Diagnosi di infezione da virus

Dengue:

il ruolo del laboratorio

Licia Bordi

Laboratorio Virologia

FLAVIVIRUS

Dengue

West Nile

Encefalite Giapponese

Febbre Gialla

Zika

Usutu

Foresta di Kyasanur

Alkhurma

Omsk

Encefalite trasmessa

da zecca (TBE)

Famiglia: Flaviviridae

Genere: Flavivirus

� Genoma: ssRNA(+)

Dengue Virus (DENV)

4 sierotipi antigenicamente differenti

Denv-1 Denv-2 Denv-3 Denv-4

� DENV è trasmesso all’uomo attraverso la puntura di una zanzara infetta. Una volta che l'insetto viene infettato da uno dei virus della dengue, lo rimane per tutta la vita ed è in grado di trasmetterlo dopo 8-10 giorni d' incubazione.

3

4

1

2

http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/08051999/00004/dengue_phf/sld006.htm

3

Ciclo di trasmissione

� DENV è iniettato in circolo durante il pasto di sangue, con spillover nell’epidermide e nel derma (infezione cellule dendritiche e cheratinociti). Le cellule infette migrano nei linfonodi e l’infezione èdiffusa attraverso il sistema linfatico

Sindromi Cliniche da Dengue :Classificazione WHO - 2009

Ampio spettro di manifestazioni clinicheIl periodo di incubazione è di 2-7 giorni.

Febbre Dengue Dengue severa

Infezione secondaria da

sierotipo differente

• Sanguinamenti locali di varia entità; petecchie•Sindrome emorragica• Grave compromissione degli organi•Sindrome da Shock

• febbre • mal di testa • dolori muscolari e articolari • rash cutaneo • dolore retro-orbitale

Negli ultimi 50 anni, l’incidenza èaumentata di circa 30 volte

Casi di Dengue riscontrati all’INMI “L. Spallanzani” nel 2009-2012 in viaggiatori provenienti da zone endemiche

11

1

1

1

2

1

1

7

1

1

3

3

� Dei 30 casi con PCR positiva, 10 erano Den-1( ), 6 Den-2 ( ), 6 Den-3 ( ), 3 Den-4 ( ), 5 non caratterizzati

1

Dengue in Promed, ultimi 6 mesi del 2014: 1678 allerte

Metodi indirettiELISAImmunofluorescenza indiretta (IFA)Test di microneutralizzazione

Diagnosi di infezione da DENV

Metodi diretti

Ricerca di RNA virale Ricerca di antigeni viraliIsolamento virale

METODI DIRETTI 1: Isolamento Virale (BSL3)

Vero E6 CPEVero E6 Mock

C6/36 e AP61 (cellule di zanzara):C6/36 e AP61 (cellule di zanzara):Sono le linee cellulari più permissive per la crescita del virus; non si osserva

però Effetto Citopatico (CPE) per cui la presenza di virus viene evidenziata mediante RT-

PCR sul terreno di coltura prelevato 6gg dopo l’infezione oppure

mediante anticorpi monoclonali sierotipo-specifici)

Vero E6 e LLCVero E6 e LLC--MK2(cellule di rene di scimmia):MK2(cellule di rene di scimmia):meno permissive; ma una volta isolato

il virus, si osserva un chiaro CPE

Inoculo intracranico nel topo neonatoInoculo intracranico nel topo neonato

Su quali campioni biologici?

•Sangue intero •Siero o plasma•urine•Tessuti (fegato, milza e altri tessuti)

METODI DIRETTI 2: Rilevazione dell’antigene

Su quali campioni biologici?Siero o plasmaSangue intero

Saggi basati sulla rilevazione NS1:� glicoproteina altamente conservata prodotta sia in forma associata alla membrana che in forma solubile

� fortemente immunogenica; stimola anticorpi con attività fissante il complemento

� presente in elevate concentrazioni nel siero di pazienti infetti in fase acuta molto precocemente (1-9gg dopo comparsa sintomi)

� Saggi ELISA

� Test rapidi immunocromatografici

Pos Neg

Comparazione di tre saggi commerciali per la cattura dell’antigene NS1

PLoS Negl Trop Dis. 2010 Jul 6;4(7):e738

� Pannello di 450 sieri di cui 220 positivi al Dengue e 230 negativi�pan-E rileva con > efficienza Den-2; Platelia il Den-1; STRIP ha la stessa efficienza di rilevazione per Den-1 e-2 ; tutti e tre i test rilevano con < efficienza Den-3�Si osserva per alcuni kit cross-reattività con altri virus (vedi tabella)

Comparazione di tre saggi commerciali per la cattura dell’antigene NS1

PLoS Negl Trop Dis. 2010 Jul 6;4(7):e738

� Sieri positivi all’isolamento virale sono rilevati meglio da tutti e tre i test rispetto ai positivi in PCR� STRIP ha una maggiore efficienza nel rilevare sia infezioni primarie che secondarie; Platelia rileva meglio infezioni primarie rispetto alle secondarie; pan-E ha la minore efficienza di rilevazione per entrambi le infezioni�L’utilizzo di kit basati sulla rilevazione dell’antigene NS1 in combinazione con IgM MAC-ELISA potrebbe essere ottimale

METODI DIRETTI 3: Rilevazione dell’antigene o dell’RNA

Immunoistochimica:� Gli antigeni possono essere visualizzati in sezioni di

tessuto usando anticorpi monoclonali marcati

•Fegato: depositi granulari cell di Kupffer e endotelio

(Fig 1A)

•Macrofagi alveolari (Fig 1B)

•Polmoni: lume vascolare monociti ed endotelio (Fig 1C)

•Milza: citoplasma di macrofagi e cellule binucleate (Fig.

1E)

• Polpa bianca, tessuti linfoidi,simil-immunoblasti e simil-

centroblasti (Fig.1G)

• Linfociti periferici(Fig. 1 I)

Su quali campioni biologici?Sezioni di tessuto (autopsia o biopsia) congelate o in paraffina

Ibridazione in situ:� l’RNA virale può essere visualizzato in sezioni di

tessuto usando riboprobes antisenso marcati• Polpa rossa splenica: citoplasma dei macrofagi (Fig.1D) e cellule binucleate (Fig.1F) •Polpa bianca simil- centroblasti e simil-immunoblasti e (Fig.1 H)• Linfociti periferici e linfociti (Fig. 1 J)

JID 2004:189 (15 April) • 1411

Journal of Clinical Virology 45 (2009) 61-66 Modificata

� Real-Time PCR (3’ UTR)

METODI DIRETTI 4: Rilevazione dell’RNA mediante PCR

� RT-PCR one step o nested di famiglia (NS5) e sequenziamentoI Round II Round

Vector Borne Zoonotic Dis. 2007 ;7(4):467-77 Modificata

Su quali campioni biologici?� Siero: la carica virale è molto alta nei primi giorni dopo l’inizio della sintomatologia e si riscontra fino a 5-7 giorni

METODI DIRETTI 4: Rilevazione dell’RNA mediante PCR

Su quali campioni biologici?� Siero: la carica virale è molto alta nei primi giorni dopo l’inizio della sintomatologia e si riscontra fino a 5-7 giorni

�Urine: La carica virale è più bassa rispetto al siero ma il virus permane fino a circa 14 giorni

�Saliva: La carica virale è più bassa rispetto al siero ma il virus è stato riscontrato anche dopo 8 giorni dalla comparsa dei sintomi

METODI DIRETTI 4: Rilevazione dell’RNA mediante PCR

N:B: Urine e saliva possono essere utili nei casi in cui non si riscontra più il

virus nel sangue e anche laddove fosse difficile prelevare il sangue (es

bambini con sindrome emorragica)

METODI INDIRETTI: saggi sierologici

�La risposta immunitaria all’infezione da Dengue consiste nella produzione di

Immunoglobuline (IgM, IgG, IgA) specifiche, principalmente dirette verso la proteina E

� Poiché la proteina E contiene determinanti antigenici comuni a tutti i flavivirus, si osserva

una marcata cross-reattività tra i membri della famiglia flavivirus

�Durante una infezione primaria la risposta IgM è generalmente ad alti titoli

e più specifica rispetto alla secondaria

� La risposta delle IgG è a titoli più alti in una infezione secondaria rispetto alla primaria

�E’ difficile, se non impossibile, usare la sierologia per identificare il sierotipo in seguito

ad infezione primaria recente, poiché gli anticorpi prodotti sono cross-reattivi con gli

altri sierotipi

�Gli anticorpi che si formano in seguito ad infezione secondaria non solo sono cross-

reattivi tre i differenti sierotipi, ma sono fortemente cross-reattivi anche con altri

flavivirus

METODI INDIRETTI 1: saggi basati sulla rilevazione di IgM

•Saggi ELISA per le IgM:I micro-pozzetti sono rivestiti da antigeni del virus. I campioni di siero, pretrattati con sostanza in grado di catturare le IgG, vengono incubati nei pozzetti e tutte le IgM presenti nel campione vanno a legarsi nei pozzetti con l’antigene. Dopo lavaggio per rimuovere i legami aspecifici, un coniugato anti IgM viene dispensato e consente poi la rilevazione delle IgM

• Saggi ELISA a cattura per le IgM:I micro-pozzetti sono rivestiti da anticorpi anti-IgM umane. Una volta diluiti, i campioni di siero e i controlli vengono incubati nei pozzetti e tutte le IgM presenti nel campione vanno a legarsi nei pozzetti agli anticorpi anti-umano (specifici per IgM). I reattivi aspecifici vengono allontanati mediante lavaggi. Gli antigeni del virus della dengue vengono poi aggiunti nei pozzetti e incubati, così che, se nel campione sono presenti IgM anti-DVF, gli antigeni di DVF andranno a legarsi a tali anticorpi specifici nei relativi pozzetti

• Test rapidi per IgM che sfruttano l’immunocromatografia o le particelle agglutinanti (antigeni ricombinanti)

La maggior parte dei saggi per la rilevazione delle IgM utilizza antigeni ricombinanti verso la proteina E dei 4 sierotipi

Emerging Infectious Diseases • www.cdc.gov/eid • Vol. 15, No. 3, March 2009

350 sieri testati da 9 laboratori

Sensibilità e specificità per i test ELISA

Sensibilità e specificità per i test rapidi

�Le metodiche ELISA sembrano avere un miglior compromesso sensibilità/specificità rispetto ai test rapidi, che risultano molto variabili in termini di sensibilità�Si sono riscontrati falsi positivi dovuti ad infezione con Malaria, infezione pregressa da Dengue,positività per fattore reumatoide� Da tener presente che, poiché le IgM possono persistere anche per > 60 giorni, i saggi per le IgM non dovrebbero essere utilizzati come test di conferma in paesi dove la Dengue è endemica� I test per IgM devono essere supportati da altre evidenze diagnostchei, in aggiunta alla clinica e alle informazioni epidemiologiche; è fonfdamentale dimostrare una sieroconversione utilizzando una coppia di sieri

TestN. positives

(prevalence)Sensitivity Specificity VVP VPN

IFA in house 75/165 (45.5%) 100% 100% 100% 100%

Euroimmun DENV

IgG indirect ELISA98/165 (59.4%) 96% 71.1% 73.5% 95.5%

Panbio DENV IgG

indirect ELISA109/165 (66.1%) 98.7% 61.1% 67.9% 98.2%

Panbio DENV IgG

capture ELISA4/165(2.4%) 5.3% 100% 100% 55.9%

Gold standard: IFA

Dengue IgG ELISA indiretta

Ratio Result

< 0.8 Negative

0.8 < Ratio < 1.1 borderline

≥ 1.1 positive

Dengue IgG ELISA a cattura

165 sieri:140: campioni di donatori sani di Zanzibar9: Campioni da 7 pazienti con diagnosi di Dengue effettuata all’INMI1: Campione da paziente negativo2: Pazienti con AHFV o WNV13: pazienti con IgM/IgG perEBV/ CMV/ B19/ Rosolia/ Morbillo/ HAV

METODI INDIRETTI 2: saggi basati sulla rilevazione di IgG

Test N. positives Sensitivity

IFA in house 7 100%

Euroimmun DENV

IgG indirect ELISA5 71.4%

Panbio DENV IgG

indirect ELISA6 85.7%

Panbio DENV IgG

capture ELISA1 14.3%

Sieri di 7 pazienti con diagnosi di Dengue confermata mediante PCR e IFA IgM e IgGanalizzati con i tre metodi ELISA

TEST

IFAEuroimmune DENV

IgG indirect ELISA

Panbio DENV IgG

indirect ELISA

Panbio DENV IgG

capture ELISA

DIAGNOSIS

AHFV POS POS POS NEG

WNV POS POS POS NEG

TBE equivocal borderline POS NEG

JEV equivocal POS POS NEG

YFV vaccine equivocal NEG equivocal NEG

Pazienti con altre infezioni da Flavivirus

Gold standard:IFA

Metodi indiretti 3:Test di Microneutralizzazione (BSL3)

sieriDiluizioni

Seriali dei sieri

100 TCID50/pozz

aggiunta Virus

3-4 giorni37°C

1.5x104

cell/pozz

Piastra di Vero E6

1/2 ora 37°C

Titolazione CPE

� Non consente di discriminare tra differenti sierotipi di dengue

� Consente di fare diagnosi differenziale con altri flavivirus

•Campione Negativo : non compaiono altre bande oltre a quella di controllo (C).•Campione Positivo per le IgM Dengue:appare una banda violacea nella porzione posta subito sotto la banda di controllo (M)Campione Positivo per le IgG Dengue:appare una banda violacea nella porzione posta più distalmente rispetto alla banda di controllo (G) Campione Positivo per le IgG e le IgM Dengue: appaiono 2 bande violacee in corrispondenza delle posizioni (G) ed (M)

N.B.Il risultato positivo non esclude la presenza di altri virus, né identifica il sierotipo specifico.In caso di negatività non si può escludere che la concentrazione degli antigeni del virus nel campione sia inferiore al limite di rilevazione del test.

Campione Positivo

controllo Negativo

Allestimento di vetrini per IFA mediante infezione di colture cellulari di C6/36 e di Vero E6

Risultati:

Vetrini C6/36: poco idonei a causa di un’alta fluorescenza di fondo, dovuta verosimilmente alla presenza nei sieri umani di anticorpi diretti contro le cellule di insetto

Vetrini Vero E6: non presentano fluorescenza di fondo, consentendo una più nitida lettura dei risultati

METODI INDIRETTI 4: (BSL3)Immunofluorescenza con vetrini home-made

METODI INDIRETTI 5:Immunofluorescenza con vetrini commerciali per flavivirus

L

’

L’utilizzo di vetrini a mosaico in grado di vedere i 4 sierotipi di Dengue e altri

Flavivirus (TBE,YF,WN,JE) ha un valore aggiunto:

� In alcuni casi mette in luce la presenza di anticorpi specifici per altri flavivirus in

assenza di anticorpi per dengue (es: YF)

� In altri casi la forte creoss-reattività delle IgG per tutti i flavivirus in presenza

di IgM cross-reattive può essere un campanello di allarme…

Symptoms: 2 days later, during the flight to Italy, he developed high fever,

shaking chills, anorexia, malaise, nausea and vomiting, Over the following 5

days the symptoms worsened and he was admitted to hospital (May 10)

Travel history and retrospective reconstruction of possible exposure:

Frequent traveler; (vaccinated against yellow fever in 1998). April 29 he

visited the camel market of Shalatin; tick bite on a foot, followed by a small

papular lesion and (48 hours after the bite) blurred vision

Laboratory results: leukopenia (white blood cells: 2250/mmc),

thrombocytopenia (platelets: 67000/mmc);

increased liver enzymes (AST 469, ALT 406 U/L) d

Aetiology: not defined

Discharged 11 days after hospitalization, in good general condition despite

persistence of asthenia

A recent experience at INMI

Collection dateSample type WNV

Serology

Dengue

Serology

May 10th

(Day 10 post

exposure)

Serum IgG: ≥1:640

IgM: ≥ 1:20

IgG: ≥ 1:640

IgM: ≥ 1:20

May 27th Serum IgG: ≥ 1:640

IgM: ≥ 1:20

IgG: ≥ 1:640

IgM: ≥ 1:20

Samples were referred to the Virology Lab at INMI with request for

Dengue and WNV serology for retrospective diagnosis

Sequence analysis of NS5

Mosquito-borne

Flaviviruses

Tick-borne

Flaviviruses

RT-PCR / real-time RT-PCR• RNA virale nel siero fino a 5-7 giorni dalla comparsa dei sintomi

• RNA virale nellle urine e nella saliva fino a 14 giorni dalla comparsa dei sintomi

• Identificazione del sierotipo

Ricerca Antigene NS11 – 9/10 giorni dalla comparsa dei sintomi

Diagnosi sierologica infezione primariaELISA / IFA

IgM: 5 giorni dalla comparsa dei sintomi (80% casi)

IgG: 7 giorni dopo la comparsa dei sintomi

Diagnosi sierologica infezione secondariaELISA / IFA

IgM hanno titoli più bassi e durano meno.

IgG presenti durante la fase viremica ed aumentano velocemente

Handbook for Clinical Management of Dengue

Who’s next?