DETERMINAZIONE DEI PARAMETRI CINETICIDEGLI ENZIMI - Vmax E Km

DETERMINAZIONE DEI PARAMETRI CINETICIDEGLI ENZIMI - Vmax E Km

Saggio enzimatico in saturazione di S: V0 = K2 [ET]

permette di ottenere le U di attività catalitica relative ad un enzima in un campione biologico: U.E. dipendenti direttamente dalla concentrazione di E totale presente;

Determinazione dei parametri cinetici di un enzima: Vmax e Km: fondamentale in biochimica applicata – Km: indice di affinità dell’enzima per il suo substrato; Vmax: massima velocità alla [Et] data;studio di inibitori e regolatori enzimatici; identificazione di isoenzimi;consente di «seguire» le tappe di purificazione di un enzima.

Determinazione dei parametri cinetici di un enzima: Vmax e Km: fondamentale in biochimica applicata – Km: indice di affinità dell’enzima per il suo substrato; Vmax: massima velocità alla [Et] data;studio di inibitori e regolatori enzimatici; identificazione di isoenzimi;consente di «seguire» le tappe di purificazione di un enzima.

Le applicazioni dello studio degli enzimi, oltre ad essere basilari nella ricercafondamentale biochimica, hanno importanti ricadute in diagnostica clinica e in farmacologia.

Le applicazioni dello studio degli enzimi, oltre ad essere basilari nella ricercafondamentale biochimica, hanno importanti ricadute in diagnostica clinica e in farmacologia.

ENZIMIGli enzimi sono i biocatalizzatori delle reazioni chimiche all’interno delle cellule. Sono lo «strumento» principe attraverso il quale si realizzano:metabolismo energetico, biotrasformazioni o processi fondamentali della vita cellulare quali duplicazione del DNA, trascrizione dell’RNA e sintesi proteica. Sono macromolecole biologiche, proteine. Eccezione: i ribozimi, particolari RNA con attività catalitica nelle cellule. Ipotesi interessante: RNA, prime molecole con funzione di catalizzatori biologici, sostituite dalle proteine, strutturalmente più adatte ad esplicare questa funzione:

RNA PROTEINE

Enzimi proteici: proteine a singola catena polipeptidica;

proteine con struttura quaternaria; isoenzimi (ex. LDH) con diversa localizzazione nei tessuti

o a livello sub-cellulare

Parte proteica apoenzima + parte non proteica oloenzima

Parte non proteica: Gruppi prostetici: ex: eme nel Citocromo P450; Coenzimi, Cofattori inorganici: metalli, (Zn, Mg, Cu, Fe..) in metalloenzimi

PROPRIETA’ DEGLI ENZIMI PROPRIETA’ DEGLI ENZIMI

VELOCITÀ DELLE REAZIONI: enzimi aumentano la velocità di reazione fino a 108-1012 volte la velocità in assenza del catalizzatore. Reagente/i = substrato/i.

SPECIFICITA’: Specificità degli enzimi è un criterio di classificazione:enzimi a specificità verso il substrato assoluta (una molecola unica); di tipo stereochimico (riconoscimento degli stereoisomeri); di gruppo (gruppo chimico; ex. metiltransferasi); di legame (un legame chimico, ex. proteasi, legame peptidico).

REGOLAZIONE: gli enzimi sono soggetti a regolazione per adattare l’attivitàcatalitica alle necessità fisiologiche e ai cambiamenti che si attuano nelle cellule.inibizione a feed-back, inibizione da substrato o prodotto, fosforilazione reversibile,induzione e regolazione dell’espressione genica. Siti di regolazione - modulazione allosterica: siti di legame con molecole che modulano l’attività enzimatica. Struttura quaternaria e reg. allosterica.

DOMINI E PORZIONI DELLE PROTEINE CON FUNZIONE DI ENZIMA:Sito attivo o catalitico: “tasca” catalitica, dominio dell’enzima che riconosce il substrato e si lega reversibilmente con questo, formando ES. Nel sito catalitico si trovano alcuni residui di AA che sono coinvolti nel meccanismo di catalisi grazie alla natura chimica dei loro gruppi –R. Complementarietà e/o adattamento sterico tra E e S. La conformazione 3D del sito attivo – struttura 3D di tutta la molecola.

MECCANISMO DI INTERAZIONE ENZIMA-SUBSTRATO

CONSIDERAZIONI ENERGETICHE E CINETICHE

Termodinamica chimica: E libera G di reazione, G(P) –G(R) = G

G < 0, reazione esoergonica, spontanea da sinistra vs. destra; G > 0, reazione endoergonica,spontanea da destra vs. sinistra; G = 0, all’equilibrio nei due sensi.

G0’: variazione di E libera standard, 1 M, a pH 7, Kcal mole-1

G = H – TS

G = - RT ln Keq + RT ln ([C] [D]/[A] [B])

G0’ = - RT ln Keq , a pH 7

A + B C + D

E di attivazione: soglia energetica di una reazione chimica; Coordinate di reazione: percorsi e distanza delle specie chimiche in gioco ;

La spontaneità di una reazione chimica o della direzione di un equilibrio chimicodai reagenti ai prodotti e viceversa non ci dice però niente sulla cinetica e la velocità della reazione stessa.

Equazione di Arrhenius : k = A e-Ea/RT A= fattore di frequenza, geometriadelle molecole;

K = cost. di velocità della reazioneo vel. specifica di reazione R= costante universale dei gas

T= temperatura in Kelvin

reazioni reversibili

Teoria dello stato di transizione

Tanto minore è E att., tanto più la reazione raggiunge facilmente lo stato di transizione e può procedere più velocemente nel verso termodinamicamente favorito.

Quindi: una reazione può procedere o avvenire + veloc. non per il G tra R e P ma peril valore di Eatt. Anche nella cellula valgono tali principi - le reazioni intracellulari – isobare e isoterme – anche se hanno un G neg. procederebbero comunque troppo lentamente; le reaz reversibili non potrebbero andare in una direzione o in un’altraprontamente per rispondere alle esigenze cellulari: gli enzimi svolgono questa funzione.

E(att.) di una reazionechimica con e senza l’enzima

Un enzima:-accelera la reazione;-non è né un R né un P;-non viene consumato durante la reaz.;-non sposta l’equilibrio di reaz.;-non modifica il G complessivo R vs. P-è presente in quantità minime, non stechiometriche.

CINETICA ENZIMATICACINETICA ENZIMATICA

Le reazioni del metabolismo energetico possono essere spontanee o meno e, se sono reversibili, avvengono in un verso o l’altro in base alle concentrazioni dei reagenti o dei prodotti. Gli enzimi abbassano l’Eatt. delle reazioni senza modificare la direzione della reazione, la necessità o meno di consumo energetico e gli equilibri.

S P Vf = k1 [R], senza enzima k1

K-1

E + S E + S

k1

K-1

ESES E + PE + PK2 =Kcat.

K-2

Cinetica in stato stazionario: si vedecome varia la vel. enzimatica a varie [S];approccio semplificato per studiare la cinetica delle reazioni catalizzate da E; assunzioni teoriche:- [E] << [S]- velocità iniziale, V0:

- Stato stazionario:[ES] = k K1[E] [S] = k-1 [ES]

Cinetica in stato stazionario: si vedecome varia la vel. enzimatica a varie [S];approccio semplificato per studiare la cinetica delle reazioni catalizzate da E; assunzioni teoriche:- [E] << [S]- velocità iniziale, V0:

- Stato stazionario:[ES] = k K1[E] [S] = k-1 [ES]

Alle condiz. fissate di:temperatura, pH, forza ionica,alla v0, la pendenza della tangentealla curva [S] dt dip. da [ET ].

Alle condiz. fissate di:temperatura, pH, forza ionica,alla v0, la pendenza della tangentealla curva [S] dt dip. da [ET ].

Eq. Henri-Brown

v0

Dalla cinetica chimica: Dalla cinetica chimica:

Iperbole di Michaelis & MentenIperbole di Michaelis & Menten

V0 = k2 [ET] [S] Km + [S]

1) Per [S] << Km

la V0 dipende da [S] e [Et]:V0 = (Vmax/ [S])/Km

Reazione che segue una cinetica del 1° ordine;

- 2) Per [S] = Km , V0 = Vmax/2

- 3) Per [S] >> Km, V0 = Vmax, reazione di ordine cinetico = 0 La V0 dipende solo da [ET]

V0 = K2 [ET]

Km = K-1 + K2/ K+1 Km = K-1 + K2/ K+1

V0 = k2[ET] [S]

V0= K

a)

b)

Situazioni limite: a) [S] molto basse, Lim [S] 0

b) [S] verso la saturazione

Km

V0 = k2[ET]/2

Reazione che dipende da [S] = Km dell’ E in gioco e da [ET]

La V0 dipende da: [E], [S] e Km La V0 dipende da: [E], [S] e Km

Vmax= K2[Et]Vmax= K2[Et]

CINETICA DEL 1° ORDINE

- dS/dt = K [S], retta,

[S] scompare nel temposecondo una curva esponenziale:integrando - dS/dt= k [S]:

Quando S << Km

CINETICA DI ORDINE 0

[A]

tempo

dS/dt= K [S] scompare nel tempo secondo una retta con pendenza –kintegrando - dS/dt= k

Situazione limite a) 1° tratto della M & M

Situazione limite b) in saturazione

Esempi generici

[A] = A0e-kt

[A]=A0 -kt

∫ A0

[A]- d[A]/[A] = ∫ kdt

t

0

∫ A0

[A]- d[A] = ∫ kdt

t

0

Linearizzazione iperbole di Michaelis- Menten

L’iperbole si può linearizzare, rendendo l’analisi dell’attività E più immediatae di più facile gestione

Altre linearizzazioni: Hanes-Woolf; Eadie-Hofstee

pendenza

Vmax e Km ADENOSINA DEAMINASI

+ H2O

Come si realizza in vitro il saggio dideterminazione dei parametri cinetici di questa

trasformazione

+ NH3

Adenosina Inosina

idrolasi

Esistono diverse metodiche per determinare la velocità enzimatica di questadeaminasi – saggio spettrofotometrico: Abs 260/265 nm.

A 260nm si misura l’Abs dell’adenosina; la velocità V0 dell’adenosina deaminasi, ovvero l’ estinzione a tempo iniziale dell’adenosina per effetto della trasformazione

enzimatica in inosina, si misura invece a 265nm. Questo viene fatto per eliminare l’interferenza del prodotto,

l’inosina, che assorbe a 260 ma non a 265 nm.

ESPERIMENTO: Vmax e Km dell’enzima Adenosina Deaminasi con metodo spettrofotometrico UV

Si determina la V0 a varie concentrazioni di Substrato (adenosina), scelte al di sotto e al di sopra della Km attesa (~40 M): le concentrazioni di adenosina sono comprese tra 5 e 80 M.

Reazione: Adenosina Inosina

a) Verifica concentrazione delle soluzioni preparate di adenosina:Spettrofotometro: si legge a 260 nm (UV) per verificare [Adenosina] mediante la, coeff. di estinzione molare dell’adenosina = 0.015. A260nm/0.015= conc M

S1: 5 M

S2: 10 MS3: 20 M

Soluzione stock di partenza

Adenosina 300 MS4: 40 M

S5: 60 M

S6: 80 M

diluizioni

+ Adenosina Deaminasi

b) Calcolo della V0 dell’adenosina deaminasi: Si sposta la di lettura da 260 a 265 nm e si aggiunge l’enzima Adenosina Deaminasi (opportunamente diluito) alle soluzioni di adenosina preparate :

In sostanza: per ogni soluzione di adenosina, si calcola la V0: -dS/dt, A/min, in 2 min d’intervallo di tempo: lo strumento misura l’Abs a 265nm ogni 10 sec in 2 min. A nel tratto lineare: A(iniziale) – A(finale) sulla retta tangente alla curva di estinzionedi A in funzione di t: si rapporta al min (A/min). Diluendo opportunamente l’E, il tratto sarà lineare nei 2 min.

In sostanza: per ogni soluzione di adenosina, si calcola la V0: -dS/dt, A/min, in 2 min d’intervallo di tempo: lo strumento misura l’Abs a 265nm ogni 10 sec in 2 min. A nel tratto lineare: A(iniziale) – A(finale) sulla retta tangente alla curva di estinzionedi A in funzione di t: si rapporta al min (A/min). Diluendo opportunamente l’E, il tratto sarà lineare nei 2 min.