CENNI STORICI

1898-1903 D. Trebot Day, geologo americano, separò alcuni idrocarburi utilizzandocolonne di farina fossilecolonne di farina fossile.

1903-1906 M. Tswett, botanico russo, separò una serie di pigmenti colorati presenti in un estratto di foglie verdi utilizzando CaCO3 ed etere di petrolio; coniò anche il nome cromatografia che significa "scrittura mediante il colore"il nome cromatografia che significa scrittura mediante il colore .

1930-1931 R. Kuhn e E. Lederer utilizzarono la cromatografia per la separazione dicarotenoidi e xantofille.

1938 N A Izmailov e M S Shaiber descrissero per la prima volta la cromatografia1938 N.A. Izmailov e M.S.Shaiber descrissero per la prima volta la cromatografia su strato sottile

1941 A.J.P. Martin e R.L.M. Synge presentarono il primo lavoro sullacromatografia di ripartizione. Essi introdussero la teoria dei piatti basata su dic o atog a a d pa t o e ss t odusse o a teo a de p att basata su dun'analogia con la teoria della distillazione e dell'estrazione controcorrente.

1952 A.J.P. Martin e R.L.M. Synge ebbero il premio Nobel per la chimica per losviluppo della cromatografia di ripartizione gas-liquido.pp g p g q

1956 J.J.van Deemter sviluppò la teoria della separazione cromatografica.1958 E.Stahl mise a punto la tecnica della cromatografia su strato sottile.1966 Inizia lo sviluppo della moderna tecnica della cromatografia in fase liquida ad

alta prestazione.

Definizione Cromatografiadefinizione IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)pp y)"Metodo usato primariamente per la separazione dei componenti di una miscela; i componenti vengono distribuiti tra due fasi una d ll li è fi t l' lt è bil L f t i i òdelle quali è fissa mentre l'altra è mobile. La fase stazionaria può essere un solido, o un liquido supportato su di un solido, o un gel. La fase stazionaria può essere impaccata in una colonna sparsaLa fase stazionaria può essere impaccata in una colonna, sparsa come uno strato, o distribuita come un film. La definizione "letto cromatografico" è usata come termine generale per denotare una g gqualsiasi delle varie forme in cui può essere usata la fase stazionaria.”Q i di l t fi è t i di i b t llQuindi la cromatografia è una tecnica di separazione basata sulla migrazione differenziata delle sostanze da separare attraversodue fasi tra loro immiscibilidue fasi tra loro immiscibili

CS = conc. fase stazionaria

CM = conc. fase mobile

Gas Chromatography

AE

G

BC

DGas

Chromatograph

Sample: mixture ofvolatile liquids (~1L)

Gas Chromatogram

A

B

CE

ance

A C

Abu

nd

D

0 5 10 15 20

Time (minutes)

Gas Chromatograph

Injection Port

Capillary Column

Detector

Data Systemor Recorder

Carrier GasSupply

Oven

Basic Principles of Gas ChromatographyBasic Principles of Gas Chromatography

Instrumentation Injection Port Sample introduction Injection Port - Sample introduction

Manual - Direct Injection

Instrumentation - Oven

Temperature Control

Instrumentation Oven

Temperature Control

• Isothermal • Gradient• Isothermal • Gradient

160

200

240

C)

80

120

160

Tem

p (d

eg

0

40

0 10 20 30 40 50 60

Time (min)

ColumnsColumns

• Packed

• Capillary

Polarity

Non-polar +-Polar

PhasesPhases

Instrumentation - DetectorsDestructive

• Flame Ionization (FID)

El t l ti C d ti it (H ll/ELCD)• Electrolytic Conductivity (Hall/ELCD)

• Mass Spectral (CI/EI)• Mass Spectral (CI/EI)

• Nitrogen-Phosphorus (NPD)Nitrogen Phosphorus (NPD)

Instrumentation - Detectors

Non-DestructiveNon Destructive

• Thermal Conductivity (TCD)Thermal Conductivity (TCD)

• Electron Capture (ECD)p ( )

• Photo Ionization (PID)( )

DETECTORSDETECTORS

Flame Ionization Detector (Nanogram - ng)Flame Ionization Detector (Nanogram - ng)

High temperature of hydrogen flame (H2 +O2 + N ) ionizes compounds eluted from column intoN2) ionizes compounds eluted from column into flame. The ions collected on collector or electrode and were recorded on recorder due toelectrode and were recorded on recorder due to electric current.

Schematic Diagram of Flame Ionization DetectorSchematic Diagram of Flame Ionization Detectorgg

Exhaust

Chimney

IgniterPolarizing Electrode

Collector Electrode

Hydrogen Inlet

Column Effluent

Schematic Diagram of Flame Ionization Detector

Collector Detector electronics

- 220 volts

FlameChassis ground

Jet

Column Signal output

Thermal Conductivity DetectorThermal Conductivity Detector

Measures the changes of thermal conductivityMeasures the changes of thermal conductivity due to the sample (g). Sample can be

drecovered.

Thermal Conductivity Basicsy

When the carrier gas is contaminated by sample , the cooling effect of the gas changes The difference in cooling

The TCD is a nondestructive, concentration sensing detector. A heated filament is cooled by the flow of gas changes. The difference in cooling

is used to generate the detector signal.heated filament is cooled by the flow of carrier gas .

Flow

Flow

F F

Thermal Conductivity DetectorThermal Conductivity Detector

Thermal Conductivity DetectorThermal Conductivity Detector

Th l C d ti it D t tTh l C d ti it D t tThermal Conductivity DetectorThermal Conductivity Detector

• Responds to all compounds

• Adequate sensitivity for many compounds

• Good linear range of signal

• Simple construction• Simple construction

• Signal quite stable provided carrier gas glow rate, block temperature, and filament power are controlled

• Nondestructive detectionNondestructive detection

Mass Spect omete

Sample Data

Mass Spectrometer

Inlet Data

SampleIntroduction

DataOutput

Inlet DataSystem

Ion Mass IonSource Analyzer Detector

VacuumPumpsPumps

Electron Impact

Ionization Source

~70 Volts

Ionization Source

Electron Collector (Trap)

+Repeller InletNeutral

PositiveIons

+

_

++ ++++

_Repeller

toAnalyzer

Molecules

_e- e-e-

ExtractionFilament

Electrons

ExtractionPlate

Filament

Magnetic Sector Mass Analyzerg y

ion trajectory in register

ion trajectory not in register

(too light)

S

ion trajectory not in register

IonSource

Detector

N

Electromagnet (too heavy)Electromagnet

Quadrupole Ion FilterQuadrupole Ion Filter

resonant ion

non-resonant ion

Detector+

_

_+

IonSource

DC and ACVoltages

Mass Spectrometry

NC

C

O

N

C H

C 3H

C3H

MassC

NH

CO N

C H MassSpectrometer

Typical sample: isolated

194Mass Spectrum

compound (~1 nanogram)

67 109

5582

42

16513694

40 60 80 100 120 140 160 180 200Mass (amu)

Tempo di ritenzione (tR): è il tempo che intercorre fra l’iniezione del campione e la rivelazione di un analita eluente dalla colonna

Tempo morto (tM): è il tempo che un analita non ritenuto sulla fase stazionaria (cheTempo morto (tM): è il tempo che un analita non ritenuto sulla fase stazionaria (che quindi viaggia alla stessa velocità della fase mobile) impiega per giungere al rivelatore

Analisi qualitativaFissate le condizioni della separazione cromatografica (tipo di colonna, flusso della fase mobile, p g ( pnatura della fase stazionaria) una particolare sostanza potrà essere riconosciuta dal suo tempo di ritenzione. (Confrontandolo con quello nelle banche dati).

Analisi quantitativaL’area sottesa al picco cromatografico è proporzionale alla quantità di analita (e quindi alla sua p g p p q ( qconcentrazione). Si calcola in modo approssimativo moltiplicando l’altezza del picco per la base a metà altezza.

Risoluzione di una separazioneRisoluzione di una separazione cromatografica (Rs)

La risoluzione dà una misura quantitativa dell’efficienza di una colonna cromatografica nellacolonna cromatografica nella separazione di due analiti:

Una separazione cromatografica deve tendere al massimo valore possibile di Rs (e che sia almeno pari ad 1.5 per qualunque coppia di picchi adiacenti)qualunque coppia di picchi adiacenti)

Composizione dell’olio di olivaComposizione dell olio di olivaD l t di i t hi i l’ li di li è ddi i ibil i d f i iDal punto di vista chimico, l’olio di oliva è suddivisibile in due frazioni, a

seconda del comportamento a caldo in presenza di una base forte (NaOHo KOH):

S ifi bilS ifi bil f tf t dd tt ii dd didi ff ii llll Saponificabile,Saponificabile, formataformata dada sostanzesostanze inin gradogrado didi formareformare saponisaponi nellenellecondizionicondizioni citatecitate;; questaquesta frazionefrazione corrispondecorrisponde alal 9898--9999%% deldel totaletotale eecomprendecomprende trigliceridi,trigliceridi, diglicerididigliceridi ee monogliceridi,monogliceridi, ii cuicui acidiacidi sonosono perperl’l’8585%% insaturiinsaturi (acido(acido oleicooleico ee linoleico)linoleico) ee perper ilil 1515%% saturisaturi (acido(acidoll 8585%% insaturiinsaturi (acido(acido oleicooleico ee linoleico)linoleico) ee perper ilil 1515%% saturisaturi (acido(acidopalmitico,palmitico, stearico)stearico)

Insaponificabile,Insaponificabile, formataformata dada microcomponentimicrocomponenti cheche nonnon formanoformano saponisaponin lln ll c ndizi nic ndizi ni cit tcit t ;; nchnch ss èè pr s ntpr s nt inin qu ntitàqu ntità m d stm d st ((11 22%%nellenelle condizionicondizioni citatecitate;; ancheanche sese èè presentepresente inin quantitàquantità modestemodeste ((11--22%%circa)circa) questaquesta frazionefrazione èè importantissimaimportantissima dada unun puntopunto didi vistavistanutrizionalenutrizionale ee analitico,analitico, perper controllarecontrollare lala genuinitàgenuinità dell'oliodell'olio ee perper lala suasuaserbevolezzaserbevolezzaserbevolezzaserbevolezza

Frazione insaponificabileFrazione insaponificabile

II componenticomponenti principaliprincipali sonosono:: IdrocarburiIdrocarburi ((3030 -- 4040%%)) tratra cuicui lolo squalenesqualene

àà Cere,Cere, presentipresenti inin minimaminima quantitàquantità Steroli,Steroli, presentipresenti inin notevolinotevoli quantitàquantità AlcoliAlcoli inin piccolissimepiccolissime quantitàquantità alcolialcoli alifaticialifatici ee inin quantitàquantità Alcoli,Alcoli, inin piccolissimepiccolissime quantitàquantità alcolialcoli alifaticialifatici ee inin quantitàquantitàmaggiorimaggiori alcolialcoli triterpenicitriterpenici

PigmentiPigmenti colorati,colorati, comecome carotenoidicarotenoidi ee clorofillaclorofilla VitamineVitamine liposolubili,liposolubili, provitaminaprovitamina A,A, vitaminavitamina C,C, D,D, EE eded FF Polifenoli,Polifenoli, sottosotto formaforma didi glucosidiglucosidi ee didi esteriesteriAltriAltri composticomposti piùpiù oo menomeno volatilivolatili:: alcolialcoli aldeidialdeidi esteriesteri chetonichetoni AltriAltri composticomposti piùpiù oo menomeno volatilivolatili:: alcoli,alcoli, aldeidi,aldeidi, esteri,esteri, chetonichetonialifaticialifatici ee aromaticiaromatici

La qualità dell’olio d’olivaLa qualità dell olio d olivaGli i i i li h i l li à d ll’ li di li• Gli aspetti principali che caratterizzano la qualità dell’olio di olivasono i caratteri organolettici, la stabilità all’ossidazione, l’assenzadi contaminanti (fitofarmaci, solventi) e, naturalmente, lecaratteristiche nutrizionali espresse in termini di acidi grassi saturi,monoinsaturi e polinsaturi, presenza di fitosteroli, vitamine edantiossidanti naturali

• Come per ogni prodotto di trasformazione agroalimentare, il pregiodell’olio consiste, quindi, nel mantenimento e nell’esaltazione dellecaratteristiche proprie della materia prima di origine ossia dellecaratteristiche proprie della materia prima di origine, ossia delleolive. È impossibile produrre un olio buono partendo da unamateria prima scadente, nemmeno utilizzando i più sofisticati

di ti di t iprocedimenti di estrazione

Analisi sull’olio d’olivaAnalisi sull olio d olivaLe analisi che vengono effettuate sui campioni di olio si dividono in tre categorie:

analisianalisi cheche accertanoaccertano lala qualitàqualità dell'oliodell'olio:: sonosono ii saggisaggi didi acidità,acidità, deidei perossidi,perossidi, l'analisil'analisi UV,UV, lalacomposizionecomposizione acidica,acidica, lala composizionecomposizione sterolica,sterolica, ilil contenutocontenuto didi solventisolventi alogenatialogenati ee l’analisil’analisigascromatograficagascromatografica;;

analisianalisi cheche accertanoaccertano lalaconservabilitàconservabilità dell'oliodell'olio:: numeronumero didiperossidi,perossidi, analisianalisi UV,UV, acidità,acidità, panelpaneltest,test, tempotempo didi induzioneinduzione;;

analisianalisi cheche accertanoaccertano lala genuinitàgenuinità analisianalisi cheche accertanoaccertano lala genuinitàgenuinitàdell'oliodell'olio:: composizionecomposizione acidica,acidica,sterolica,sterolica, analisianalisi UV,UV, analisianalisi deideisolventisolventi alogenati,alogenati, differenzadifferenza ECNECN4242 HPLCHPLC ee ECNECN 4242 calcolocalcolo teoricoteorico4242 HPLCHPLC ee ECNECN 4242 calcolocalcolo teoricoteorico

II parametriparametri analiticianalitici determinatideterminatisull’oliosull’olio ee lele tecnichetecniche utilizzateutilizzate sonosonodescrittidescritti nelnel regolamentoregolamento CEECEE nn..25682568//9191 ee successivesuccessive modifichemodifiche25682568//9191 ee successivesuccessive modifichemodifiche

Parametri analitici importantiParametri analitici importantiI i i li i d i i ll’ li i iI principali parametri determinati sull’olio sono i seguenti:

AciditàAcidità liberalibera –– lala quantitàquantità didi acidiacidi grassigrassi liberiliberi (non(non esterificati)esterificati)Num rNum r didi p r ssidip r ssidi ll p t nzi litàp t nzi lità ssid tivssid tiv didi unun lili NumeroNumero didi perossidiperossidi –– lala potenzialitàpotenzialità ossidativaossidativa didi unun olioolio

PolifenoliPolifenoli –– lala quantitàquantità totaletotale didi composticomposti polifenolicipolifenolici TocoferoliTocoferoli –– lala quantitàquantità didi composticomposti aventiaventi strutturastruttura analogaanaloga allaallaTocoferoliTocoferoli lala quantitàquantità didi composticomposti aventiaventi strutturastruttura analogaanaloga allaallavitaminavitamina EE

AcidiAcidi grassigrassi deidei gliceridigliceridi –– indiceindice didi genuinitàgenuinità ee tipicitàtipicitàlili ilil fi i i ifi i i i SteroliSteroli –– utileutile perper accertareaccertare sofisticazionisofisticazioni

ParametriParametri UVUV –– perper identificareidentificare adulterazioniadulterazioni concon altrialtri olioli

Acidità liberaAcidità liberaQuesta analisi esprime la percentuale di acidi grassi liberi presente nel prodotto.

Gli acidi liberi si riscontrano soltanto dopo l'estrazione dell'olio dal frutto, poiché all'interno delffrutto sono neutri. Essi derivano come prodotto di alcune reazioni innescate da enzimi lipolitici,durante la maturazione del frutto o a causa di una cattiva conservazione del frutto. Proprio perquesto motivo l'analisi dell'acidità viene considerata come parametro per stabilire la qualità diun olio di oliva

DalDal puntopunto didi vistavista analiticoanalitico sisi trattatratta didi unauna titolazionetitolazioneacidoacido--basebase effettuataeffettuata inin soluzionesoluzione organicoorganico conconidrossidoidrossido didi potassiopotassio comecome titolantetitolante ee fenolftaleinafenolftaleinacomecome indicatoreindicatore ConvenzionalmenteConvenzionalmente l’aciditàl’acidità èècomecome indicatoreindicatore.. Convenzionalmente,Convenzionalmente, l aciditàl acidità èèespressaespressa comecome percentualepercentuale didi acidoacido oleicooleico ancheanche sese èèdovutadovuta aa numerosinumerosi composticompostiLaLa presenzapresenza elevataelevata didi questiquesti acidiacidi grassigrassi liberiliberi(superiori(superiori alal 33 44%%)) renderende unun olioolio nonnon commestibilecommestibile(superiori(superiori alal 33--44%%)) renderende unun olioolio nonnon commestibilecommestibilepoichépoiché avrebberoavrebbero un'azioneun'azione irritanteirritante sullasulla mucosamucosagastroentericagastroenterica oltreoltre cheche unauna sgradevolesgradevole sensazionesensazioneinin boccaboccaII sist misist mi didi t sp tt sp t didi st ist i d lld ll liliII sistemisistemi didi trasportotrasporto ee didi stoccaggiostoccaggio delledelle oliveolivepossonopossono alterarealterare ilil valorevalore didi acidità,acidità, sese risultanorisultanoessereessere promotoripromotori didi processiprocessi didi fermentazionefermentazione.. PerPerquestoquesto motivo,motivo, devonodevono essereessere minimiminimi ii tempitempi checheinterc rr ninterc rr n frafra lala racc ltaracc lta deidei fruttifrutti ee lala l rl rintercorronointercorrono frafra lala raccoltaraccolta deidei fruttifrutti ee lala lorolorolavorazionelavorazione

Acidi grassiL'importanzaL'importanza delladella determinazionedeterminazione

Acidi grassiL importanzaL importanza delladella determinazionedeterminazioneanaliticaanalitica deidei grassigrassi èè dovutadovuta alal fattofattocheche dada unauna solasola proceduraprocedura vienevienericavataricavata unauna notevolenotevole quantitàquantità didiricavataricavata unauna notevolenotevole quantitàquantità didiparametri,parametri, cheche sonosono peraltroperaltrospecifici,specifici, cioècioè corrispondonocorrispondono aasingolisingoli componenticomponenti chimicichimici presentipresentisingolisingoli componenticomponenti chimicichimici presentipresentiinin unun olioolio.. LaLa composizionecomposizione acidicaacidicapuòpuò rappresentarerappresentare quindiquindi unun indiceindicedidi genuinitàgenuinità ee tipicitàtipicità didi unun oliooliodd genu n tàgenu n tà ee t p c tàt p c tà dd unun ol ool oGliGli acidiacidi grassigrassi sonosono presentipresenti nell’olionell’olioinin formaforma libera,libera, menomeno desiderabile,desiderabile,oppureoppure inin formaforma esterificataesterificata concon lalaoppureoppure inin formaforma esterificataesterificata concon lalaglicerinaglicerina neinei gliceridi,gliceridi, lala materiamaterianobilenobile dell’oliodell’olio didi olivaoliva cheche nenecostituiscecostituisce circacirca ilil 9898%%

Acidi grassi nell’olioLaLa maggiormaggior parteparte deglidegli acidiacidi grassigrassi èè aa catenacatena linearelineare concon unun numeronumero pariparididi atomiatomi didi carboniocarbonio.. PossonoPossono essereessere presentipresenti doppidoppi legamilegami (acidi(acidi insaturiinsaturi));;

’è’è iùiù didi d id i ll (fi(fi 66)) ii ll didi li ili i ii hh

Acidi grassi nell oliosese c’èc’è piùpiù didi unun doppiodoppio legamelegame (fino(fino aa 66)) sisi parlaparla didi polienipolieni;; cici sonosono ancheanchetriplitripli legamilegamiOltreOltre allaalla catenacatena linearelineare piùpiù oo menomeno insatura,insatura, possonopossono esserciesserci gruppigruppif lf l hh ( )( ) dd (( )) (( ))funzionalifunzionali sostituentisostituenti comecome chetocheto (=CO),(=CO), idrossiidrossi ((--OH),OH), epossiepossi ((--OO--))presentipresenti naturalmentenaturalmente oo indottiindotti dada processiprocessi tecnologicitecnologiciAlcuniAlcuni acidiacidi grassigrassi sonosono specificispecifici didi determinatedeterminate piantepiante (erucico,(erucico,petroselinico)petroselinico) ee quindiquindi lala loroloro identificazioneidentificazione èè indiceindice didi adulterazioneadulterazione

AcidoAcido stearicostearico (C(C1818,, oo doppidoppi legami)legami)H3C(CH2)16COOH

AcidoAcido oleicooleico (C(C1818,, 11 doppiodoppio legame)legame)H3C(CH2)6 (CH2)6COOH

AcidoAcido linoleicolinoleico (C(C1818,, 22 doppidoppi legami)legami)

A idA id li l ili l i (C(C 33 d id i l i)l i)

H3C(CH2)3 (CH2)6COOH

AcidoAcido linolenicolinolenico (C(C1818,, 33 doppidoppi legami)legami)H3C (CH2)7COOH

Determinazione degli acidi grassiLaLa determinazionedeterminazione deglidegli acidiacidi grassigrassi esterificatiesterificati èè eseguitaeseguita mediantemediante GCGC..

Determinazione degli acidi grassigg gg gg

GliGli acidiacidi grassigrassi deidei gliceridigliceridi vengonovengono trasformati,trasformati, mediantemediantetransesterificazione,transesterificazione, neinei rispettivirispettivi esteriesteri metilici,metilici, cheche presentanopresentano unaunamaggioremaggiore volatilitàvolatilità eded unauna minoreminore polaritàpolarità rispettorispetto aiai corrispondenticorrispondenti acidiacidi

ààliberiliberi;; ii gliceridigliceridi hannohanno inveceinvece scarsascarsa volatilitàvolatilitàGliGli acidiacidi grassigrassi metilatimetilati vengonovengono iniettatiiniettati inin colonnacolonna ee separatiseparati comecome talitali..QuestaQuesta determinazionedeterminazione forniscefornisce quindiquindi lala composizionecomposizione acidicaacidica inin esteriesterimetilicimetilici anzichèanzichè inin acidiacidi liberiliberi;; inin pratica,pratica, lala differenzadifferenza tratra lele dueduecomposizionicomposizioni èè abbastanzaabbastanza piccolapiccola ee comunquecomunque tuttitutti ii valorivalori tabulatitabulati didiriferimentoriferimento sonosono basatibasati suisui metilati,metilati, quindiquindi nonnon sisi haha alcunaalcuna incertezzaincertezza didi

bbattribuzioneattribuzioneL'identificazioneL'identificazione deidei singolisingoli acidiacidi avvieneavviene mediantemediante cromatogrammicromatogrammieseguitieseguiti susu standardstandard

Acidi nell’olio di olivaLaLa

Acidi nell olio di oliva