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Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos

Dal DNA al RNA: la trascrizione. Il RNA e l’origine della vita.

Il dogma centrale della biologia

L’informazione per costruire un organismo vivo, da un baDerio al uomo, risiede nel DNA, dal quale c’e un flusso conGnuo prima a RNA e poi a proteine, che sono i cosGtuenG struDurali e funzionali principali degli organismi vivi.

Replicazione del DNA Riparazione del DNA

Ricombinazione gene4ca

Sintesi del RNA Trascrizione

Sintesi delle proteine Traduzione



L’informazione al interno della doppia elica di DNA è organizzata in traJ definiG, unità funzionali che codificano ognuna per una proteina: i geni. Geni diversi vengono leJ con diversa frequenza, e così proteine diverse sono prodoDe in quanGtà differenG.

Trascrizione Trascrizione

Traduzione Traduzione

Amplificazione Controllo

Amplificazione Controllo Espression

e genica



Primo passo: dal DNA al RNA La trascrizione L’informazione passa da una molecola a un’altra, ma simile, sempre faDa di nucleoGdi.

Differenze: -‐ Lo zucchero è ribosio in vece che deossiribosio. -‐  In vece che Gmina, si usa uracile, che accoppia pure con adenina, dunque il principio della complementarità delle basi regge pure per il RNA, permeDendo la trasmissione d’informazione.



Come nella coppia Gmina -‐ adenina, in quella uracile -‐ adenina ci sono due legami a idrogeno.



I legami fra nucleoGdi è lo stesso nel RNA che nel DNA: legame covalente fosfodiestere.



Pero il RNA, anche se molto simile al DNA chimicamente, si organizza in forma molto diversa: non fa una doppia elica, si Gene a filamento unico, ed è in grado di adoDare tanGssime conformazioni diverse, grazie ai legami fra le sue basi. Questo li permeDe di svolgere ruoli molto diversi: trasmissione della informazione geneGca (stampo per fare proteine), ruoli struDurali e persino ruoli cataliGci.



LA TRASCRIZIONE

-‐ E il processo di sintesi di RNA usando come stampo il DNA. -‐  La doppia elica di DNA si apre e uno dei due filamenG fa di stampo per il RNA, grazie al appaiamento delle basi. -‐  La sequenza di RNA risultante è complementare a quella che fa di stampo, e idenGca (tranne U in vece di T) a quella che non si è usata come stampo. -‐  Il processo è molto simile alla replicazione del DNA: i nucleoGdi trifosfato (A, U, C, G) portano legami ad alta energia, che si usa per la formazione del legame fosfodiestere). -‐  Diversamente dalla replicazione, la catena di RNA si stacca presto dal DNA stampo. -‐  Le catene di RNA, i trascri=, sono molto più corG che le catene di DNA.



La molecola che catalizza la formazione del RNA è la RNA polimerasi, simile alla DNA polimerasi. Apre solo una ‘finestra’ di doppia elica DNA per usare un filamento come stampo, e avanza spostando la finestra lungo il DNA, sinteGzzando RNA in direzione 5’ a 3’. Solo un traDo breve di RNA rimane legato al DNA (˜9 nucleoGdi), dopo la RNA polimerasi lo slega e fa chiudere il DNA dietro.

RNA polimerasi

Ganasce in configurazione chiusa

Direzione della trascrizione

Ribonucleosidi trifosfato

Breve traCo di elica DNA/RNA

Nuovo trascriCo di RNA

Sito a=vo



Visto che il nuovo trascriDo di RNA si stacca presto dal DNA stampo, può cominciare la sintesi di un nuovo trascriDo dalla stesso gene prima che il precedente sia finito. Così si possono sinteGzzare simultaneamente diversi trascriJ dallo stesso gene.

La RNA polimerasi somiglia la DNA polimerasi, ma ci sono pure delle differenze: -‐  Catalizza il legame fosfodiestere fra ribonucleoGdi, in vece che deossiribonucleoGdi. -‐  Può cominciare la sintesi di RNA senza innesco. -‐  Non ha bisogno di essere così accurata: un errore nel RNA non è così drammaGco come nel DNA. La DNA polimerasi sbaglia 1 / 107, la RNA polimerasi 1 / 104.



Ci sono diversi Gpi di RNA, con diverse funzioni.

Tipo di RNA Funzione

RNA messaggero – codifica le proteine, mono o policistronico

RNA ribosomico – forma il nucleo dei ribosomi, catalizza la sintesi di proteine

micro RNA – regolano l’espressione genica negli eucario4

RNA transfer – adaCatori che mediano il legame dei nucleo4di al mRNA

A=vi nello splicing, la sintesi dei telomeri e molte altre funzioni

Altri piccoli RNA



La RNA polimerasi si deve aDaccare fortemente al DNA per cominciare la trascrizione, e questo solo accadde in traJ di sequenza molto parGcolari: i promotori.

Ogni gene ha un promotore al suo inizio e un segnale di terminazione (o sequenza di arresto) alla fine, che marcano il principio e la fine del traDo che si deve trascrivere.

Nel caso della RNA polimerasi baDerica, l’inizio della trascrizione avviene al promotore grazie alla subunità sigma, che media il legame al promotore e si stacca dopo ˜10 nucleoGdi.



TuJ e due filamenG di DNA possono fare di stampo per la trascrizione, ognuno in una orientazione diversa, ma per ogni traDo di DNA si trova solo un promotore, in una delle due catene, in una delle due orientazioni.



-‐ Nei baDeri c’e soltanto un Gpo di RNA polimerasi, ma nelle cellule eucarioGche ci sono tre Gpi, con ruoli diversi:

-‐  Le RNA polimerasi eucarioGche hanno bisogno di tanG faDori per iniziare la trascrizione. -‐  Il controllo della espressione genica è molto più complesso nei eucarioG: ci sono lunghi traJ di DNA non codificante fra i geni, dove si trovano tante sequenze di regolazione della espressione genica. -‐  Il DNA eucarioGco è molto organizzato nella cromaGna.

Tipo di polimerasi Geni trascri=

Maggioranza del RNA ribosomiale (rRNA)

Geni codifican4 proteine (mRNA); miRNA; altri piccoli RNA

Geni per RNA transfer (tRNA); gene per rRNA 5S; altri piccoli RNA



L’inizio della trascrizione in eucarioG richiede l’intervento di tante proteine: i faCori generali di trascrizione. TuJ insieme: -‐  Fanno legare la RNA polimerasi al promotore. -‐  Aprono la doppia elica di DNA. -‐  Fanno parGre la RNA polimerasi.

Il primo faDore a legarsi è TFIID, che lega un traDo del promotore contenente tante A e T: la TATA box o sequenza TATA. TFIID è un complesso con diverse subunità, fra loro la proteina che lega TATA (TATA binding protein, TBP). Questa proteina distorce il DNA, creando una conformazione che potrebbe essere il segnale per il legame dei altri faDori generali di trascrizione.



Dopo il legame di TFIID si legano gli altri faDori generali di trascrizione e la RNA polimerasi, formando il complesso d’inizio della trascrizione.



Una volta che la RNA polimerasi si è legata per bene, si deve sganciare dal complesso d’inizio e avviare la trascrizione. Questo succede grazie alla fosforilazione della ‘coda’ della RNA polimerasi, operata dalla aJvità chinasi del TFIIH.

I faDori generali di trascrizione si slegano e sono disponibili per un altro ciclo.

La RNA polimerasi completa la sintesi del trascriDo, si slega dal DNA e viene defosforilata, così è pronta per un altro ciclo.



Gli mRNA baDerici, rilasciaG direDamente nel citoplasma, sono pressi direDamente dai ribosomi per la traduzione (sintesi di proteine).

Nelle cellule eucariote la trascrizione avviene al interno del nucleo, dove i mRNA sono soDoposG a un processo di maturazione dopo la sintesi e prima del suo trasporto al citoplasma. Gli enzimi per la maturazione interagiscono con la RNA polimerasi e cominciano la loro funzione man mano che il trascriDo esce dalla polimerasi.

Il Gpo di maturazione è diverso a seconda del Gpo di RNA.



Maturazione degli mRNA:

-‐  Apposizione de un cappuccio di guanina me4lata allo stremo 5’, quando il mRNA è ancora in sintesi (dopo circa 25 nucleoGdi). -‐  Addizione de una coda di poli-‐A (150-‐250 A) allo stremo 3’: poliadenilazione.

Queste due modifiche stabilizzano il mRNA (prolungano la sua vita) e lo marcano come messaggero completo, in grado di essere poi tradoDo in proteina.



Gli mRNA baDerici sono semplici: una sequenza ininterroDa codifica una proteina. In vece i geni delle cellule eucarioGche producono mRNA che hanno sequenze interposte: introni, non codificanG, e sequenze codificanG, che esprimono proteina: esoni. C’e tanta variazione, ma in genere i geni eucarioGci contengono diversi introni, più lunghi degli esoni.



Il terzo processo di maturazione del mRNA consiste nel taglio degli introni e saldatura degli esoni per produrre un mRNA di sequenza codificante conGnua: splicing. Lo splicing può cominciare già durante la trascrizione del RNA, e la poliadenilazione può avvenire durante o dopo lo splicing. Gli introni hanno delle sequenze nucleoGdiche che sono segnali per il processo di splicing:

R = A o G Y = C o U N = qualunque



Il processo di splicing viene svolto dallo spliceosoma: Un aggregato di piccole molecole di RNA (i piccoli RNA nucleari, snRNA) che si uniscono a proteine formando piccole par4celle ribonucleoproteiche nucleari (snRNPs). In questo aggregato nucleoproteico, sono gli snRNA a svolgere per lo più le funzioni cataliGche necessarie per il taglio e saldatura che elimina gli introni.

Lo splicing avviene con la formazione d’una struDura prima ad ansa e poi a cappio, dove c’e una A che gioca un ruolo fondamentale.



Per ché i geni degli eucarioG sono faJ da esoni ed introni? -‐  Un vantaggio è la possibilità di combinare gli esoni in maniere diverse per fare differenG versioni della proteina: splicing alterna4vo. -‐  Un altro vantaggio è di Gpo evoluGvo: questa costruzione modulare permeDe fare proteine nuove ricombinando pezzi funzionali già esistenG in altre proteine (per ricombinazione geneGca).



I procarioG hanno una espressione genica più semplice, ma ancora non sappiamo se…

-‐ sono gli eucarioG che hanno acquisito gli introni come materiale geneGco invasivo o

-‐ se le cellule primiGve avevano introni e poi i procarioG li hanno eliminato per essere più efficienG nella replicazione ed espressione del loro genoma.



Soltanto gli mRNA che sono staG maturaG correDamente escono dal nucleo per essere tradoJ a proteina nel citoplasma. Gli altri sono degradaG al interno del nucleo, e i nucleoGdi riciclaG. L’uscita è seleJva e controllata, e dipende del legame de diverse proteine che riconoscono le modifiche avvenute durante la maturazione.

Proteina che lega il cappuccio

Proteina che lega la coda poli-‐A

EJC: complesso di giunzione esonica

Più il receCore di trasporto nucleare…

TRADUZIONE



Gli mRNA si usano diverse volte per produrre proteina. Di più a lungo persiste una molecola di mRNA nel citoplasma, più volte può essere usata per sinteGzzare la proteina. La durata di un mRNA dipende di diversi segnali che regolano la degradazione del RNA, che finalmente avviene per azione di nucleasi. QuesG segnali e altri si trovano agli estremi non trado= dei mRNA: 5’ e 3’ UTR (untranslated regions).

3’ UTR

5’ UTR

Sequenza codificante



ORIGINE DELLA VITA NELLA TERRA

Studiando i processi d’espressione genica, si arriva a un dilemma: se gli acidi nucleici sono necessari per fare le proteine, e le proteine sono necessari per sinteGzzare e processare gli acidi nucleici, cosa è venuta prima, l’uovo o la gallina?

Una ipotesi sosGene che c’e stato un periodo dove la vita era tuDa basata sul RNA: il mondo del RNA, dove il RNA era la molecola che portava l’informazione e pure quella che svolgeva le funzioni cataliGche. Come prova, ci sono restaG ribosomi e spliceosoma, due casi di ‘fossili molecolari’.



Nel mondo del RNA, le molecole di RNA erano in grado di aJvità che oggi si considerano proprie degli esseri vivenG: formavano un sistema autocatali4co, in grado di:

-‐ replicarsi per formare molecole idenGche a la prima usando materia prima dal ambiente; -‐ competere con altre forme autocataliGche per le risorse ambientali; -‐ ‘morire’ se le reazioni catalizzate raggiungono l’equilibrio chimico o se le condizioni

ambientali (temperatura, nutrienG, etc) sconvolgono i loro processi chimici.

Il RNA si può replicare usando il meccanismo a stampo per fare molecole idenGche alla prima:



Il RNA è pure in grado di catalizzare delle reazioni: ribozimi.

Grazie alla loro sequenza nucleoGdica, gli RNA possono adoDare delle conformazioni tridimensionali parGcolari, alcune delle quali sono adaDe a catalizzare reazioni chimiche mediate pure dal accoppiamento di basi col sostrato.



Non sappiamo se il mondo del RNA è veramente esisGto, ma ci sono RNA in natura e faJ in laboratorio in grado di catalizzare diverse reazioni:



La prima evoluzione…

Il RNA è più semplice chimicamente che il DNA: il ribosio si può formare dal ‘brodo primiGvo’, in vece il deossiribosio ha bisogno di enzimi proteici per la sua sintesi.

Le proteine, con più gruppi reaJvi e più capacità cataliGche, hanno presso il posto come molecole funzionali delle cellule.

Il DNA, comparso probabilmente dopo nella storia evoluGva, è più stabile e più adaDo alla riparazione dei danni chimici. Ha presso il posto come molecola per l’informazione.

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