“PARTICIPACION DEL VIRUS DEL DENGUE BIOMEDICA BASICA
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OB308/ Universidad Nacional Aut6noma de México. Instituto de Investigaciones Biomédicas. “PARTICIPACION DEL VIRUS DEL DENGUE EN EL PROCESO FIBRINOLITICO”. TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN INVESTIGACION BIOMEDICA BASICA P R E S E N T &A M. en C, (BIOQUIMICA). VERONICA MONROY MARTINEZ MEXICO, D.F. 2000 X @ % “ey BIOMEDICAS
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OB308/
Universidad Nacional Aut6noma
de México.
Instituto de Investigaciones Biomédicas.
“PARTICIPACION DEL VIRUS DEL DENGUE EN EL PROCESO FIBRINOLITICO”.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN INVESTIGACION BIOMEDICA BASICA
P R E S E N T &A
M. en C, (BIOQUIMICA). VERONICA MONROY MARTINEZ
MEXICO, D.F. 2000 X @
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A mi asesor: La Dra. Blanca H. Ruiz Ordaz por alentarme a continuar con el Doctorado, brindandome su apoyo y amistad.
A mi comité tutorial: La Dra. Carmen Gomez y el Dr. Juan Pedro Laclette,
por sus valiosos consejos y el] tiempo que me dedicaron.
A mi Jurado: Por el tiempo que invirtieron en revisar este trabajo y ayudarme a mejorarlo.
Al grupo del laboratorio:
Irma, Gustavo, Luis, Giovanni,
Karla, Francisco, Georgina ,
Eneas y Elizabeth, por ser mis compafieros y amigos.
A mis hijos: Nayelli y Enrique, porque lo que soy es para ellos..
A mi esposo:
Francisco, por el amor, comprension, confianza y paciencia que me brinda; porque gran parte de lo que soy se lo debo a él.
CONTENIDO
Summary ........... . ························································· 1
Resumén .......................................................................................................................... 2
Introducción ..................................................................................................................... 4
Proteínas virales............................................................................................................... 5
Características estructurales de la proteína de envoltura ................................................. 9
Espectro clínico de la enfermedad ................................................................................... 1 1
Fibrinolisis ....................................................................................................................... 15
Digestión de la fibrina ..................................................................................................... 17
Estructura del plasminógeno ........................................................................................... 17
Activadores del plasminógeno ........................................................................................ 21
Inhibición de la fibrinolisis ............................................................................................. 21
Relación de la proteína de envoltura del virus del Dengue con el
plasminógeno .................................................................................................................. 24
Materiales y Métodos ...................................................................................................... 26
Resultados ....................................................................................................................... 28
Resultados adicionales ................................................................................................... .41
Discusión ......................................................................................................................... 48
Conclusiones ................................................................................................................... 53
Bibiografia ...................................................................................................................... 54
SUMMARY.
To date, the pathophysiology of hemorrhagic dengue is still unknown
and hypotheses which aim to explain the unfortunate cases of the disease
" (hemorrhagic fever/shock sindrome) are based on epidemiological data and
favour the notion of the participation of heterotypic non-neutralizing
antibodies during the course of secondary infection (immunologic status of
the host). However, cases of hemorrhagic dengue have been reported
during the course of primary infections.
We propose that the dengue virus, specifically the envelope
glycoprotein can participate directly in the installation of the hemorrhagic
phenomenon by means of the binding and activation of plasminogen (PLG)
as condition previous to the development of the fibrinolytic process. Based
on this hyphotesis, we evaluated the biological activity of some viral
isolates proceeding from hemorrhagic and from dengue fever cases in an in
vitro model of fibrinolysis.
Dengue isolates were capable of activating PLG. The plasmin
generated specifically degraded the fibrin/fibrinogen molecule. This
catalytic process can be prevented by the presence of the specific plasmin
inhibitor, a-2-antiplasmin, for virus isolates from dengue fever, but not for
isolates associated with dengue hemorrhagic disease, favouring the
exacerbation of the fibrinolytic activity. This new approach allows us to
suggest the importance of viral factors in the dengue hemorrhagic fever.
RESUMEN
La enfermedad def dengue es causada por el virus del dengue. del cua] se conocen
cuatro serotipos (1.2, 3 y 4). Las manifestaciones clinicas van desde un cuadro febril, hasta
las formas graves como el Sindrome de Choque por Dengue y la Fiebre Hemorragica por
Dengue (FHD). Se han propuesto 2 hipotesis que intentan explicar los casos desafortunados
de dengue: Ja primera, propuesta por Halstead, quien postula la facilitacién de la infeccion
mediada por anticuerpos heterotipicos no neutralizantes en el curso de una infeccién
secundaria, relacionando las manifestaciones hemorragicas con el status inmunoldgico del
paciente. La segunda hipdtesis, planteada por Ledn Rosen, se basa en la presencia de casos
hemorragicos ocurridos en el curso de una infeccién primaria, postulando que la variacion
antigénica de las cepas mientras circulan en la naturaleza es un factor de virulencia.
Actualmente no existen reportes que demuestren que el virus per se, tenga
participacion directa en el establecimiento del proceso hemorragico. Con base en lo anterior,
nos propusimos analizar la posible participacién del virus del dengue en la activacion del
plasmindégeno (PLG), como condicién previa al desarrollo del proceso fibrinolitico, el cual es
un mecanismo importante en la instalacién del fendmeno hemorragico. Asimismo. evaluamos
la activacion del PLG en presencia de a-2-antiplasmina, cuya funcién es regular el proceso de
fibrinolisis mediante la inhibicion de la plasmina.
La activacion del plasminégeno fue evaluada in vitro, utilizando aislados de dengue de
los cuatro serotipos, procedentes tanto de Dengue Clasico como de FHD. Nuestros resultados
demuestran que el virus, especificamente la proteina de envoltura viral, independientemente
del serotipo vy origen (clasico o hemorragico) tiene la habilidad de activar el PLG a plasmina,
la cual es una enzima clave en la activacion del sistema fibrinolitico. Esto puede ocurrir en
presencia de fibrina y/o fibrindgeno, lo que sugiere que la existencia de codgulos de fibrina no
es un factor indispensable para la activacién del zimdégeno. La activacion del PLG por los
virus procedentes de Dengue Clasico en presencia de a-2-antiplasmina, fue inhibida
significativamente de 100% a <10% a los 90 min. Por el contrario, las muestras de FHD
exacerbaron la activacién del PLG en un rango de 100 a 110% al mismo tiempo, comparada
con la actividad maxima observada por el control positivo (estreptocinasa).
Asimismo, determinamos que la proteina de envoltura viral puede activar el PLG,
mediante su union entre la regidn 359-390 del dominio III de E y el sitio de union a lisina t
del plasmindgeno (LBS).
Los resultados obtenidos en el presente trabajo, sugieren que el virus per se, puede
participar en la regulacion del proceso fibrinolitico, mediante la conversion del PLG a
plasmina. Los aislados hemorragicos compiten con la a-2-antiplasmina, induciendo el
incremento de la activacién del PLG, lo cual altera el mecanismo de regulacién de la
fibrinolisis, favoreciendo la instalacién de la hemorragia. Estos hallazgos dan una explicacién
alternativa al establecimiento del proceso hemorragico en aquellos casos de FHD en el curso
de una infeccién primaria en donde no se detecta la presencia de anticuerpos heterotipicos no
neutralizantes.
INTRODUCCION
El virus del dengue es miembro de la familia Flaviviridae, esta comprende tres
géneros: Flavivirus, Pestivirus y Hepatitis C. Los viriones de esta familia son esférios y
envueltos, con diametro comprendido entre 40 y 60 nm, son sensibles al calor, a
solventes organicos y detergentes. El tamafio del genoma de los Flavivirus, Pestivirus y
Hepatitis C es de 10.7 kb, 12.5 kb y 9.5 kb respectivamente, la organizacién de su
genoma es similar, estan formados por un RNA de cadena sencilla de polaridad positiva
el cual puede funcionar como mensajero y carece de tracto de poly A en su extremo 3’.
EI RNA presenta un solo marco de lectura abierta y codifica para una poliproteina, la
cual postraduccionalmente es cortada para dar lugar a las proteinas estructurales,
localizadas en el extremo 5‘del RNA y las proteinas no estructurales se encuentran en el
extremo 3’(Westaway, 1985; Murphy, 1995).
Los viriones de los Flavivirus, Pestivirus y Hepatitis C tienen 2 0 3 proteinas
asociadas a la membrana y una proteina de capside. Las proteinas estructurales de la
familia Flaviviridae no presentan similitudes en secuencia detectables; sin embargo, las
proteinas no estructurales de estos contienen motivos que indican la existencia de
actividades funcionales conservadas entre los tres géneros (White, 1994).
Los virus de la familia Flaviviridae se replican en el citoplasma de las células
infectadas, madurando en vesiculas citoplasmaticas, el modo de transmisién puede ser
por mosquito, garrapata y por vectores no conocidos. Aunque existen cerca de 70
miembros dentro del género de los Flavivirus, solo 13 causan enfermedad en humano,
los cuales son los siguientes: el virus de West Nile, el del Valle de Murray, el de la
encefalitis japonesa, el de encefalitis de San Louis, el Kunjin, el virus de la encefalitis
transmitida por garrapata (TBE), Kyasanur, Omsk, Louping, Powassan, el virus de !a
Fiebre Amarilla y los cuatro serotipos de dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4).
Los virus que pertenecen al género de Hepatitis C son transmitidos mediante via
sanguinea (Monath, 1986; Ahmed, 1999). Con respecto a los Pestivirus, son de
importancia Veterinaria, entre estos se encuentran el virus de Ja enfermedad de las
ovejas, el virus de la diarrea bovina y el virus de} célera porcino (Murphy, 1995).
Los Flavivirus se agrupan de acuerdo al modo de transmisién que puede set por
mosquito o por garrapata. Los virus de importancia humana transmitidos por garrapata
son: el virus de West Nile, el del Valle de Murray, el de la encefalitis de San Louis, el
Kunjin, el de Encefalitis Japonesa y ei virus de la encefalitis transmitida por garrapata
(TBE). Los transmitidos por mosquito son: el virus de la Fiebre Amarilla y los cuatro
serotipos de Dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4; Monath, 1986).
El virus del dengue puede ser transmitido al humano principalmente por medio
de la picadura de los moscos Aedes aegypti y Aedes albopictus (Gubler, 1998). Las
evidencias sugieren que el ciclo de transmisién del virus del dengue proviene de zonas
turales o islas, en donde tos mosquitos adquirieron el virus de primates infectados
afectando a una pequefia poblacién, los cuales posteriormente pasaron a zonas urbanas e
infectaron raépidamente a los individuos susceptibles de estas areas. La hembra
hematéfaga del mosco Aedes aegypti, es altamente domesticable ya que prefiere
depositar sus huevos en contenedores artificiales comtinmente encontrados alrededor de
las casas, por ejemplo, botellas, llantas, ademas de contenedores usados para guardar
agua, tales como cisternas y tanques. Los mosquitos presentan mayor actividad en la
tarde después de oscurecer; sin embargo, pueden permanecer escondidos dentro de las
casas durante el dia. Estos vectores habitan en regiones tropicales y subtropicales del
mundo afectando principalmente a personas menores de 15 afios (Halstead, 1980; Platt
1997).
El patron epidemioldégico del dengue en el continente Americano ha cambiado
dramaticamente en los ultimos 20 afios (fig. 1) debido a la expansion de la distribucion
geografica tanto del vector como de los cuatro serotipos del virus, resultando en la co-
circulacion de multiples serotipos. En México de 1980 a 1994 circulaban unicamente
DEN-1, 2 y 4; pero a partir de 1995 se reporto la presencia del serotipo 3 procedente de
Nicaragua y Panama (Lorofio, 1999). Las zonas endémicas en México son: Guerrero,
Oaxaca, Chiapas, Yucatan, la zona baja de Veracruz y Monterrey.
Proteinas virales.
El virion es esférico mide aproximadamente 60 nm de diametro y tiene un
genoma formado por un RNA de 11 Kb, de polaridad positiva que puede funcionar
como mensajero.
(8661 “1919qND) 8661 A 0L61 ‘O€61 Sue soy Ua OURSLIBUTY ajUaUUOD [9 Us WdASan sapay ooSoW Jap UOIONqMysiq *| “S14
a
EI RNA del virus del dengue codifica para un precursor poliproteinico (3386
a.a.) que se procesa postraduccionalmente para dar lugar a 3 proteinas estructurales y 7
no estructurales (fig. 2).
5’C-prM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3°
Entre las proteinas no estructurales del virus se encuentran: la proteina NS1 con
un peso molecular aproximado de 48 kDa, que es sintetizada en el reticulo
endoplasmico como un péptido hidrofilico monomérico que cuenta con dos sitios de
glicosilacién. NS1 es transferida a la membrana plasmatica y aunque su funcién no esta
bien determinada, se ha sugerido que pueda actuar como una chaperona que ayuda a la
maduracion del virién (Crooks, 1994). La proteina NS1 puede ser liberada al medio por
las células infectadas con el virus, siendo el antigeno soluble responsable de la fijacion
del complemento por lo que puede actuar como modulador inmune (Gould, 1986).
La proteina NS2A (20 kDa) es un péptido hidrofébico que se requiere para el
adecuado procesamiento proteolitico del extremo carboxilo terminal de NS1. La
proteina NS2B (14.5 kDa) puede funcionar como componente del complejo de replicasa
(Falgout, 1990).
La proteina NS3 (70 kDa) tiene un papel muy importante en la replicacion viral,
presenta actividad tanto de ATPasa como de RNA helicasa, linearizando la estructura
secundaria dei extremo 3’ del genoma de los flavivirus y se sugiere que participa en la
iniciacion de la sintesis del RNA viral (Rice, 1986; Takegami, 1994).
Las prote:nas NS4A y NS4B con peso molecular de 16 y 27 kDa
respectivamente, contienen regiones hidrofobicas conservadas en los Flavivirus y juega
un papel importante en el anclaje de NS3 y NSS a la membrana por lo que se han
relacionado como cofactores del complejo de replicacién (Chambers, 1990).
NS5 (103 kDa) es la proteina encargada de llevar a cabo las funciones tanto de
RNA polimerasa como de metil-transferasa (Bazan, 1989).
Las proteinas estructurales son las siguientes: la de la capside (C), la de
membrana (M) y la proteina de envoltura (E). La proteina C tiene un peso molecular
aproximado de 12.3-13.7 kDa, se une al RNA viral formando la nucelocapside viral. La
proteina M (8 kDa), es sintetizada como un precursor glicosilado (prM) cuya funcion ha
sido asociada con la morfogénesis y/o transporte viral al exterior de Ja célula.
La proteina E (58-60 kDa), es una glicoproteina biol6gicamente muy importante
ya que media la union y penetracion del virus a las células diana (macréfagos), siendo el
principal blanco y modulador de la respuesta inmune. En la proteina E se encuentran los
7
Genoma del virus del Dengue (10723 nt)
5° 97nt 454nt 3°
CAP _/ aroctonles | No estructarales
Procesamiento postraduccional
qd ea C prM ns2ans2b = NS3 nsda_ns4b
PROTEASA DE GOLGI
PrM Oe
Figura 2. Modelo del virus del Dengue y representacién esquematica del procesamiento
postraduccional del RNA viral.
epitopos de familia, de grupo, de tipo (1,2, 3 y 4), de subtipo (Jamaica, Nueva Guinea,
etc.) y de neutralizacién. Asimismo, presenta diferentes propiedades biologicas como
hemaglutinacién, fijacién del complemento y neurotropismo (Heinz, 1986). Esta
proteina posee dos sitios de N-glicosilacién (Smith, 1985) que parecen depender del
serotipo del virus (Johnson, 1994), se ha propuesto que las mutaciones en estos sitios
puedan afectar ta fusién del virus a la membrana del huésped asi como la expresion de
la neurovirulencia (Guirakhoo, 1993; Kawano, 1993).
Caracteristicas estructurales de la proteina de envoltura viral.
La proteina E se encuentra formando dimeros sobre la superficie de los vinones
maduros a pH fisiolégico. Cuando es expuesta a pH acido, menor de 6.5 (Heinz, 1991)
se induce un cambio conformacional irreversible que conduce a la formacioén de
trimeros, lo cual favorece la fusion de la membrana viral y la del endosoma celular.
Rey y colaboradores (1995) cristalizaron un fragmento dimérico soluble de la
proteina E del virus transmitido por la garrapata (TBE), el cual también pertenece a la
familia Flaviviridae. Este fragmento mide aproximadamente 150x55x30 A y fue
obtenido mediante el tratamiento de los viriones con tripsina, comprende del residuo |
al 395 y carece de 105 aminoacidos que corresponden a la regién de anclaje de la
proteina a Ja membrana. E] dimero es alargado y paralelo a la membrana, en la cara
externa de la proteina se encuentran localizadas las asas que varian de tamafio y
secuencia entre los flavivirus; la cara interna contiene el extremo C-terminal proyectado
hacia la membrana. E] mondémero esta formado por tres dominios funcionales diferentes
Hamados I, II y III (Fig. 3).
El dominio I o central contiene cerca de 120 residuos separados en tres
segmentos (1-51, 137-189 y 285-302), los cuales se encuentran plegados en 8 hojas B
formando un barril.
E] dominio Ho de dimerizacion comprende los residuos 52-136 y 190-284 formando
una estructura tipo digitiforme extendida. Como se muestra en la Fig. 3, en este dominio
se encuentra el asa cd (98-113), estos aminoacidos coinciden con la regién mas
conservada de la proteina de envoltura entre los flavivirus, es rica en glicina y
ligeramente hidrofébica.
El dominio [JI comprende del aminoacido 303 al 395 y forma un dominio tipo
inmunoglobulina (IgC like), unido al dominio central mediante un puente disulfuro. Los
residuos presentes en !a cara lateral de este dominio se han visto implicados en el grado
9
dorninio | derinio ll (central) (dimerizaciin)
Fig. 3. Estructura tridimensional del fragmento soluble de la proteina E de TBE (dimero). a) Representa al dimero de la proteina visto de la parte de afuera de la particula viral. b) Vista de la cara lateral del dimero de la proteina E. La proteina E ocupa un area de 1600 A’. La interface intrasubunidad entre los dominios I y II ocupa una superficie de 650 XR
sobre cada dominio. Las hojas B estan representadas por listones con
flechas; las a hélices por listones en espiral; las asas con listones
delgados. Los puentes disulfuro y el motivo de carbohidrato se muestran en estructura quimica (Rey, et. al, 1995).
10
de virulencia y tropismo en diferentes flavivirus (Sanchez, 1996). Se ha demostrado
ademas que este dominio participa en la unién del virus a la superficie de ta célula
huésped, ya que contiene uno de los dos posibles motivos de unién a
glicosaminoglicanos (a.a. 284-310 y 386-411) (Chen, 1997).
Espectro Clinico de la Enfermedad.
El dengue tiene un amplio espectro clinico que puede ir desde la forma leve de la
enfermedad conocida como Dengue Clasico (DC; 95% de los casos), hasta las formas
graves de la enfermedad, tales como la Fiebre Hemorragica por Dengue y/o Sindrome
de Choque por Dengue (FHD/SCD). El DC esta caracterizado por fiebre, dolor
generalizado, mialgias, artralgias, rash, nausea y vémito. Los datos de laboratorio son
normales a excepcion de una leucopenia moderada (Fig. 4) y es autolimitante e induce
una inmunidad especifica contra el serotipo infectante.
Una pequefia proporcién de personas (5%) con DC puede progresar hacia las
formas severas como son la FHD y/o SCD, que se caracterizan por dafio al endotelio
vascular, edema cerebral, hemorragias espontaneas, petequias, epistaxis, incremento en
el hematocrito, trombocitopenia, asi como salida de plasma en diversas cavidades del
cuerpo, incluyendo Ia pleura, pericardo y la cavidad peritoneal (Raghupathy, 1998; Fig.
5).
Bhamarapravati en 1981, sugirid que probablemente en la FHD/SCD estén
involucrados mediadores quimicos de accion corta como la histamina y la bradiquinina;
sin embargo, existen otra sustancias como el leucotrieno C (el cual es mil veces mas
potente que la histamina), los metabolitos del acido araquidénico, prostaciclinas y
prostaglandinas que son liberados por los macrdéfagos estimulados durante la infeccion
(Hastead, 1988), ocasionando un aumento en la permeabilidad del endotelio vascular y
la salida de liquido intravascular al espacio intersticial favoreciendo asi la instalacién
del choque hipovolémico.
A la fecha se conocen dos hipdtesis que intentan explicar las manifestaciones
hemorragicas: la primera postulada por Halstead en 1980, quien propone que en ej curso
de una infeccién secundaria la presencia de anticuerpos heterotipicos no neutralizantes
circulantes, incrementa la formacion de complejos antigeno-anticuerpo, facilitando la
eficacia de entrada del virus a las células blanco, desencadenando con ello la activacién
de macrofagos, ios cuales a su vez activan diferentes sistemas como el del
complemento, fibrinolisis y/o coagulacion (Fig.6). Con base en lo anterior, se propuso
11
Dias después de aparecer la fiebre
(2394S ETA90 WII el eB
Viremia sE THTTTT TTT TT HF
Log 10/ml sun LD, Titulo de anticuerpos inhibidores jaan [F de la hemaglutinacion (suero) E Temp.°C oE 4
Rash 31.2
Dolor de cabeza
Dolor muscular
Vémito
Sentido de! gusto alterado Linadenopatia Hepatomegalia Sangrado 10,000 =e Bradicardia 5,000 T° Leucocitos/mm° sa NEGATIVG
Choque an0-F = (00
Hematocnito (%) i20—e
Plaquetas x 10°/mm* ao E ee TGO s.u. 2 —£ Albumina (¢%) so FE
Tiempo de protrombina (%) oo SL Ld
4° 3456 79 SIO NIZISI4IS I6I7IS19 26 32
Infeccién Dias post-infeccion
Fig. 4. Hallazgos clinicos y de laboratorio de un caso tipico de fiebre por dengue (Ramos, 1989).
12
Viremia
Log 10/ml
Temp.°C
Titulo de anticuerpos Inhibidores de la
Hemaglutinacion (suero)
Choque
Leucocitos / mm?
Hematocrito (%)
Plaquetas x 10°/mm?
Albumina (2%)
Fibrindgeno (% del normal) C3 Proactivador (% del normal) C3 (“del normal)
Dias después de aparecer la fiebre
[2349 56 16 9 18 Wf $3
a ee
mu Te
a
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an
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BO
60 ao
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or Ltt Li Ltt
pDi12z234 ohh aT t
Infeccion Dias post-infeccion
Fig. 5. Hallazgos clinicos y de laboratorio de un caso tipico de Sindrome de Choque por Dengue y/o Fiebre Hemorragica por dengue (Ramos, 1989).
13
_, Anticuerpos : : Monocitos Linfocitos — ' Complemento macréfagos T
Clase II Clase I
Virus del
Dengue NY Célula
endotelial
Activacion del
complemento
C3a_ Ca TNFa, IL-1, IL-6 v Histamina
y
fa “TNFa; IL-1 :
6.
Célula endotelial vascular
Extravasaci6n de liquidos ______» Fiebre Hemorragica por Dengue
Fig. 6. Médelo de inmunopatogénesis de la Fiebre Hemorragica por dengue inducida por mediadores quimicos y citocinas (Kurane & Ennis, 1994).
14
que los anticuerpos heterotipicos no neutralizantes previamente formados, fueran un
factor de predisposicion en la presentacién de FHD/SCD en el curso de una infeccion
secundaria (Halstead, 1988).
Sin embargo, se han reportado casos de Dengue hemorragico en el curso de una
infeccion de tipo primario, en los cuales se demostré que no habian estado expuestos a
una primoinfeccién por dengue u otro flavivirus y que por lo tanto el status
inmunoldgico del huésped podria no estar jugando un papel importante (Barnes, 1974).
Para tratar de explicar estos casos, Leén Rosen en 1977 propuso una segunda hipdtesis,
que postula que la variabilidad antigénica que sufren las cepas mientras circulan en la
naturaleza (y Ja virulencia de la cepa per se) es importante en la predisposicién a la
manifestacion hemorragica (Rosen, 1977).
Ambas hipotesis estan basadas en datos epidemiologicos, ya que hasta la fecha
no existe un modelo animal para el estudio de la enfermedad.
Las dos hipotesis que intentan explicar los casos desafortunados de Dengue
(FHD/SCD), estan basadas en datos epidemioldgicos, a la fecha no existen modelos
tanto in vivo como in vitro que puedan explicar el desarrollo de Dengue hemorragico y
el estudio de los factores virales involucrados con la hemorragia unicamente se han
\levado a cabo mediante asociaciones clinicas de manera indirecta (Letmeyer, 1999).
Los niveles séricos tanto de plasminégeno como de fibrindgeno en pacientes con
Dengue hemorragico, se han encontrado notablemente disminuidos (Almagro, 1984),
una posible explicacion a lo anterior, es que estas proteinas puedan estar degradandose
como resultado de la activacién del plasmindgeno y la fibrinolisis.
Fibrinolisis.
El proceso de la fibrinolisis engloba una cascada enzimatica que da como
resultado la lisis del codgulo de fibrina (Diagrama 1), este puede ser activado en forma
independiente o dependiente de la activacion de la cascada de coagulacién en respuesta
a la formacion de la fibrina. Este fendmeno esta controlado y regutado por la actividad
de un sistema de enzimas proteoliticas denominado sistema plasmindégeno-plasmina; se
ha reportado que el desbalance en la fibrinolisis puede ocasionar hemorragia o
trombosis (Collen, 1980),
La plasmina es la enzima encargada de degradar los codgulos de fibrina y se
encuentra en el torrente sanguineo bajo la forma de una proteina precursora (zimdgeno)
llamada plasminogeno (PLG); su conversion es Ilevada a cabo de manera natural por
otra proteina denominada activador tisular del plasmindgeno (tPA) y en condiciones
15
‘ia Intrinseca Cascada de coagulaci6n Cascada de fibrinolisis Superficie dafiada
(activadores endégenos)
Activador tisular del plasmindgeno (tPA) y Urocinasa (UK)
| Estreptocinasa (activador exdgeno) Calicreina
Xi 4+, Xia Via Extrinseca Inhibidoreg de la activacion
Trauma del plasminédgeno X1—> Xla Vila 4— Vi (PAI's)
Cat+ v { 1X —— > IXa Factor tisular
Cat+ Vil Villa *} - Plasmina <——— Plasmindgeno
x Xa4#— X
Va «— V“«* a-2-ant Na (inhibidor) _-w PragY
Protrombina ——» Trombina Frag X se Frag E Cat+ y Frag D #
Via Final Comin Fibrindgeno ___, Fibrina
| XIIla © XII
Coagulacién de fibrina entrecruzada
Diagrama 1. Esquema de fibrinolisis y su interaccién con el sistema de coagulacién
16
patolégicas por enzimas proteoliticas cinasas, tales como: urocinasa y estreptocinasa
(SK). La activacién del PLG involucra el rompimiento de la unién arginina-valina (560-
561) en el zimogeno sin generar la liberacién de péptidos (Collen, 1993).
La plasmina actua digiriendo el’ fibrindgeno de manera similar a la fibrina,
ademas tiene accién sobre otras proteinas plasmaticas particularmente los factores de
coagulacién V y VIII (Diagrama 2). Recientemente se ha reportado que la plasmina
también se encuentra asociada con otros procesos como: migracién celular,
remodelacién de tejidos, embriogénesis, invasién y diseminacion de células tumorales
(Péllanen, 1991; Dan@, 1985; Tryggvason, 1987 y Strickland, 1976).
Digesti6n de la fibrina.
La fibrinolisis es un proceso lento que requiere de varias horas para que se lleve
a cabo la digestion de la fibrina a péptidos de bajo peso molecular. Inicialmente la
plasmina se une a la fibrina (340 kDa) y corta la cadena a, asi como la unién de la
cadena f para producir el fragmento X (240-265 kDa), el cual posteriormente produce
un fragmento X tardio que genera los fragmentos Y (155 kDa) y D (70-100 kDa).
Finalmente del péptido Y se genera el fragmento E (50 kDa) y un segundo fragmento D
(Diagrama 3), ambos fragmentos pueden seguir degradandose hasta obtener péptidos de
menor peso molecular. La plasmina puede cortar a la fibrina hasta 30 veces en sitios
especificos (Doolitle, 1994).
Estructura del plasminégeno.
El plasmindgeno (PLG) denominado anteriormente profibrinolisina, es una
glicoproteina inactiva (791 aa) sintetizada en el higado que circula en la sangre
normalmente en una concentracioén de 24M. El PLG tiene un residuo de acido
glutamico en su extremo amino terminal (Glu-plasmindgeno), el cual se pierde junto
con 76 a.a. pasando a formar un zimogeno modificado denominado lis-plasminédgeno
(porque es una lisina la que se encuentra en su extremo N-terminal; Wallen, 1972). El
lis-plasminégeno puede ser activado por los activadores del PLG a plasmina cuando es
escindido en la union péptidica Arg 561-Val 562 (Peisach, 1999), manteniéndose la
molécula unida mediante un puente disulfuro (Boyle, 1977).
El plasmindgeno/plasmina (Fig. 7) pesa 92 kDa, estructuralmente esta formado
por dos cadenas: una pesada y una ligera. La cadena pesada presenta cinco dominios
denominados kringle y la cadena ligera contiene ef dominio catalitico. Los dominios
17
FASE FLUIDA
FIBRINOGENO FACTOR V > DEGRADACION FACTOR VIII
INHIBIDOR ESPECIFICO
DE LA PLASMINA
(a-2-ANTIPLASMINA)
PLASMINOGENO —————-® PLASMINA 4
ACTIVADOR DEL PLASMINOGENO
SUPERFICIE DE FIBRINA
INHIBIDORES DE LA ACTIVACION DEL PLASMINOGENO
PAI-I y PAI-2
PLASMINOGENO f~L-+ PLASMINA (unido a fibrina) (unido a fibrina)
a-2-ANTIRLASMINA
Péptidos de degradacién de la fibrina FIBRINA
Diagrama 2. Esquema de actividad especifica de la plasmina sobre diferentes
proteinas involucradas en los procesos de coagulacion y/o fibrinolisis.
18
ooo FIBRINOGENO FRAGMENTO X (340 kDa) B(Arg42-Ala43) (240-265 kDa)
(Lys62-Arg63)
FRAGMENTO X tardio
(Lys81-Asp82)
(Arg103-Asp104)
B (Lys!22-Asp123)
B (Lys133-Asp134)
v
FRAGMENTO Y FRAGMENTO D (155 kDa) (100 kDa)
FRAGMENTO E (50 kDa)
' PRODUCTO DE DEGRADACION DE BAJO PESO MOLECULAR.
Diagrama 3. Representacion de la degradacion del fibrindgeno (Doolittle, 1994).
19
Or COOH
Fig. 7. Estructura del plasminégeno. PA se refiere al péptido liberado durante la activacion del plasmindgeno. SC es el sitio de corte, el cual
es requerido para la activacion del plasmindégeno a plasmina y K se refiere a los dominios kringle de la molécula del zimégeno (Castellino, 1990).
20
kringle presentan sitios de unién a lisina (LBS) los cuales se unen en forma especifica a
ciertos aminoacidos con propiedades antifibrinoliticas, tales como la lisina, el acido 6-
aminohexanoico y el acido trans-4-aminometilciclohexano-1-carboxilico (Brockway,
1972). Estas estructuras estan involucradas en la interaccion entre la plasminadgeno y la
fibrina (Lijnen, 1980), asi como también entre la plasmina y su inhibidor especifico (a-
2-antiplasmina; Wiman, 1978) por lo que juegan un papel crucial en la regulacion
fisiologica de la fibrinolisis (Sasaki, 1986).
Activadores del plasminégeno.
Como se menciono anteriormente el plasmindégeno puede ser activado a
plasmina por los activadores del PLG (Fig.8). Estos se clasifican en: endégenos como el
activador tisular del plasminégeno (tPA) y la urocinasa (UK) los cuales presentan
actividad de proteasas y exdgenos tales como la estreptocinasa (SK), estafilocinasa, asi
como otras proteinas de origen bacteriano (Lottenberg, 1994).
La SK es una proteina de 414 residuos de aminoacidos comunmente usada como
agente trombolitico en el tratamiento de desordenes en la formacién de los codgulos
sanguineos tales como el infarto al miocardio. La SK es secretada por las cepas de
Streptococcus B hemolitico y no presenta una actividad catalitica como tal, sino que se
une a la molécula de PLG (la cual a su vez se encuentra unida a la fibrina y/o
fibrinégeno) actuando como un proactivador que provoca un cambio conformacional en
el PLG (Wang, 1998). Esta unién resulta en la exposicién de un sitio sensible a
hidrdlisis por otra molécula de PLG, dando como resultado la generacion de plasmina
(Fig. 9; Liu, 1990).
Es importante mencionar que la actividad de la SK es especie especifica, por
ejemplo la SK de Streptococcus del grupo C aislada a partir de muestras humanas,
puede unirse y activar el PLG humano; sin embargo, falla o activa deficientemente el
PLG de otras especies (Marcum, 1983).
Inhibicién de la fibrinolisis.
La fibrinolisis puede inhibirse en forma natural o sintética (Christensen, 1978;
Wiman, 1978). En forma natural existen proteinas plasmaticas Hamadas_ serpinas
encargadas de neutralizar la actividad de la plasmina, las cuales pueden inhibir el
proceso de fibrinolisis a dos niveles: 1) antes de que el PLG sea activado y 2) cuando ya
se encuentra como enzima activa.
21
A
PLASMINOGENO
QUININOGENOS DE ALTO PESO MOLECULAR
v
PRECALICREINA—™ CALICREINA ————* <" C1-INACTIVADOR
FACTOR XiIlq ‘mau INHIBIDOR DE LA ACTIV. DEL NN PLASMINOGENO
PROACTIVADOR —~——® ACTIVADOR toe COMPLEJO INACTIVADOR
PROUROCINASA
ACTIVADOR TISULAR DEL PLASMINOGENO UROCINASA (tPA)
a fibrina
D PLASMINOGENO rad PLASMINA “7 PLASMINOGENO B é A '
INHIBIDORES DEL tPA INHIBIDOR DE LA UROCINASA
Ac’s &-ESTREPTOCINASA "| 4 _COMPLEJO PLG-SK
PLASMINOGENO
Cc
Fig. 8. Representacién esquematica de las vias de activacion del plasmindégeno (PLG) a
plasmina (> ) y los sitios de accion de sus inhibidores ( ---» ).
22
Fibrindgeno
Sitio
N activo “=. N Arg $8 360 Val 561
—_—_
Cc je activo
Plasminédgeno Plasmina
Fig. 8. Modelo esquematico de activacién cel plasmindgeno por la estreptocinasa
(SK; Liu & Chien, 1990).
Lys-plasmina
é ga Dominion
\ Kringle
— > —
ye
t Sitio activo A Ser 740
[<3 alfa-2-antiplasmina
Fig. 10. Modelo de inhibicidén de la plasmina por alfa-2-antiplasmina.
(Lottenberg, 1994)
23
1) Las serpinas denominadas inhibidores de la activacién del plasmindgeno
(PAI-1, PAI-2 y PAI-3), se encargan de inhibir al activador tisular del PLG (tPA),
mediante la unién irreversible de los PAIs al tPA bloqueando de esta manera la
formacién del complejo PLG-tPA (Bjérquist, 1998). Es importante notar que en
monocitos infectados con el virus del dengue se ha observado un incremento de PAIs
tanto in vivo como in vitro (Bramarapravati, 1981), sin que a la fecha exista una
explicacién fisioldgica a este fendmeno.
2) Por otro lado, la serpina a-2-antiplasmina es el inhibidor fisiol6gico mas
importante de la plasmina y acta. inhibiendo especificamente la molécula activa
(Sakaki, 1986) mediante un mecanismo que comprende 2 pasos: El primero es una
unidén de tipo idnico, entre la @-2-antiplasmina y el kringle 1 de la plasmina (reaccién
reversible) y el segundo (irreversible) es la unién covalente de la a-2-antiplasmina a la
serina 740 de la cadena B de la plasmina (dominio catalitico) (Fig. 10, Lottenberg
1994),
Se han reportado diferentes tipos de anticuerpos capaces de alterar la actividad de la a-
2-antiplasmina, entre los cuales se encuentran anticuerpos monoclonales anti-dengue
(Markoff, 1994) y anti-urocinasa (Ellis, 1993). Los anticuerpos anti-dengue estan
dirigidos contra la proteina E (aa 100 -119) y cruzan con el PLG en la region
comprendida del aa 759-779, 19 aminodcidos hacia el extremo carboxilo terminal,
cerca de la serina 740 en donde se localiza el dominio catalitico de la plasmina.
Relaci6n de la proteina de envoltura del virus del dengue con el plasmindgeno.
Como se menciono anteriormente, la relacién del plasminogeno con el virus del
dengue esta mediado a través de la proteina E. En estudios Hlevados a cabo en nifios
hospitalizados que cursaban con DC y FHD/SCD, se encontraron anticuerpos contra la
proteina E del virus del dengue que presentaban reaccion cruzada con el PLG. E}
analisis de similitud entre el PLG y la proteina de envoltura mostré una region de 20 aa
con elevada similitud entre las dos moléculas (Markoff, 1994).
La proteina E es muy importante desde el punto de vista fisiolégico para los
Flavivirus, ya que interacciona inicialmente con el huésped, jugando un papel central en
la infeccion y en la relacién huésped-parasito.
Por otro lado, en un estudio realizado en Cuba en pacientes con FHD, se
encontr6 una elevada correlacién entre la severidad de la enfermedad y la disminuci6n
24
del fibrinégeno, del plasminégeno y el incremento de los productos de degradacién del
fibrindgeno (Almagro, 1984). Una posible explicacién a lo anterior es que estas
proteinas pudieran estar degradandose como resultado de la activacién del
plasminégeno.
Con base en estos antecedentes nosotros planteamos la participacién del virus
del dengue, especificamente de Ia proteina de envoltura viral en la activacién del
mecanismo de fibrinolisis, como un elemento determinante en el desarrollo de la
hemorragia. Asi mismo de que el virus del dengue pueda competir con la a-2-
antiplasmina por el plasmindgeno, alterando la regulacién del mecanismo fibrinolitico,
sobre todo en aquellos casos de infecciones primarias de dengue en donde no existen
anticuerpos anti-dengue preformados.
25
MATERIALES Y METODOS.
Analisis de los productos de degradacién de fibrina (PDF) y fibrinégeno (PDF g):
Los productos de los ensayos de fibrinolisis con los virus del Dengue 2
Mexicano (D2M) y Dengue 2 de Indonesia (D21) llevados a cabo en presencia de
fibrina, fueron analizados después de 24 horas mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida al 12.5% (PAGE-SDS). Estos geles se corrieron en condiciones no
reductoras y se tifieron con azul de coomassie brillante para identificar los PDF.
Asimismo, se analizaron las muestras de D2M y D2I cuyo ensayo se Ilevo a cabo en
presencia de fibrindgeno, con el objeto de visualizar los PDF g.
Sintesis del péptido E:
El péptido E se sintetizo en un aplicador Biosystems (Foster City, CA).
Sintetizador de péptidos modelo 430, utilizando aminoacidos t-Boc y resinas de
peptidilglicina a-amidativas mono-oxigenasa. El péptido E comprendia los aminoacidos
359-390 de la proteina de envoltura del virus del Dengue procedente de FHD, con la
siguiente secuencia: TEKDSPVNIEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLN. La pureza y la
composicién de aminoacidos de este péptido fué confirmada mediante HPLC.
Activacién del plasmindégeno por el virus del Dengue en presencia del péptido E:
Para llevar a cabo los experimentos de activacioén del PLG, el péptido E se
disolvid en PBS 10 mM, pH 7.4 y posteriormente se centrifugé a 2500 rpm durante 5
minutos para remover material insoluble. Estos ensayos se Ilevaron a cabo en las
mismas condiciones que los de fibrinolisis, usando 10 yl de plasmindgeno (7 U/ml) con
100 yl del virus de Dengue 2 Mexicano o Dengue 2 de Indonesia (1x10° u-fp.) en
presencia de 2, 4 y 6 pg del péptido E. Los controles negativos se evaluaron utilizando
las mismas concentraciones del péptido E, en ausencia de las particulas virales.
*u.fip.= unidades formadoras de placa
26
Activacion del plasminégeno por el virus del Dengue en presencia de la
o-2-antiplasmina y el péptido E:
La inhibicién de la activacion del plasmindégeno se llevd a cabo utilizando las
mismas condiciones que en los ensayos de fibrinolisis, con 100 1) (1x10" u.f.p) del virus
de Dengue 2 Mexicano o Dengue 2 de Indonesia en presencia de 4 1g del péptido E, 10
ul de plasmindgeno (7 U/ml) y 10 yl de a-2-antiplasmina 0.075 mM, mas 100 ul del
sustrato cromogénico (3 uM).
27
RESULTADOS.
Basados en nuestro planteamiento procedimos a investigar la
posible participacién del virus del dengue en el proceso fibrinolitico. Esta
investigacién se llevé a cabo en el Departamento de Biologia Molecular,
bajo la asesoria de la Dra. Blanca Ruiz, dicho trabajo gener el articulo
que presentamos a continacion.
28
Ba Virus Genes 21:3, 197-208, 2000
st © 2000 Kluwer Academic Publishers. Manufactured in The Netherlands.
Participation of the Dengue Virus in the Fibrinolytic Process
V. MONROY & B. H. RUIZ
Departamento de Biologia Molecular; Instituto de Investigaciones Biomedicas, Universidad Nacional Autonoma de Mexico,
Apartado Postal 70228. 04510 Mexico. DF... Mexico
Received October 25, 1999; Accepted February 21, 2000
Abstract. To date, the phatophysiology of hemorrhagic dengue is still unknown and hypotheses which aim to
explain the unfortunate cases of the disease (hemorthagic fever/shock syndrome) are based on epidemiological
data and favor the notion of the participation of heterotypic non-neutralizing antibodies during the course of
secondary infection (immunologic status of the host). However, cases of hemorrhagic dengue have been reported
during the course of primary infections. We propose that the dengue virus, specifically the envelope glycoprotein
can participate directly in the installation of the hemorrhagic phenomenon by means of the binding and activation
of plasminogen (PLG) as condition previous to the development of the fibrinolytic process. Based on this
hypothesis, we evaluated the biological activity of some viral isolates proceeding from hemorthagic and from
dengue fever cases in an in virro model of fibrinolysis. Dengue isolates were capable of activating PLG. The
plasmin generated specifically degraded the fibrin/fibrinogen molecule. This catalytic process can be prevented by
the presence of the specific plasmin inhibitor, x-2-antiplasmin. for virus isolates from dengue fever, but not for
isolates associated with dengue hemorrhagic disease, favoring the exacerbation of the fibrinolytic activity. This
gest the importance of viral factors in the dengue hemorrhagic fever.
new approach allows us to sug
Key words:
signs and symptoms, including frontal headache.
retro-orbital pain, body aches. nausea, vomiting.
joint pains, weakness and rash. In DSS/DHF during
the acute phase of the disease is difficult to distinguish
it from DF. The critical stage in DHF is at the time of
defervescence. Signs of circulatory failure or hemor-
thagic manifestations may occur after temperature
Introduction
Dengue fever is caused by the four serotypes of the
dengue virus [1.2.3.4] which belong to the family
Flaviviridae, and is wansmitied to humans by the bite
of the mosquito Aedes aegypti (1). It is the most
important mosquito-bome tropical infectious disease
after malaria, with approximately 100 million cases
annually of Dengue Fever, 500.000 cases of Dengue
Hemorthagic Fever and 25.000 deaths (2).
The clinical spectrum of the disease varies from a
light infection known as dengue fever (DF, 954¢ of the
cases) to severe forms such as the dengue shock
syndrome and/or dengue hemorrhagic fever (DSS/
DHF: 5% of the cases). The various manifestations
may be determined by host and parasite-related
factors. This observation is corroborated by reported
variations in the clinical picture and pathology among
cases of DHF (3). Dengue fever is characterized by
the sudden onset of fever and a variety of nonspecific
29
M9720 Kineet Acagemuc Publisnens Virus Genws
falis to normal and include: skin hemorrhages such as
petechiae, purpuric lesions. ecchymoses, epistaxis,
bleeding gums, gastrointestinal hemorrhage and
capillary leakage that may result in hypovolemic
shock. Hemostatic changes involve mainly three
factors: vascular alterations. thrombocytopenia and
multiple defects in the coagulation-Abrinolysis system
such a decreased fibrinogen evel, increased levels of
fibrinogen degradation products (FDP), prolonged
partial thromboplastin time. low levels of: coagulation
factors (VIE. XII). plasminogen. prothrombin and 2-
2-antiplasmin (a-2-AP) (Bhramarapravati, 1989,
1997).
Tradespoals Wid. Frome, Somenct
198 Monroy and Riaz
The mechanisms involved in the pathogenesis of
dengue hemorthayie fever remain unresolved. For
nearly three decides, studies of dengue virus
pathogenesis, immunology and vaccinology have
been dominated by the antibody-dependent enhance-
ment (ADE) hypothesis (4). The pre-existing
heterologous dengue antibody recognizes the
infecting virus, and forms an antigen-antibody
complex, which is bound to, and internalized by Ig
Fe receptors, on the mononuclear cell lineage
(especially macrophages). The virus is not neutralized
and is free to replicate once inside the macrophage.
These cells produce and secrete vasoactive mediators
which cause increased vascular permeability leading
to hypovolemia and shock (5). Neverthelzss. Rosen
and co-workers (6) have questioned different aspects
of the ADE studies, including the choice of study
populations. the definition of DHF, and the validity of
the virological and serological methods used to
identify the population at risk. and propose a second
hypothesis which assumes that dengue viruses. like all
animal viruses. vary and change genetically asa result
of selection pressures as they replicate in humans and/
or mosquitoes and that some virus strains have greater
epidemic potential (7). Phenotypic expression of
genetic changes in the virus genome may include
increased virus replication, virulence and epidemic
potential. Epidemiological and laboratory evidence
supports both of these hypothesis, which are not
mutually exclusive, and both are most probably valid
but. unfortunately, there are no good animal models
for DHF and DSS. which makes studies on pathogen-
esis difficult to interpret. It would appear that different
clinical pathological manifestations of the disease are
caused by different mechanisms (3.9). However, it
now seems timely to pay more attention to the virus
itself and the host-virus interplay on dengue patho-
genesis.
We propose thal, independently of the immunolo-
gical status of the host (ADE) the dengue virus per se
may play an important role in the establishment of the
hemorrhagic manifestation. In the present work. we
analyze the participation of the dengue vinis in
plasminogen (PLG) activation as a condition previous
to the development of the fibrinolytic process. an
important mechanism in the installation of the
hemorthagic phenomenon. We also evaluate PLG
activation in the presence of x-2-antiplasmin whose
function is to regulate the process of fibrinolysis by
plasmin inhibition.
30
Materials and Methods
Virus propagation and purification. Different
samples of the dengue virus, isolated from patients
with dengue fever and hemorrhagic dengue during the
primary infection were used in the present study (see
Table 1. for description of the isolates). The
identification of the viral strains were based on virus
isolation and the polymerase-chain-reaction (PCR)
method (10). Each serotype was confirmed with type-
specific monoclonal antibodies (D2-UF1-3, 3HF-1-
21, D6-8Al-!2 and 1H10-6-7). All strains were
propagated in confluent monolayers of green
monkey kidney cells (LLC-MK2) at low input
multiplicity (m.o.i. <0.1 p.fuJcell) and incubated at
37°C in Eagle's media supplemented with antibiotics.
Culture fluids were harvested and collected before the
cell monolayer was detached but with a maximum
cytopathic effect. Later, all supernatants were clari-
fied by centrifugation at 200g for 15min, concen-
trated by precipitation using 1/5 volume of 10%
polyethylenegiycol 8000 (PEG), 15% NaCl and
incubated 16h at 4°C. This precipitate was then
collected by centrifugation in a 5-50% sucrose
gradient. The visible band of virions was collected
in TNE buffer (0.1 M NaCl, 0.010 M Tris-HCI pH 7.4.
1mM EDTA) and stored at ~ 80°C until used. The
purity of the virus preparation was confirmed by
12.5% SDS-PAGE with Laemmii’s discontinuous
buffer system followed by staining with Coomassie
Brilliant Blue for 1 h and then destaining overnight in
10% acetic acid and 5% methanol in water (11). The
bands had molecular sizes of approximately 58-60. 14
and 7kDa. and other bands corresponding to dimers
and trimers of envelope protein. Band specifity was
evaluated by Western blot using a serum poo! against
dengue. The PEG clarified supematant from mock-
infected LLC-MK2 cells, as wel! as the strain of
rotavirus (RRV) and vaccinia (MYA) virus were
tested as negative controls.
Virus titration by Ivtic plaque assay. To standardize
the concentration of virus to be used in zach assay, all
viral isolates (including negative controls) were
initially titrated by lytic plaque assay (12). Serial
10-fold dilutions of each virus stock were added to
LLC-MK2? monolayers which were kept in culture at
37°C with 5% CO, for 7 days under a 1%
methylcellulose overlay with 2.5% bovine fetal
serum (BFS). The number of lytic plaque-forming
Table 1. Dengue viruses used in fibrinolysis assays
Dengue Virus in the Fibrinolytic Process 199
No. Virus Isolate Serotype Clinical Passage Source .
1 TOF 1 DF 5 in LLC-MK2 Patient
: 1 DF $ in LLC-MK2 Patient
3 1 DHF 3 in LLC-MK2 Patient
4 y DHF 5 in LLC-MK2 Patient
3 2 DF ] in mosco Patient
(D 2 Mexican) 5 in LLC-MK2
6 D2Tumaulipas (D2T) 2 DF 2 in LLC-MK2 Patient
7 1169 «D 2 Indonesia) 2 DHF 5 in LLC-MK2 Patient
8 D2Colima (D2C) 2 DHF 2 in LLC-MK2 Patient
9 5504 3 OF 4 in LLC-MK2 Patient
10 5936 3 DF 3 in LLC-MK2 Patient
nN 6065 3 DHF 2 in LLC-MK2 Patient
i2 4637 3 DHF 2 in LLC-MK2 Patient
13 9414 4 DF 6 in LLC-MK2 Patient
14 §307 4 DF 4in LLC-MK2 Patient
15 DaOaxaca (D40) 4 DHF 6 in LLC-MK2 Patient
16 D4Guerrero (DAG) 4 DHF 6 in LLC-MK2 Patient
17 RRV* G3P5 _ 350 in MAC104 Mono rhesus
18 MVAt _ - 600 in chicken fibroblasts wild strain
tVaceine (MVA) and “rotavirus (RRV) were used as negauve controls, .
units (p.f.u.) was counted after staining with crystal
violet.
Preparation of forin matrices. The fibrin matrices
were prepared in 96-well ELISA plates (13). To
prevent non-specific binding. the wells were coated
overnight at 4°C with 20 mg/ml bovine seric albumin
(BSA) in 30mM sodium carbonate buffer (pH 9.4).
The BSA coating buffer was removed and the wells
were washed twice with PBS 10mM, 0.05% (v/v)
Tween 20 and 20 mg/ml BSA. In each wel! 100 pl of
fibrinogen were added to 25 pl of human thrombin (3
units/ml). A fibrin matrix was formed and air-dried for
16h at 37°C.
Fibrin/fibrinolvsis assays. Initially, best conditions
for evaluation of activation of the PLG were defined
for all strains, which are shown in Table 2. Optimal
concentrations were kept constant in all PLG
activation assays. The fibrin matrices were washed
Table 2. Optimal conditions in the fibrinolysis assays
Reagents Assayed Conditions
for 2min and incubated in 100 pt of 0.03 M HCl.
0.11 M NaC) Tris. pH 7.4. with 0.01% sodium azide
as conservative. Each well received 10pl of
7Usml chromogenic PLG. 5 yl streptokinase (SK.
500 U/ml) or 100 ul of each viral isoiate. In this
assay, different concentrations of the isolates were
tested, and all strains were optimized (including
negative conuols) but the optimal titers were found
within a range of 1x10" to 1x 10° p.f.u. for the
different isolates. To each well were added 100 ul of
plasmin-specific chromogenic subsirate (Sigma
Diagnostics, St. Louis). In this assay, the increase in
amydolytic activity is directly proportional to the
amount of plasmin generated by the sample. They
were incubated at 37°C in a humid chamber for
90 min, after which the absorbance was measured at
405 nm. Negative controls contained the fibrin matrix
with 10 ul of PLG (7 U/ml) and 100 ul of rotavirus
(RRV) or vaccinia virus (MVA) with a titer of 1 x 106
p.f.u., plus 100! of plasmin specific chromogenic
Optimal Conditions
Sueptokinase (300 IU/mi)
Plasminogen (7 U/ml)
Dengue isolates
-2-antiplasmin (0.075 pM)
1.0, 2.5 and 5.0 10 2.510
px 1@ -— 1x 105 pfu. 1x10 pfu.
Ix tO -1x 10 pfu. 1x 107 p.fu.
1.0, 1.5. 2.5 and 5.0pM 1.5 pM
31
roe Tradeananis Lit Emme Somerset
200 Monroy and Ruiz
substrate. In addition, PLG activation was evaluated
in the presence of PEG clarified supernatant from
mock-infected LLC-MK2 cells (100 y) at a concen-
tration of 0.3 mg/ml).
Fibrinogenifibrinolvsis assays. These assays were
performed with 100p1 of fibrinogen (10mg/ml)
instead of fibrin (Sigma Diagnostics, Si. Louis) and
processed in the same way as the assays described
above.
Inhibition of fibrinolysis assays. To the prepared
fibrin matrices were added 10 pl of 7 U/m! PLG, 10pt
of 0.075 mM 2-2-antiplasmin and 100 pl of each viral
isolate (1x 10*-1x 10° p.fiu.). plus 100pb of chromogenic substrate (3 2M). Positive controls also
contained 3p) of streptokinase (SK) (500 U/ml).
All the samples were incubated at 37°C in a humid
chamber and absorbance was read at 405nm. for
90min after kinetics were staried. The negative
controls were performed in the same way, adding
100 ul of rotavirus, vaccinia virus (1 x 10° p.f.u.) or
100 ul of the PEG clarified supernatant from mock-
infected LLC-MK2 cells (0.3 mg/ml). All assays were
performed in triplicate.
Purification of the dengue virus envelope protein
(E). To evaluate the viral particle component which
could be responsible for plasminogen activation (E
protein is the only protein present on the viral surface)
we proceeded to purify the glycoprotein of the viral
envelope taking as prototypes for dengue fever. the
dengue 2 Mexican strain (D2 M) and for hemorshagic
dengue the Indonesia dengue 2 isolate (D21). These
isolates were purified in the way described above and
sonicated for 60 min in an Ultrasonic Cleaner (Cole-
Parmer) at 60 MHz and dissolved in 0.5% (w/w) B-
octylgiucopyranoside: subsequently they were incu-
bated for 1h ar 4°C. After this lapse, they were
centrifuged at 8000 g for 60 min at 4°C. to precipiiate
viral non-membrane proteins. This solution was then
incubated for 1h with 3.9uM_ heparin-sepharose.
based on a concentration of 780 zg of heparin/m! of
gel. The E protein was eluted with 10mM PBS pH
7.4/0.5M NaCl. The purity of this protein was
confirmed by high performance liquid chromato-
graphy (HPLC) and 12.5% SDS-PAGE. Gels were
stained with Coomassie Brilliant Blue solution. In
Western blot analysis, the envelope protein was
transferred from SDS-PAGE to nitrocellulose sheets
32
(14). The E protein was detected with an anti-dengue
antibody obtained from the serum of mice immunized
with D2M dengue and peroxidase conjugated anti-
mouse immunogiobulin antibodies (ATCC) and the
substrate 4-chloro-naphiol (Sigma).
Biotin label of E protein and PLG. The E protein
(20 mg/ml) was dialyzed against 0.1 M NaHCO; pH
8.0, and later dialyzed with D-biotin-N-hydroxisucci-
mide ester (Boehringer Mannheim Biochemica)
previously dissolved in DMSO at a final concentration
of 0.1M. Unbound biotin was eliminated by exhaus-
tive dialysis in 1OmM PBS pH 7.4. The plasminogen
(3 mg/ml) used in this assay was stabilized with BSA,
therefore. before biotinylation it was purified by
HPLC. Biotinylation was performed using the method
described above for E protein. :
Binding assays with PLG and E protein. Polyacryl-
amide get electrophoresis was performed in the
presence of SDS using 12.5% polyacrylamide gels
with Laemmli'’s discontinuous buffer system, under
reducing conditions. Proteins separated were detected
by staining with Coomassie Brilliant Blue solution. In
Wester blot, proteins were transferred from SDS-
PAGE to Immobilon-P transfer membrane sheets
(Millipore), The proteins which bind to PLG
(streptokinase, plasminogen and 2-2-antiplasmin)
were detected by incubation of membranes with
biotinylated PLG. diluied 1:1000 in 10mM PBS pH
7.4 and developed with peroxidated sireptavidine,
diluted 1:2000 in 10mM PBS pH 7.4 and diamino-
benzidine, diluted 1:100 (w/v) in 0.1% PBS/H.O,
(Sigma). Both PLG and its digestion fragment
corresponding to Kringies 1. 2 and 3 (k123), bound
to biotinylated E protein (0.3 mg/ml). diluted 1:1000,
developed in the same way as plasminogen.
Digestion of plasminogen. The PLG fragments:
ki23, k4 and protease domain of plasminogen were
obtained by elastase digestion (Boehringer Mannheim
Biochemica) with 5 mg of elastase/g of PLG at 25°C.
Protein homology analysis, The amino acid
sequence of envelope proteins D2 M and D2] (Gene
bank access DENPPSP), was aligned with the COOH-
terminal region of x-2-antiplasmin (aa 425-452)
which is known to bind to LBS } of plasminogen (15) using the software Clustal W 1.7 which employs the maximum parsimony based on this alignment.
Statistical analysis. Percentage of activated PLG
was calculated with the mean (x) of three independent
samples. The value for 100% activated PLG was
considered as the maximum absorbance produced by
activation with SK at 405nm. Differences in PLG
activation between samples and positive controls were
determined by #-test analysis for independent samples,
comparing means and variance (standard deviation)
between the two groups (16). In all cases, the negative
control values also were analyzed.
Results
Activation of plasminogen by dengue viruses in the
presence of fibrin. This analysis allowed us to infer
if the dengue virus was capable of activating PLG and
assess differences in the behavior of isolates. In the
assay, we used a chromogenic plasmin substrate that
liberates p-nitroanilin (yellow), which absorbs light at
405 nm when zymogen is conversed to plasmin. This
allowed us 10 measure the phenomenon and proviced
a positive control (fibrin + PLG — SK).
As shown in Fig. t, D2M (dengue fever) and D2]
(hemorrhagic isolate) activated PLG in a similar way
120 2 ~- SK
99 | > 32m § on
SB so 4 = 710 2 ee Ln 8 «| oo < | ne & J 6 40-5
&
E 24 a a
‘ Time (min)
Fig. 1, Plasminogen activation by dengue virus. Plasminogen
{PLG) was acrivated with dengue 2 Mexican isolate (D2M) as
well as dengue fever and dengue 2 hemorrhagic Indonesia strain
(D721) (1 x 10° p.f.u.) in the presence of fibrin. The positive
control was activated with streptokinase (SK). The negative
controls contained: vaccine virus (MVA) or rotavirus (RRY) or
100 p! of PEG supematant clanfied mock-infecied cells (LLC-
MK2: 3 mg/ml) The negative conuals were added with 10,1 PLG
(7 U/ml). in presence of fibrin mesh, Data show the average of
three independent samples = 1 SD (standard deviation) with 3
p< 0,005 compared with the positive contro! (SK).
33
Wh gee aeaoem ¢ Pettnnest beta Cones
Dengue Vins in the Fibrinolytic Process = 201
to streptokinase (SK). SK, in fact, activated the
zymogen more rapidly than viral particles. As shown
30 min after initiating kinetics, SK activated 67.9% of
the PLG, while D2M and D2I activated 36 and 49.2%
respectively in the same period. The D2I isolate
activated PLG more efficiently than D2M in a range
of 12.8% to 19.6% within the lapse of 30 to 60 min of
the kinetics. We also demonstrated the specificity of
activation, since the values presented by the four viral
serotypes under the optimal conditions of our assay
were significantly greater than the negative controls,
i.e. PEG clarified supernatant from mock-infected
LLC-MK2 cells (10.5 + 4.3 at 90min), as well as
vaccinia and rotavirus which did not activaie PLG
(5.5 + 2.5 and 3.8 + 1.3% respectively, at 90 min).
We demonstrated that the dengue vinuses activated
plasminogen and generaied plasmin (the enzyme
involved in fibrin degradation), probably by a
mechanism similar to that proposed for SK (17).
Activation of plasminogen by dengue viruses in the
presence of fibrinogen. Considering that in dengue
hemorthagic fever no direct correlation has been
reported between the presence of disseminated
intravascular coagulation and the establishment of
hemorrhage (18) we decided to determine if the virus
per se was capable of inducing plasmin generation in
the presence of fibrinogen (Fg), and tested it with
different dengue fever and hemorshagic isolates, as
well as with other unrelated viruses such as vaccinia
and rotavirus. As shown in’ Table 3. the dengue virus
and SK activate PLG reaching 100% piasmin
generation, mostly after 90 min, with a similar kinetic
behavior as in the presence of fibrin. This indicates
that the dengue viruses were capable of activating
PLG both in the presence of fibrin and of fibrinog :
Negative controls are not shown in Tabie 3, because
they were subtracted in all cases.
Plasminogen activation by dengue virus with x-2-
antiplasmin (2-2-AP). According to the present
results, the dengue fever and hemorvhagic dengue
strains activate PLG and we therefore decided to
analyze the regulation of this phenomenon. Various
assays were performed in the presence of 2-2-AP. a
protein present in the bloodstream which specifically
inhibits plasmin, and whose function is to regulate the
levels of active plasmin (19). As shown in Figs. 2a and
2b, D2M and D21 activated PLG to different degrees
in presence of the inhibitor, which could be favored by
Treetpnls Lid Fonme Somenet
202 Monroy and Ruiz
Tuble 3, Plasminogen (PLG) activation by isolates of dengue fever and hemorrhagic dengue in the presence of fibrinogen at 90 min
Dengue Fever
Hemorrhagic Dengue
Sampie Serotype Activation of PLG Sample Serotype Activation of PLG
7797 1 98.0= 2.5 3730 1 100 = 3.5
6300 1 82.02 3.0 3731 t 95.38 = 2.8
D2M 2 100 + 3.5 D2 2 100 = 21
TAMP 2 100 + 2.8 COL 2 100 = 3:8
3504 3 100 + 3.2 6065 3 105 = 2.4
5936 3 100 + 1.8 4637 3 100 = 2.8
9414 4 100 = 18 DIG 4 101 + 32
8307 4 $3.02 2.3 D4 4 98.3 = 2.3
Positive Control
Sureptokinase
Plasminogen 10 pi (7 U/ml) was activated with di
Activation of PLG 100 = 2.7
fferent isolates of dengue viruses (1 x 10° — I x 10° p.f.u.) in the presence of Abnnogen. The
positive control was activated with 5 yl of streptokinase (SK) (300 Uva. The negative controls contained: MVA or RRV and PEG supernant
clanfied mock-infected cells (LLC-MK2) were subsiracted in all cases. Data show the average of three independent samples = | SD (standard
deviation) with a p <0.001 comopared with the posiuve control.
the regulation mechanisms of the plasminogen/
plasmin system. In the presence of 2-2-antiplasmin,
D2I activated PLG in a period of 40 to 90min with
greater efficiency in the range of 14.9 to 26.7%. with
respect to the viral particle. while SK diminished from
100% to 10.2% in the same period. in presence of the
inhibitor. On the other hand, isolates proceeding from
different dengue fever viruses of the four serotypes
(see Table 4, 90 min after kinetics initiation) behaved
in a similar way as D2M. On the contrary, in dengue
hemorrhagic fever virus isolates, PLG activation was
similar to that presented by D2I. As shown in Table 4.
in assays of dengue fever isolates, 1-2-AP signifi-
cantly inhibits the activation of PLG in the four
serotypes. This behavior is similar to that exhibited by
the positive control (F+SK —PLG), in which PLG
activation also diminished from 100% to 10.2%. In
contrast, in dengue hemorthagic fever samples (D2I.
COL and 4637). the conversion of zymogen to
plasmin was, im some cases, greater than 100%
compared with SK. In the hemorrhagic isolates
3730, 3731 and 6065, PLG activation was 93.1, 94.6
and 97.4% respectively, which suggests different
degrees of activation. These results demonstrate that
the interaction of PLG with the dengue fever viral
particles is not the same as with DHF viral particles.
Based on our observations, we can propose that the
DHF isolates compete with 2-2-antiplasmin, indi-
cating that viruses from DHF patients may perhaps
enhance the fibrinolytic process.
34
PLG activation by the envelope protein (E) of the
dengue virus. To determine which component of the
viral particle could be responsible of activating
plasminogen. and considering that E is the only
protein on the viral surface. we purified this protein
using the viral isolates D2M and D2I. They were
identified with polyclonal antibodies directed against
the E protein (Fig. 3). During the activation assays. a
saturation effect was observed which depended on the
concentration of the protein, starting at 6Gpg. We
therefore chose Sjg as the optimal concentration of
purified protein. As shown in Fig. 4 (D2M. Fig. 4a and
D2I. Fig. 4b), E protein from both sources was able to
activate the zymogen molecule: however. E protein
from the DHF virus activated the molecule more
efficiently than E protein from the dengue fever virus.
Considering that the viral envelope protein constituted
approximately 10% of the total virus weight, we
evaluated PLG activation with 50 ug of total protein,
and found a similar behavior between the total virus
and the purified protein. Based on this, we propose
that the viral envelope protein participates directly in
the activation of zymogen, as well as in the
fibrinolysis mechanisms. and consequently in the
hemorrhagic phenomenon.
Proteins which bind to PLG. To characterize the
mechanism involved in this phenomenon, we deter-
mined if E protein is able to bind to PLG. A Westem
blot analysis (Fig. 5) was performed with the
a
120
z = SK z 100 —
¢ ~e SKea2aP 2 % eo4 -> 02M > 3 me DeMea2AP
@ 804 e 3 a Qo 40-7 = € y.-4
gq 207 a = deck pe 24
o- ” : oOo
a 10 20 30 4a 5080 *
Time (min}
140 b
= ~~ 02 : RF 04 . a
cc me 0216 a2AP ae
BO) we SK 2 2 apy — Sk+a2aP 3 a < #04 3 Dp
g 404 € 1
3 | Q 20-4
= sgn. pe S- S ! ots “S_ < + =
+ : z t ———> 7 ° 0 20 «3040 80 99
Time (min)
Fig. 2. Fibrinolysis inhibition assays by dengue virus in the
presence of x-2-antiptasmin (22.P). Panel a. 1Oyl (7 U/ml) of
plasminogen were activated with dengue 2 Mexican isolate
(DIM) (1 x 10° p.f.u.). Inhibition was accomplished using 10p!
(0.075 pM) of 2-2-antiplasmin (D2M + 22AP). The positive
control was activated with 5 pl (500 U/ml) of sueptokinase (SK)
and inhibition of the SK was accomplished with iQ pi (0.075 23)
of -2-antiplasmin (SK — 22AP). Data show the average of three
independent samples = } SD (standard deviation) with a
p <0.005 compared with the positive control. Panel
b. Plasminogen was activated with dengue 2 Indonesia isolate
{D21) and inhibition was accomplished using 10 ul (0.075 pM) of
a-2-antipiasmin (gi = 12AP). Assays were performed as for
D2M. Data show che average of three independent samples = !
SD (standard deviation) with a p <0.005 compared with the
positive contro! (SK).
following proteins which participate in the plasmi-
nogen-piasmin system: lane 1, plasminogen and
albumin: lane 2. streptokinase; lane 3, a-2-anti-
plasmin: lane 4. total D2 viral extract, and lane 3.
D2I viral envelope protein isolate, and identified with
biotinylated PLG (Fig. 5a). As shown in Fig. 5b, PLG
was able to bind to itself (lane 1), to x-2-antiplasmin
(lane 4) and to streptokinase (lane 5), which were
35
Dengue Virus in the Fibrinolytic Process 203
previously known to bind to the zymogen (20).
Additionally, PLG also bound to E protein, both in
the total viral extract (lane 2) and with the pure protein
(lane 3). The same assay was performed with the D2M
viral extract and the D2M viral envelope protein
isolate with the same results as D2].
Binding of the viral E protein with PLG. To evaluate
the binding of the E protein to PLG, a Western blot
analysis was performed using the biotinylated
E protein and analyzing it together with the previous
assay (Fig. 5a). As shown in Fig. 5c, the only band
which appeared corresponds to PLG (lane 5), which
makes the binding of E-PLG specific, since no other
of the proteins present (x-2-antiplasmin, SK, albumin
and E protein) bound to E. On the other hand, we also
discarded that E protein binds to 2-2-antiplasmin.
which suggests that the exacerbation of PLG
activation caused by D2I isolaies in presence of the
inhibitor may be due to the presence of zymogen and
not to 2-2-antiplasmin.
Characterization of the E-PLG binding. Once the E-
PLG binding was demonsirated we attempted to
identify the region of the PLG molecule (iysine
binding sites (LBS. found in the Kringle domains) or
catalytic domains) to which E protein binds. Initially.
we performed ELISA assays blocking the E-PLG
binding by means of lysine addition, which blocks the
LBS binding sites at various concentrations (0.25. 0.5
and | M). As shown in Fig. 6a. both E protein of D2M
and of D2I isolates were inhibited by 35% in the
presence of 0.5M lysine, which suggested that E
protein could be binding to PLG in a region that
included the LBS. The PLG molecule has 2 lysine
binding sites: LBS 1 of 38kDa (which includes £1~3)
and LBS 2 of 10kDa (which contains Kringle 4). To
establish the region involved in the binding, PLG was
digested with elastase. As shown in lane 3 of Fig. 6b
(PLG in the presence of BSA digested with elastase by
SDS-PAGE), PLG produced the following hydrolysis
products: LBS 1 (38kDa). LBS 2 (10kDa). and
Kringle 5 (10 kDa) plus the catalyuc domain (25 kDa).
The BSA digestion products were also present (Fig.
6b, lane 2). However, E protein only reacted with
(digested or non-digested) PLG (Fig. 6c. lanes 3 and
4) where the bands correspond to 38 and 92 kDa. As
shown in the negative controls. such as digested BSA
(lane 2) and elastase (lane 1), there is no sign of E
binding, with which we also discarded an unspecific
204 Monroy and Ruiz
Table 4. Fibrinolysis inhibition assays in the presence of dengue fever and hemorrhagic dengue virus isolates at 90 min
Hemorshagic Dengue
Dengue Fever
Sample Serotype a-2-Antiplasmin Activation of PLG Sample Serotype a-2-Antiplasmin Acuvation of PLG
7797 1 - 99.72 3.6 3730 1 - 100 = 25
+ 74425 + 93.1 + 3.6
6300 1 - 84.7 = 5.2 3731 ! ~ 93.02 25
+ 6.8 = 3.2 + 94.62 1.6
D2M 2 - 100 + 1.0 D2 2 - 100 + 33
+ 732 26 + 104 = 2.0
TAMP 2 - 100 + 21 COL 2 - 100 = 35
+ 752 35 + 108 = 28
$504 3 - 100 = 2. 6065 3 - 105 1.5
+ 702 22 + 97. LS
5936 3 - 100 = 2.1 3637 3 - 100 3.0
+ $5 = 15 + 103 = 2.0
9414 4 - 100 212 DaG 4 - 100 = 35
+ 70= 1.2 - 98 = 28
$307 4 - 85.0 = 18 DIO 4 -
> 632 012 -
Positive Control
Sureptokinuse (SK) 2-l-aniplasmin
g-Q-anuplasmin
Negauve Conirol
Rotavirus (RRV)
Vaccinia MIVA)
LLC-MIAKZ imock infected)
= 2-2-anuplasmin
nuplasmin
nupiasmin
Plssminogen 1Q ul (7 U/ml) was activated with different isolates of dengue viruves proceeding from DF/DHF (1 x 10° - 1x 10° p.f.u.) 1m the
presence prin. The positive contro) was acti ated with Sul of SK ($00
PBS 10 mM pH 7.4. The negative controls contained: MV'A and RRV viruses «1 «I
UOimh. Assays with 2-2-antiplasmin contained 1041 (0.075 pMs ia
O° p.f.u.yor LLC-MK2 (100 pl) of PEG supernatant clantied
from mock-infected ceil (3 mg ml). Data show an average of 3 independent samples = | §D (standard devianon) with ap <0.001 compured
with the positive control.
binding of the E protein which could be a product of
BSA digestion.
On the other hand, DHF isolates were able to
compete with 2-2-antiplasmin, exacerbating PLG
activation. We therefore decided to characterize this
event. Initially, we analyzed the primary sequence of
the region responsible for the binding of the inhibitor
(aa 425-482) to the LBS 1 of PLG and proceeded to
search for a sequence in E protein which could show
similarities with that region of the x-2-antiplasmin.
One region was found which comprises amino acids
359-390 of E protein. The amino acid sequence
comparisons of the E protein and the binding region
of x-2-antiplasmin to LBS 1 shows four identical
36
amino acids (*) and one similar amino acid (20%
identity).
E-protein of dengue: EAEPPFGDSYNIGVEPGQLKLD
KLVPPMEEDYPQFESPK a-2-antiplasmin:
This suggests that E protein could bind to PLG at this
site and thus compete for it with 2-2-antiplasmin.
At present, our results suggest that the dengue
virus. in particular the envelope protein, can be
panicipating directly in PLG activation and in the regulation mechanism of fibrinolysis. which could
UU 345 6
Fig, 3. Wesiern blot of dengue virus envelope (E) protein.
The Westem biot of the purified E protein obtained from c
supernatants, was dissolved with n-octyl-§-D-glucopyranosi¢e,
using polyclonal anti-dengue anubodies as described in Material
and Methods. Lanes are as follows: (1) Molecular weight mas
(190, 116, $4, 66. . 29 and 24 kDa). (2) dengue 2 Mexizan
isolate (D2M). (3) dengue 2 Indonesia isolate (D2N. (4)
glycoprotein £ of D2M viral isolaie. (3) glycoprotein E of D2
viral isolate. (6) negative control (D2M viral eatract) which
reacted with normal serum.
$
alter the homeostatic processes of the host causing an
unbalance of Aibrinolysis-clotting. an imbalance factor
to establish hemorhage.
Discussion
The pathogenesis of DHF is not fully undersioed.
Multiple factors including host. epidemiological. and
virus factors may contribute to the severity of the
disease (21). In this sense, several theories have been
proposed. The ADE theory postulates that circulating
antibodies irom a primary infection bind to hetero-
logous infecting virus, enhancing infection of mono-
nuclear cells (22.23). However, the pathogenesis of
primary hemorrhagic cases and the infection of cells
lacking Fe receptors has not been resolved, The
occurrence of primary infection cases which develop
into DHF/DSS (6.24) is indicative of the role of host-
reJated factors and variations in the virus population
37
Dengue Virus in the Fibrinolytic Process 205
a) Dengue Fever
-e F+PLG+SK
Plasminogen
activation
(%)
7 oO 20 40 60 80 100 120
Tire (min)
b) Remorrhagic Dengue
B F4SKePLG
oe 02
co- E-021
Plasminogen
activation
(%)
60
40
20
0 T 7 7 7 T oO 20 40 60 60 100 3120
Time (min)
Fig. J. Plasminogen activation by E protein of dengue viruses.
Panel a. 1041 of plasminogen (7 U/ml) were activated with
dengue 2 Mexican (D2 M) isolate (301 of total protein} and
Sug of E protein from D2 M in the presence of fibrin. The
positive control was activated with 5 yl (500 Oupmn of
streptokinase (SK). Data show the average of three independent
samples + 1 SD (standard deviation) with ap <0.1. Panel b.
Plasminogen was acuvated with dengue 2 Indonesia (D2}) and E
protein (from D2} in the presence of fibna. Assays were
performed as for D2 M. Data show the average of three
independent samples = 1 SD (standard deviation} with a p<0.1
compared with DI and puriried E protein obtained trom D2.
that can give rise to more virus strains (7). Evidence is
gathering that intra-isolate variation plays an import-
ant role in the pathogenesis of several RNA viral
diseases (25). Recent studies have also demonstrated
disease severity related to molecular differences
between dengue viruses (26.27). Both hypotheses
are supported by research data and both are probably
involved in the occurrence of severe manifestations of
DHF cases, but, until recently, research on dengue
pathogenesis has almost exclusively relied on studies
of host factors. At present. no reports are available to
206 Monroy and Ruiz
iD) {c]
wt ee PLS
3 «5 12 24 5t 23 4 6
Fig. 5. Proteins which bind to plasminogen (PLG) and envelope
protein (E) of dengue virus. Elecuopheresis gels (12.5% SDS-
PAGE) were mun under reducing conditions in the Laemmli
(1970) buffer system and stained with Coomassie Brilliant Blue.
Pane? a. Lanes are 2s follows: (1) plasminogen, (2) total virus
extzact (D2), (3) E protein from D21 isolate, (4) 2-2-antiplasmin.
(5) streptokinase. Panel b. Western blot with diotin-labeled
plasminogen, Lanes are as follows: (1) plasminogen, (2) total
virus extract (D2), (3) E protein from D2l isolate. (4) 2-2-
antiplasrnin, (5) streptokinase. Panel ¢, Western blot with biotin
labeled E protein (from D2I isolate). Lanes are as follows: (1)
streptokinase, (2) x-2-antiplasmin, (3) E protein from DIL. (4)
total virus extract {D21) and (5) plasminogen. The arrow points io
the band corresponding to PLG.
demonstrate the direct participation of the virus per se
in the hemorrhagic phenomenon. We evaluated the
biological activity of various viral isolates proceeding
from dengue fever and hemorthagic cases in an in
vitro model of fibrinolysis.
Our findings suggest that the dengue virus itself (all
serotypes) has the ability to convert plasminogen to
plasmin (the major effector protein of fibrinolysis)
independently of the presence of fbrin/fibrinogen.
These results allow us to infer that the presence of
fibrin clots are not an indispensable factor for the virus
to activate PLG and in consequence the dengue virus
can be considered as a potential factor in the
triggering of the hemorthagic phenomenon.
The evaluation of the specificity of our PLG
activation model by dengue virus was performed with
both, the PEG clarified supernatant from mock-
infected LLC-MK2 cells, as well as with other viruses
(rotavirus and vaccinia) which do not present PLG
activation, which validated our assay.
Although the dengue fever and hemorrhagic strains
were capable of activating plasminogen, only DHF
isolates were found to compete with 2-2-antiplasmin
(which was used at concentrations simijar [to
physiologic, t mM) indicating that these viruses may
enhance the fibrinolytic process. We found different
degrees of activation of PLG. which could be related
38
Charactertzation of the PLG-E protein binging, ®) oF o
Inhibition
of bi
ngin
g PLO-E
protein
(%)
a
Fig. 6. Chayacterization of the PLG-E binding. Panel a.
Identification of the fragment of plasminogen which binds to the
dengue virus E protein. Proteins were analyzed by 12.5% SDS-
PAGE under reducing conditions in the Laemmli (1970) buffer
system and stzined with Coomassie Brillian: Blue. Lanes are as
follows: (1) elastase (26 kDa), (2) BSA digested with elastase, (3)
plasminogen digested with elastase and stabilized with BSA, (4)
plasminogen (92 kDa) stabilized with BSA. Panel b.Wesiem dlot
with biotin labeled E protein. Lanes are as follows: (1) elasizse.
(2) BSA digested with elastase, (3) plasminogen digested with
elastase stabilized with BSA, (4) plasminogen (92 kDa) stabilized
with BSA. Arrows indicare plasminogen reacuvity and the lysine-
I binding site (LBS 1). Binding was accomplished by addition of
biotin labeled E protein (diluted 1:100 in 10 mM PBS. pH 67.4.
Peroxidase activity was revealed with streptavidin (1:1000) and
0.02% diaminobencidine in 10mM PBS. pH 7.4. and 0.02%
hydrogen peroxide. Panel c. Inhibition of biotin-labeled E provein
with PLG. Plasminogen (5 ug) was fixed in 96-well ELISA plate,
and unspecific binding was blocked with bovine serum albumin
(BSA, 3% w/v) and Tween 20 (0.3% v/v) in 10mM PBS. pH 7.4.
The binding was accomplished by adding labeled E protein
(diluted 1:100 in 10mM PBS. pH 7.4), Peroxidase activity was
revealed with a solution of sodium citrateyesuic acid (0.03/0.02%)
in water.
with individual characteristics (structural and func-
tional) of the viral isolates and. in consequence. with
variations among the virulent strains.
The exacerbation of plasminogen activation in
presence of 2-2-antiplasmin by the DHF isolates
could, in part, explain the multiple defects observed in
DHF cases, such as the decrease in fibrinogen and
plasminogen, and the rise in florinogen degradation
products (28).
Purified envelope protein shows the same PLG activating activity as the whole virus, independent of
the strain (dengue fever or DHF).
Our results indicate that E protein can bind to
plasminogen/plasmin at the site corresponding to LBS
1 of the zymogen molecule. This domain. beside
being involved in interaction processes of PLG with
its activators and inhibitors, also interacts with the
fibrin surface and the cell surface, and affecis
regulatory functions, which are mediated by the
lysine binding sites associated with the plasminogen
Kringle domains. This induces conformational
changes which lead to the generation of plasmin ”
(29). The binding of E protein with PLG probably
induces a conformational change in zymogen to
confer it enzymatic activity by a mechanism similar
to that proposed for streptokinase (SK, does not show
catalytic activity) (30). In particular, for E protein, no
catalytic activity has been reported which could be
related 10 PLG activation.
Exacerbation of PLG activation caused by DHF
isolates could be due to the different interaction of the
E protein with LBS 1 of PLG and/or plasmin. or with
the carboxyl terminal of the x-2-antiplasmin (aa 4273-
452), which plays an important role in fibrinolysis
regulation. Resulis shown here suggest that the DHF
isolates compete with the inhibitor (4-2-antiplasmin)
either altering or preventing inhibition, an effect
which causes an increase in the regulation of the
plasminogen/plasmin sysiem.
Ina manner analogous to the molecular structure of
the tick-bome encephalitis virus (TBE) E glycopro-
tein homodimer, the dengue E glycoprotein folds in
three functional domains. named I. 0 and II. Domain
II] (aa 303-395) of the dengue E protein shows 20%
amino acid homology with the carboxyl end of the 2-
2-antiplasmin molecule (which binds to LBS 1 of
PLG). The lateral surface of the E domain MI
(immunogiobulin-like) is suggested to contain Tesi-
dues involved as determinants for host range. tropism.
virulence. protective immune response and glycosa-
minoglycan binding motifs implicated in virus cell
attachment in different Flaviviruses (31.32.33).
We propose that fine interaction differences in this
region of the E protein can be involved in homeosiasis.
In summary, the above results present the first in
vitro model which aims to explain the role of the virus
per se in the hemorrhagic phenomenon (beside the
participation of host faciors and immunological
status) and its interaction with host plasmatic proteins.
Additionally, the plasminogen system is involved in
the fibrinolysis mechanism with other imponant
processes. such as the clouing cascade, the platelet
system, and the complement and C protein system.
which are altered during DHF.
Currently, various assays are under way which
39
‘
/
Dengue Virus in the Fibrinolytic Process 207
intend to elucidate, at molecular level, differences in
the interaction of the DF vs. the DHF isolates and their
implication in the hemorrhagic phenomenon. This
new approach will clarify the importance of viral
factors in dengue hemorrhagic fever.
Acknowledgments
We are grateful to Dr. Rosales and Dr. Padilla
(Molecular Biology Department, 1B) for providing
vaccinia and rotavirus isolate sampies. The authors
wish to thank to Dra. Irma J. Sanchez Vargas, Eva Ma.
Reyes and Ms. Isabel Pérez Montfort for preparation
of the manuscripts.
This work was supported in part by grant
IN214494 (DGAPA/UNAM), and by granis SC-
003996 (DGSCA) and 201418 (PADEP/UNAM).
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RESULTADOS ADICIONALES.
Productos de degradaci6n de la fibrina (PDF):
Para comprobar que en presencia de fibrina (F), el virus del dengue activaba a la
plasmina en forma especifica y que esta a su vez podria hidrolizar la malla de fibrina, se llevé
a cabo un SDS-PAGE al 12.5% en condiciones no reductoras con las muestras anteriores. Se
observaron tres bandas compartidas, de un peso molecular aproximado de 15, 25 y 30 kDa
entre el control positivo (F+PLG+SK) y los ensayos que contenian los virus (F+PLG+D2M) y
(F+PLG+D2I!). Estas bandas podrian corresponder a productos de degradacién de la fibrina
(Fig. 11). De la misma manera se analizaron las muestras activadas en presencia de
fibrindgeno (Fg). En la figura 12 se pueden apreciar tres bandas compartidas entre e! control
positivo (Fg+PLG+SK) y los ensayos que contenian los virus (fg+PLG+D2M) y
(Fg+PLG+D2I). Estas bandas presentaron un peso molecular aproximado de 50, 30 y 25 kDa,
la primera podria corresponder al fragmento E de los productos de degradacién del
fibrindgeno, ya que presenta exactamente el mismo peso molecular, tomando en cuenta que el
fragmento de 50 kDa puede continuar hidrolizandose a productos de menor peso.
Activacién del plasmindégeno por el virus del Dengue en presencia del péptido E:
Con base en la similitud encontrada entre la a-2-antiplasmina (a-2-AP) y la proteina
de envoltura viral de dengue, procedimos a evaluar la activacion del PLG en presencia de un
peptido sintético (E). El] péptido E contenia la secuencia procedente del virus de FHD.
Inicialmente determinamos la concentracion optima para llevar a cabo la activacién del
plasmindgeno, para lo cual manejamos diferentes concentraciones. Como se puede observar
en la figura 13a, la activacién del plasmindégeno Ilevada a cabo por el virus de Dengue 2
Mexicano, no se ve afectada al adicionar 2 y 4 yg del péptido E; sin embargo, al adicionar
6 pg del péptido, la activacion va disminuyendo en forma creciente hasta llegar al 30% a los
90 minutos de iniciado el ensayo, nosotros pensamos que este fendmeno puede ser debido a la
elevada concentracién del péptido, el cual puede estar obstaculizando la actividad de las
particulas virales. Los controles negativos, los cuales unicamente contenian el péptido E mas
los reactivos de activacion del PLG, no generaron actividad, por !o que no se observan en la
figura 13a y 13b.
4i
1 2 3 4 5 6 FDP
+ 30
+ 25
#15
Fig. 11. Ensayos de fibrinolisis a partir de fibrina.
Analisis de los productos de degradacién de la fibrina mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras.
1) Fibrina (F), 2) F+Estreptocinasa (SK), 3) F+Plasminégeno (PLG), 4) F+PLG+SK, 5) F+PLG+dengue 2 Mexicano y 6) F+PLG+Dengue 2 Indonesia.
42
1 2 3 4 FegDP
Fig. 12. Ensayos de fibrinolisis a partir de
fibrindégeno. Analisis de los productos de degradacién del fibrindgeno (Fg) mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras. 1)F+SK+PLG, 2)Fg+SK+PLG, 3) Fg+PLG+D2M y
4)Fg+PLG+D2I.
43
Activacion del plasminégeno por el virus del Dengue en
presencia del péptido "E"
a)
120 _- —c~ D2M
100 “2° D2M+2pg”E” --%- D2M+4ug”E” “*O- D2M+6ug"E”
wo oOo
a Oo
> Oo
N Oo
Activacién
del
plasmindégeno
(%)
0 20 40 60 90 Tiempo (min)
b)
160 - : To Te
140 - D21 D2I+2pg”E”
120 D21+4yg”E” 100 D2I+6ug”E”
80
60
40
20 -
poi
+o oe
Activacién
del
plasmindégeno
(%)
0 20 40 60 90
Tiempo (min)
Fig. 13. Activacién del plasminégeno (PLG) por el virus del Dengue en presencia del
péptido “E”. 10 pl (7U/ml) de PLG fueron activados por los aislados virales a) Dengue
2 Mexicano (1x10* u.f.p.) y b) Dengue 2 de Indonesia (1x10* uf.p.) en presencia de
fibrina y el péptido “E” (2, 4 y 6 ig). Los datos muestran los resultados de 3 ensayos independientes trabajados por separado + 1 SD (desviacién estandar) con una p<0.001
comparada con el control del virus en ausencia del péptido “E”.
44
Por otro lado, el virus de Dengue 2 de Indonesia, el cual es procedente de un caso de
FHD, logré activar el 100% del PLG a los 90 min de iniciada lacinética. Como se puede
observar en la figura 13b, cuando se llevo a cabo la activacién del PLG en presencia del
péptido E con las particulas virales de D2I, su respuesta fue totalmente diferente al de Dengue
Clasico, ya que con 2 y 4 ug del péptido E, se observé un incremento en la activacién del
PLG a partir de los 20 minutos, Ilegando a ser de 138% a los 90 minutos con 4 yg del péptido.
Por el contrario, con 6 pg del péptido E, observamos una ligera inhibicién de la actividad, por
lo cual elegimos como concentracién éptima la de 4 pg. En el caso del Dengue Hemorragico
la mayor concentracién del péptido (6 1g), es probable que la inhibicién pueda ser debida al
efecto de concentracién como sucede con el D2M.
Estos resultados sugieren la posibilidad de que el péptido E que comprende la region
359-390 de la proteina de envoltura viral procedente de FHD, pueda no ser el unico sitio de
union del virus con el plasmindgeno.
Activacién del plasminégeno por el virus del dengue en presencia de la «-2-antiplasmina
y el péptido E:
La activacién del PLG por el aislado de Dengue Clasico (D2M) en presencia del
péptido E y ja a-2-antiplasmina, no se ve afectada, ya que como se puede observar en la
figura 14a, presentan la misma actividad el virus de D2M en presencia del inhibidor y este
mismo con el péptido E adicionado. Como se puede observar en la figura 14b, el Dengue 2 de
Indonesia estando presente el péptido E se inhibié gradualmente, alcanzando el 25% a los 90
minutos de iniciado el ensayo. Estos resultados nos sugieren que existe competencia entre la
c-2antiplasmina y el péptido E, los cuales comparten el sitio de union con el plasmindgeno.
Aunque la cepa procedente de FHD no se logré inhibir totalmente con el péptido estando
presente el inhibidor, es clara la competencia; nosotros pensamos que probablemente la
secuencia del péptido E, no es el tnico sitio donde la proteina de envoltura del virus se une al
plasmindgeno con base al efecto aditivo que se observa con el péptido E y la competencia con
el inhibidor. 45
Acti
vaci
én
det
plasminégeno (%)
a) 120
100
80
60
40
20
b)
Acti
vaci
én
del
plas
miné
geno
(%
)
Activacién del PLG por el virus del dengue en presencia de alfa-2-antiplasmina y el péptido
oe"
120
100
80
60
40
20
+7 >> D2M+a-2AP
= = D2M+a-2AP+"E”
—e— D2M
Tiempo (min)
“74 pot+a-2aP
= & D2I+a-2AP+"E”
—e— D2! a . ¢
oe -
0 20 40 60 90
Tiempo (min)
Fig. 14. Activacién del plasmindgeno por el virus del Dengue en presencia de alfa-2-
antiplasmina (a-2-AP) y el péptido “E”. 10 yl (7 U/ml) de plasmindgeno fueron activados por los aislados virales a) Dengue 2 Mexicano y b) Dengue 2 Indonesia
(1x10* u.f.p) en presencia de 10 pl de a-2-antiplasmina 0.075 mM y 4 pg del péptido E.
Los datos muestran los resultados de 3 ensayos independientes trabajados por separado + 1 SD, con una p<0.005 comparada el control del virus solo.
46
Con los resultados obtenidos podemos sugerir, que efectivamente la region
comprendida del aminodcido 359-390 de la proteina de envoltura del virus del dengue
procedente de FHD, se encuentra involucrada en la unién proteina E-PLG y en la
exacerbacién de la activacién del plasminédgeno por el virus, estando presente la a-2-
antiplasmina.
47
DISCUSION
El desarrollo de la hemorragia durante la infeccién primaria de dengue, es indicativo de
que no solo los factores del huésped pueden contribuir a la severidad de la enfermedad
(Gubler, 1994). Asimismo, es evidente que los factores virales ‘son importantes para el
desarrolio de la hemorragia (Bames, 1974; Rosen, 1977). La presencia de variaciones intra-
aislado en virus RNA (Domingo, et. al, 1993), asi como también las diferencias moleculares
relacionadas con la_ severidad de la enfermedad (Sanchez & Ruiz, 1996) juegan un papel
importante para explicar la patogenicidad de la enfermedad. Con base en lo anterior y en
ausencia de un modelo in vivo, analizamos el proceso de fibrinolisis ocasionado por el virus
del dengue, en un modelo in vitro de activacién de plasminédgeno inducido por la
estreptocinasa (Liu, 1990).
Nuestros resultados demuestran que el virus del dengue independientemente del
serotipo y origen (clasico y/o hemorragico) tiene la habilidad de activar el plasminégeno a
plasmina, que es una enzima clave en la activacion del sistema fibrinolitico. La activacion del
PLG ocurrié tanto en presencia de fibrina como de fibrindgeno, lo que demuestra que la
existencia de codgulos de fibrina no es un factor indispensable para la activacién del
zimégeno. Tomando en cuenta que no en todos los casos hemorragicos de dengue, se
presenta una coagulacion intravascular diseminada que favorezca el incremento de factores de
la coagulacion , nosotros logramos disecar en parte el fenédmeno, determinando que el virus
por si mismo puede activar al PLG a plasmina la cual desencadena la degradacion tanto de
fibrindgeno como de fibrina, generando péptidos especificos. Se ha reportado que los
productos de degradacion tanto de fibrina como de fibrindgeno, pueden activar la coagulacion
sanguinea, iniciando el proceso inflamatorio mediante la quimiotaxis de neutrdfilos, activar a
monocitos para la liberacion de interleucina 1 (involucrada en el recambio de fibrindgeno), asi
como el incremento en la permeabilidad vascular (Jaffe, 1986). Lo anterior clinicamente es
importante, ya que forma parte de la patogenia de la FHD.
La especificidad de nuestro modelo de activacién del PLG por el virus del dengue fue
evaluada con diferentes controles negativos, como el sobrenadante de células LLC-MK2 sin
infectar y virus no hemorragicos como: vaccinia y rotavirus; asi como también se confirmé
con la proteina de envoltura viral purificada.
48
Los resultados mostrados en el presente trabajo son novedosos, puesto que no existen
reportes sobre la participacion directa del virus en el sistema de la fibrinolisis y podrian sentar
algunas de las bases en la interpretacién de diferentes manifestaciones del sindrome
hemorragico como son: la disminucién del PLG, fibrindgeno (Almagro, 1984) y los factores
de la coagulacién V y VIII, probablemente causados por la exacerbacién en la conversion de
plasmina. Esta enzima también es capaz de hidrolizar laminina, fibronectina, asi como
disparar la activacién de enzimas involucradas en la cascada del complemento (Lottenberg,
1994). Lo anterior podria ocasionar por un lado alteraciones en la coagulacion sanguinea y
por otro, la exacerbacién de la activacién de la plasmina, asi como de la fibrinolisis lo que en
conjunto podria alterar la homeostasis favoreciendo la hemorragia.
Por otro lado, mediante la activacion del PLG por el virus del dengue, podemos explicar
el incremento de los inhibidores de la activacién del plasmindgeno (PAI) tanto in vivo como
in vitro, sin alterar los niveles de activadores del plasmindgeno, a lo cual no se le ha
encontrado alguin significado biolégico (Brahamarapravati, 1981). Nosotros proponemos que
el aumento de los PAI podria ser resultado de la exacerbacién de la activacion del PLG
durante ja infeccién por dengue, en un intento del organismo por controlar los niveles de la
enzima generada y posiblemente sea la razdn de que no en todos los casos se desarrolle la
hemorragia.
Nosotros encontramos diferentes grados de activacién del plasmindgeno, lo que podria
reflejar diferencias en las caracteristicas individuales tanto estructurales como funcionales de
cada aislado, resultando en un amplio espectro en la expresion de la virulencia.
La activacién del PLG por la proteina de envoitura fue similar a la observada con la
particula viral completa, con base a lo cual nosotros sugerimos que el virus del dengue, en
particular la proteina E participa de manera directa en el desarrollo de la hemorragia.
Nuestros resultados indican que Ja proteina E se une al plasmindgeno/plasmina en el
sitio que corresponde a! LBS | del zimdgeno. Este dominio se ha involucrado en procesos de
interaccioén especifica del PLG con sus activadores e inhibidores, asimismo interactua con la
superficie de la fibrina y con las superficies celulares, afectando funciones regulatonas que
son mediadas por los LBS asociadas a los dominios kringle del PLG (Pennica, 1983; Claeys,
1976). Es conocido que la unién de los activadores del PLG a los LBS de la molécula del
zimégeno induce cambios conformacionales que favorecen la activacion del PLG a plasmina
(Plow, 1995). La unién de la proteina E con el PLG pueda inducir un cambio conformaciona!
en la molécula del zimégeno que le confiere actividad enzimatica, como resultado de la
49
VOALOIIdIgd VI AG
YIVS ON SISAL VISA
formacién del complejo E-PLG, por medio de un mecanismo similar al propuesto para la
estreptocinasa que no presenta actividad catalitica (Wang, 1998).
La exacerbacion de la activacién del PLG ocasionada por los aislados procedentes de
FHD, puede ser resultado de diferencias en la interaccién de la proteina E con el LBS | del
PLG/plasmina, como lo muestran nuestros resultados de activacién del zimdégeno en presencia
de «-2-antiplasmina y el péptido E. De esta manera, los aislados procedentes de FHD podrian
alterar el proceso de fibrinolisis mediante dos mecanismos: en primer lugar, activando el PLG
mediante la interaccién especifica de la proteina de envoltura con el LBS 1 del PLG con
mayor eficacia que las cepas de Dengue Clasico y segundo, interfiriendo con la union de la
plasmina-c-2-antiplasmina, como lo muestran nuestros ensayos de competencia en presencia
del péptido E, donde es claro que la secuencia proveniente de la proteina de envoltura del
aislado de FHD compite con la a-2-antiplasmina. Lo anterior podria apoyarse en lo
demostrado por Christensen (1978), quien reporté que las moléculas de plasmina unidas a un
sustrato sintético (4cido 6-aminohexanoico) mediante los LBS no reaccionan o lo hacen muy
lentamente con la «-2-antiplasmina (Christensen, 1978; Wiman, 1978).
Por otro lado, se ha reportado que las proteinas que unen PLG, por ejemplo a-enolasa y
annexina II, interactuan con el zimégeno através de lisinas presentes en su extremo carboxilo
terminal (Miles, 1991). La proteina E del virus del dengue en la region comprendida del aa
359-390 contiene varias lisinas; aunque estas no se encuentren en el extremo carboxilo
terminal {ya que este es el segmento transmembranal y no se encuentra expuesto a la
superficie), es probable que puedan estar superficiales y puedan intervinir en la unidn del
virus con e] PLG.
La regidén 359-390 del virus del dengue que presentd 20% de similitud con el sitio de
union de la a-2-antiplasmina al LBS 1 del plasmindgeno, se localiza en el dominio III de la
proteina E (Heinz, 1991). Este dominio esta compuesto por los residuos 303-395 y contiene
un dominio de inmunoglobulina (IgC), el cual en su superficie lateral contiene residuos
implicados en el grado de virulencia y tropismo en diferentes Flavivirus (Sanchez, 1996).
Rey y col (1995) propusieron que este dominio pudiera estar involucrado en el
reconocimiento al receptor, lo que nos sugiere que la union E-PLG pudiera estar dada por una
superficie de la proteina de envoltura, que se encuentra hacia el exterior del virus y expuesta
al hospedero. Es probable que por esta misma razon nosotros observamos un efecto aditivo en
la activacién del PLG por el virus estando presente el péptido E. Aunque sdlo encontramos
una region de similitud con la a -2-antiplasmina, no descartamos la posibilidad de que
50
pudieran existir otras regiones conformacionales de la proteina E que puedan interactuar con
el plasmindgeno.
La region de unién del PLG con la proteina E como lo demostramos, comprende el sitio
del LBS 1, que esta formado por los kringles 1, 2 y 3. Estos dominios ademas de ser
importantes en el anclaje del PLG con el fibrinégeno/fibrina, estan presentes en otras
proteinas plasmaticas (tPA y protrombina) involucradas tanto en fibrinolisis como en
coagulacién (Claeys, 1976), por lo que seria importante en un futuro investigar la probable
interaccién de estas moléculas con el virus del dengue y determinar sus posibles funciones
fisiolégicas en el hospedero,
Cabe mencionar que las proteinas utilizadas para llevar a cabo los ensayos:
plasmindgeno, a-2-antiplasmina, estreptocinasa, fibrinédgeno y trombina, fueron de origen
humano, lo cual es importante debido a la especificidad de especie de estos procesos; por
ejemplo, la SK aislada de humanos, puede unirse y activar el PLG humano, pero falta al
activar el de otras especies como caballo o cerdo (Marcum, 1983).
El mecanismo de fibrinolisis es un sistema bastante complejo en el que participan
proteinas plasmaticas activadoras e inhibidoras del PLG (Collen, 1980), las cuales son
reguladas por otras proteinas, que interaccionan con otros procesos importantes tales como el
de la proteina C y S, las cuales se encuentran disminuidas en pacientes que cursan con dengue
(Van Gorp, 1999). Asimismo, un mecanismo por medio del cual las plaquetas pueden
participar en la fibrinolisis, es mediante la unién de la plaqueta con el PLG. Se ha calculado
que las plaquetas tienen 40,000 receptores para PLG en su superficie (Miles, 1988) y la
regulacion de estos receptores juega un papel crucial en controlar el balance de eventos
proteoliticos en las mismas, por fo que si el virus del dengue puede unirse y activar el PLG es
probable que pueda alterar la estabilidad plaquetaria durante la infeccion, por lo que resultaria
interesante explorar esta posibilidad, ya que la plaquetopenia por plaquetolisis es un signo
patognomonico en la FHD (incluso es uno de los criterios de la OMS para establecer el
diagnostico de dengue hemorragico).
Nuestros resultados proponen el primer modelo in vitro para tratar de explicar la
participacion de factores virales en el! desarrollo de la hemorragia y su interaccién con
proteinas plasmaticas del hospedero. Como se menciono anteriormente, el proceso de
fibrinolisis y el sistema del plasmindgeno/plasmina son complejos y se encuentran asociados
con otros procesos importantes que se han reportado alterados durante la FHD, los cuales aun
permanecen sin explorar.
51
Nuestro grupo actualmente continua trabajando en esta linea de investigacién para
comprobar la participacién del virus del dengue en la FHD, la cual no excluye el status
inmunoldgico del hospedero, asi como para intentar elucidar las diferencias moleculares en la
interaccién de los aislados procedentes de Dengue Clasico v.s. FHD y su implicacion en el
fendmeno hemorragico.
S2
CONCLUSIONES
Con base en nuestros hallazgos proponemos que:
1)
2)
3)
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)
El virus independientemente de su serotipo y origen (clasico y/o hemorragico) es
capaz de activar la molécula de plasmindgeno.
El mecanismo de activacién del plasmindgeno por el virus, no depende de la
presencia de fibrina y/o fibrinégeno.
La proteina de envoltura viral presenta la capacidad para activar la molécula del
plasminégeno.
El plasminégeno se une a la proteina de envoltura viral mediante el LBS 1.
En la formacion del complejo, proteina E-PLG se encuentra involucrada la region
359-390 de ta proteina de envoltura.
Los virus procedentes de Fiebre Hemorragica por Dengue, tienen la capacidad de
competir con la a-2-antiplasmina y exacerbar asi el proceso de fibrinolisis.
E] péptido E proveniente de una cepa de FHD es capaz de competir con la a-2-
antiplasmina por el sitio de union con el plasmindgeno.
Con base en la interpretacién de nuestros datos, proponemos lo siguiente:
Una de las manifestaciones hemorragicas graves (FHD), presentadas en el curso
de una infeccion primaria en la enfermedad, pudiese explicarse en base a la capacidad
del virus para activar el plasminégeno y competir con la a-2-antiplasmina (y no a la
existencia previa de anticuerpos heterotipicos no neutralizantes, generados durante una
infeccién secundaria), exacerbando la fibrinolisis, rompiendo la homeostasis del
hospedero, como fenomeno previo al establecimiento del proceso hemorragico.
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6)
1d
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