Sensibilità superiore-Specificità di specie

Svantaggi

-Esecuzione complessa -Costo elevato

Vantaggi

-Molto più rapida-Positiva rende superflua l’identificazione-Contaminazione indipendente

Svantaggi

-Non altrettanto sensibile-Non rivela i MNT-False negatività/positività-Costo elevato/esecuzione complessa-Non DST

M. tuberculosis: le resistenze

• Dovute esclusivamente a mutazioni cromosomiche

• Mutazioni responsabili di resistenze si verificano spontaneamente confrequenza variabile, a seconda dei farmaci, fra 1/106 e 1/108

• La resistenza è il risultato della selezione dei mutanti resistenti, a seguitodi mono-terapie o per difetto di compliance

• L’uso di almeno due farmaci abbassa la probabilità di comparsa di resistenze a livelli inferiori al numero di bacilli normalmente presenti in unasingola lesione (108 - 1010 UFC)

•• Una resistenza si definisce Una resistenza si definisce primariaprimaria quando quando èè gigiàà presente nel presente nel ceppo responsabile dellceppo responsabile dell’’infezioneinfezione

•• Una resistenza si definisce Una resistenza si definisce secondariasecondaria quando insorge durante laquando insorge durante laterapiaterapia

Un ceppo di M. tuberculosis viene comunemente definito multidrug-resistant (MDR) quando è resistente ad almeno isoniazide e rifampicina

Un ceppo di M. tuberculosis viene definito XDR (extensively drug-resistant) quando èresistente ad isoniazide e rifampicina + un fluorochinolone ed almeno un farmaco diseconda linea iniettabile

� Metodi fenotipici: valutazione della crescita in coltura in terreni con e senza farmaco

• Bilancio costo-efficacia buono• Facili da eseguire ma poco standardizzabili• Risultati disponibili in settimane/mesi

� Metodi molecolari: (identificazione delle mutazioni responsabili di resistenza)

• Generalmente costosi• Non richiedono ceppi vivi• Disponibilità di risultati entro ore• Più complicati da eseguire, e con relativamente pochifarmaci testabili

LINE PROBE ASSAY (LIPA)TEST DI IBRIDAZIONE INVERSA

� su un supporto di nitrocellulosa sono immobilizzati oligo-probes� una miscela di primers marcati con biotina amplificano target di DNA� l’ibridazione tra amplificato e probe è evidenziato da un segnale visibile

� Vengono identificate le più comuni mutazioni che conferiscono resistenza afarmaci di I e II linea

� Permette di definire casi di MDR ed XDR� Semplice da eseguire

MA

• Numero limitato di sonde• Possibilità di errore nell’interpretazione• Richiesto laboratorio BSL2

Genotype MTBDRplus (Hain Lifescience) farmaci I LINEA (rifampicina, isoniazide)

Genotype MTBDRsl (Hain Lifescience)farmaci II LINEA (fluorochinolonici, kana/amikacina, etambutolo)

GeneGene--Xpert System (Cepheid)Xpert System (Cepheid)

Real-Time PCR per la diagnosi di M. tuberculosis complex e sensibilità alla rifampicina

Resistenza alla Rifampicina = “gold target”

• Key-drug per il regime di trattamento• la resistenza alla RIF è il marcatore surrogato per TB-MDR, 80-95% of ceppi RIF-resistenti sono anche INH-resistenti• le mutazioni sono concentrate in una regione di 81 paia di basi“hotspot” del gene rpoB

Candidato ottimale per la diagnosi molecolare di resistenza al farmaco

• Closed reaction tube

• Use proprietary dried reagent technology

• Utilize dedicated of cartridges

• Proprietary filter capture/lysis

technology, purification resins, integrated

ultrasonics

• Total internal control of reagent system

• Automated data reduction and results

interpretation•sputum and other samples•simple 1-step external sample prep. procedure•time-to-result < 2 h•no need for biosafety cabinet•integrated controls

•specific for MTB•sensitivity similar to culture•detection of rif-resistance via rpoB gene•~1 day technician training for nonmycobacteriologists

GeneXpert® system

� Automated sample processor and quantitative thermal cycler� Single-use, disposable cartridges

Boheme at al, NJM 2010

Xpert MTB Quality Controls

•• SampleSample--processing control (SPC) processing control (SPC) — Ensures the sample was

correctly processed.

•• Internal control (IC) Internal control (IC) —Verifies the performance of the PCR

reagents and assesses the presence of sample inhibitors.

SPC and IC should be positive in a negative sample and can be

negative in a high-positive sample.

•• Probe check Probe check —Before the start of the PCR reaction System

measures the fluorescence signal from the probes to monitor

bead re-hydration, reaction-tube filling, probe integrity and dye

stability.

Xpert MTB/RIF Analytical Studies

• Analytical Sensitivity of approximately approx 150 cfu/ml (Smear 10,000 cfu/ml)

• Specificity tested with high concentrations of MOTT (Mycobacteria OtherThanTuberculosis)

• No evidence of amplicon cross-contamination

• Perfect score on QCMD TB Proficiency Panel

• Mutation detection capability confirmed with isolate DNA and artificial targets having a global frequency reported at > 0.005

Recommended use of Xpert MTB/RIF

• The Xpert MTB/RIF Assay is intended for rapid detection of M. tuberculosis complex and rifampicin resistance in adult patients in respiratory specimens with clinical suspicion of tuberculosis

• The assay can be use on smear-positive and smear-negative samples

• The assay is a semi-quantitative in-vitro diagnostic test

• The Xpert MTB/RIF assay is not intended for use in treatment monitoring

Amplification plot – TB

positive/Rif sensitive

Amplification plot – TB not

detected

A Colture

positive

Colture

negative

Xpert MTB

presente

22 2

Xpert MTB

assente

0 5

Xpert MTB/RIFXpert MTB/RIFIdentificazione di M. tuberculosis complex (A) e sensibilitIdentificazione di M. tuberculosis complex (A) e sensibilitàà alla Rifampicina (B) alla Rifampicina (B)

in campioni respiratoriin campioni respiratori

Identificazione di M. tuberculosis complex (A) e sensibilitIdentificazione di M. tuberculosis complex (A) e sensibilitàà alla Rifampicina (B) alla Rifampicina (B)

in campioni non respiratoriin campioni non respiratori

B Colture

positive

Colture

negative

Xpert RIF

sensibile

18 2

Xpert RIF

resistente

4 0

A Colture

positive

Colture

negative

Xpert MTB

presente

2 2

Xpert MTB

assente

0 3

B Colture

positive

Colture

negative

Xpert RIF

sensibile

2 2

Xpert RIF

resistente

0 0

Identificazione di M. tuberculosis complex (A) e sensibilità alla Rifampicina (B)

di colture in terreno solido LJ (7 campioni) e liquido MGIT (5 campioni)

A Colture

positive

Colture

negative

Xpert MTB

presente

11 0

Xpert MTB

assente

1 0

B Colture

positive

Colture

negative

Xpert RIF

sensibile

11 0

Xpert RIF

resistente

0 0

AnyplexTM plus MTB/NTM Detection (Seegene)AnyplexTM plus MDR-TB Detection (Seegene)

� Real-time detection of MTB, NTM and DR-TB (DR-TB; INH-R, RIF-R)� Simultaneous screening of 6 mutation sites (INH-R) and 15 mutation sites

(RIF-R)� Various specimen (Sputum, Culture, Fresh tissue)