Andrea Dardis, PhD Centro di Coordinamento Regionale per le Malattie Rare

University Hospital “Santa Maria della Misericordia” Udine, Italy

andrea.dardis@asuiud.sanita.fvg.it

Dall'analisi molecolare ai quadri clinici della Malattie Lisosomiali

Circa 60 disordini dovuti a un difetto a carico di specifici enzimi lisosomiali o di proteine lisosomiali non enzimatiche transmembrana che determinano un accumulo di metaboliti non degradati all’interno dei lisosomi.

LE/Lysosomes

ER

enzima

Proteine di trasporto

Accumulo di macromolecole Danno cellulare ????????????

Malattie da accumulo lisosomiale

L’accumulo si osserva in diversi tessuti e organi

Manifestazioni fenotipiche complesse caratterizzate da associazione di sintomi viscerali, oculari, ematologiche, scheletriche

e neurologiche.

Forme infantili ed adulti

Malattie da accumulo lisosomiale

Più di 60 disordini ereditari

Prevalenza globale 1:8000 nati vivi

Eredità autosomica recessiva, a eccezione delle malattie di Fabry, di Hunter e di Danon (X linked)

Vengono classificate in base al substrato accumulato

Malattie di accumulo lisosomiale

Mucopolisaccaridosi Sfingolipidosi Glicoproteinosi altro

MPS I (Hurler, Scheie) Fabry Fucosidosi Def Multiplo Sulfatasi

MPS II (Hunter) Farber a-mannosidosi Def. Lipasi acida

MPS III A (Sanfilippo A) Gangliosidosi GM1 b-mannosidosi Galattosialidosi

MPS III B (Sanfilippo B) Gangliosidosi GM2 (Tay Sachs)

Schindler Glicogenosi II

MPS III C (Sanfilippo C) Gangliosidosi GM2 (Sandhoff)

Sialidosi Dannon

MPS III D (Sanfilippo D) Gangliosidosi GM2 (def GM2A)

Mucolipidosi II

MPS IV A (Morquio A) Gaucher (def bglu) Mucolipidosi III

MPS IV B (Morquio B) Gaucher (def Sap C) Mucolipidosi IV

MPS VI (Maroteaux-Lamy)

Krabbe Ceroidolipofuscinosi I

MPS VII (Sly) Leucodistrofia metacr. (def ARSA)

Ceroidolipofuscinosi II

Leucodistrofia metacr (def. SapD)

Ceroidolipofuscinosi 3

Niemann Pick A e B Ceroidolipofuscinosi 5

Niemann Pick C Ceroidolipofuscinosi 6

Ceroidolipofuscinosi 8

Deficit enzimatico Deficit di proteine non enzimatiche

Malattie di accumulo lisosomiale

Sospetto clinico

Ricerca di metaboliti Mucopolisaccaridi urinari (MPS)

Oligosaccaridi urinari (GSDII)

Test specifici enzimatici e/o molecolari

Chitotriosidasi plasmatica (Gaucher, NPA/B-C) Biomarkers

Non informativa in tutti i casi (mutazioni)

CCL18 Oxysterols (NPC-A/B, Wolman)

Deficit enzimatico 75%

Deficit di proteine non enzimatiche 25%

Malattie di accumulo lisosomiale

Dosaggio enzimatico Diagnosi molecolare

Diagnosi enzimatica

Nella maggior parte dei casi affidabile e rapida

Limiti

Non adatta alla prognosi e individuazione di portatori

Non sufficiente

3) Dosaggi di enzimi la cui funzione dipende di attivatori

2) In donne con sospetta malattia lisosomiale legata al X (Fabry)

1) Dosaggi di enzimi per cui sono state descritte pseudodeficienze enzimatiche

Non sufficiente

1-dosaggi di enzimi per cui sono state descritte pseudodeficienze enzimatiche

Condizione presente nella popolazione generale determinata da polimorfismi

ATTIVITA ENZIMATICA MOLTO BASSA NON ASSOCIATA A MALATTIA

Arilsulfatasi A b-esosaminidasi a-iduronidasi a-glucosidasi a-galattosidasi a-fucosidasi b-glicuronidasi

Possibili errori nella diagnosi e consulenza genetica

Diagnosi enzimatica

In donne con sospetta malattia lisosomiale legata al X (Fabry)

Diagnosi enzimatica

Non sufficiente

XY Maschi emizigoti presentano un’attività della alfa galattosidasi A chiaramente patologica

XX Donne portatrici in eterozigosi, come conseguenza dell’inattivazione casuale del X, possono essere asintomatiche o sviluppare sintomi. L’attività enzimatica può risultare alterata o nella norma.

GM1

GM2

GM3

Ceramide

Globotriosylceramide

Glucosylceramide

Lactosylceramide

galactosylceramide Sfingomielina

HexA GM2 attivatore

Sialidasi a-Galactosidasi A

b-Galactosidase

Glucosilceramidasi

b-Galattosilceramidasi

Sulfatide

ARSA

SAP C

SAP B

SAP A

GM2 gangliosidosi

Leucodistrofia metacromatica

Krabbe Gaucher

•Difetto enzimatico

•Difetto di attivatore (rare) Attività enzimatica NORMALE

Non sufficiente Dosaggi di enzimi la cui funzione dipende di attivatori

Diagnosi enzimatica

Diagnosi molecolare

Unico strumento diagnostico nel 25% dei disordini

In casi di pseudodeficienze enzimatiche

In dosaggi di enzimi la cui funzione dipende

da attivatori

Donne con sospetta malattia lisosomiale

legata al X (Fabry)

Prognosi della malattia (attività enzimatica

non sempre correla con severità)

Determinazione dei portatori

Approfondimento della diagnosi

Certezza diagnostica

Consulenza genetica

Complementare la diagnosi enzimatica

Diagnosi molecolare

Assenza di mutazioni frequenti (mutazioni descritte: Fabry circa 600, Gaucher circa 300, NPC1 circa 400, ecc) la maggior parte “private”

Mutazioni puntiformi

Sequenziamento dell’intera zona codificante dei geni

Primo approccio

Geni da 5 a 30 esoni

Diagnosi molecolare

Ricerca di mutazioni puntiformi mediante sequenziamento

5’ 3’

1. PCR specifica degli esoni e zone introniche fiancheggianti 2. Sequenziamento automatico (Genetic Analyzer 3500XL, 24 capillari)

Diagnosi molecolare

c.1064T>C (p.L355P) c.2188 G>T (p.E730X)

Paziente con diagnosi enzimatica di glicogenosi 2. Autosomica recessiva - Gene GAA

Non riportata

Diagnosi molecolare

Le criticità

Mutazioni nuove : patogenetiche o polimorfismi (>1% nella popolazione normale)?

Ricerca nei database Studio di 100 alleli Saggi funzionali in vitro

Alleli complessi (2/+ mutazioni sullo stesso allele) Conferma nei genitori Clonaggio

Tutte le mutazioni devono essere confermate in una seconda PCR

Espressione in vitro delle muove mutazioni missenso e alleli complessi

Enzymatic activity Western blot

pcDNA3

GAA cDNA WT

pcDNA3

GAA cDNA mutant

site directed mutagenesis

0

20

40

60

80

100

120

WT c.399C>A c.670C>T c.1064T>C c.2104C>T c.2188G>T

% r

esidua

l GAA a

ctivity

76

110

95

70

WT ALDP

Expression of new missense mutations in COS-1 cells

c.1064T>C c.2104C>T GAA wt

Assenza di mutazioni in uno o entrambi gli alleli dopo sequenziamento della zona codificante

(circa 20% dei casi)

Mutazioni introniche profonde Delezioni parziali o totali di uno degli alleli

Delezioni parziali o totali di uno degli alleli

Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)

1 2 3 4 5

1 2 3 5

Mutazione intronica profonda

25 47 Kb 1

1-25 1-23

DNA

mRNA

24-25

RT-PCR

Sequenziamento

352nt 473 nt

121 nt del introne 23 rimangono ritenuti nel mRNA

Diagnosi molecolare

Campione DNA (cellule nucleate)

PCR di ogni esone

Sequenziamento automatico

mutazioni

Conferma nei genitori

Una o nessuna mutazione Mutazione intronica?? Delezione ???

Coltura di fibroblasti

Analisi del mRNA per mutazioni di slpicing

descritta

nuova

Patogenetica ???

MLPA

Diagnosi prenatale

E’ possibile quando c’è un paziente diagnosticato in famiglia

Malattie autosomiche recessive: I genitori, entrambi portatori, hanno una probabilità ¼di avere un figlio affetto

Mamma (portatrice) Papà (portatore)

sano malato portatore

Diagnosi prenatale

Malattie X linked: le donne portatrici hanno una probabilità ½ di trasmettere il gene mutato alla prole

50% dei maschi affetti 50% delle femmine portatrici

Diagnosi prenatale solo nei maschi

Campione: Villo coriale (10-12^sett.) o amniociti (16^sett)

Diagnosi biochimica: Analisi dell’ attività enzimatica

Diagnosi molecolare: Analisi delle mutazioni del gene presenti nella famiglia.

Solo utile in famiglie in cui le mutazioni sono state caratterizzate. Esclusione della contaminazione con DNA materno

Diagnosi prenatale

Esclusione della contaminazione con DNA materno

Analisi di microsateliti (STR)

Il numero di ripetizioni varia frequentemente tra gli alleli portando ad un alto grado di polimorfismo

piccoli blocchi di ripetizioni in tandem,da 15-50 volte,semplici nella sequenza (1-6bp)e dispersi nel genoma

Sono numerosi

Analisi di microsateliti

Multiplex PCR Amplificazione di diversi (15) STR in contemporaneo utilizzando primers fluorescenti

Elettroforesi capillare (Genetic Analyzer 3500XL)

4000

3200

2400

1600

800

-

-

-

-

-

130 170 210 250 290 330 370 - - - - - - -

250 290

4000

3200

2400

1600

800

-

-

-

-

-

130 170 210 330 370 - - - - - - -

Madre

Villo

Madre

Allele 1 Allele 2

128 140

162 162

220 234

298 302

Villo

Allele 1 Allele 2

128 132

162 166

220 220

298 302

Next generation sequencing

Consente il sequenziamento simultaneo di un enorme numero di frammenti di DNA in tempi più rapidi e a costi più bassi

Targeted resequencing of genes involved in metabolic diseases In particular lysosomal diseases with similar phenotypes

Step 1 : DNA bank generation

Fragmentation

Genomic DNA

Ligation of adaptor and

index

Step 1 DNA library generation

Step 2 Clonal

amplification

Step 3 Sequencing

Genomic libray

Next generation sequencing 3 steps

A B

2-Amplificazione clonale

Next generation sequencing (NGS)

Support =FlowCell

Next generation sequencing (NGS)

3-sequencing by stnthesis (SBS)

Next generation sequencing (NGS)

4-Analisi

Immagini di fluorescenza Sequenze nucleotidiche (reads) “quality score”

Allineamento con la sequenza di riferimenti “Variant call “

L’accuratezza viene assicurata dalla lettura ripetuta e massiva di ogni frammento

deep coverage