PURIFICAZIONE DELLE PROTEINE

Separazione di 1 proteina da altre 10.000 - 20.000 proteine diverse (in una cellula, tessuto)

Il grado di purezza che si vuole raggiungere dipende dagli scopi finali.

Cosa si intende per “proteina pura”? E’ praticamente impossibile raggiungere il 100%

Moderata (<95%) determinazione struttura primariaproduzione di anticorpistudio della cinetica di un enzima (è importante che non ci siano attività competitive)

Elevata (95-99%) cristallografia a raggi Xcaratterizzazioni chimico fisiche

Estremamente elevata (>99%) uso terapeuticostudi in vivo

Proteine non ricombinanti

• Basso livello di espressione

• Difficile reperibilità della fonte

• Sicurezza (organismi patogeni)

• Difficoltà di purificazione

Microbial cells

or tissue

Break cells,

tissue, or organ

Blender,

homogenizer,

sonication,

osmotic pressure

Pellet with intact cells, organelles, membranes and membrane proteins

Supernatant with

Soluble protein

Rottura della parete e della membrana cellulareCellule batteriche

Nelle cellule procariotiche oltre alla membrana cellularebisogna distruggere la parete cellulare costituita dapeptidoglicano, (eteropolimero con unità alternate di N-acetilglucosammina e acido N-acetilmuramico unite dalegami glicosidici ß1->4).

Questi polimeri lineari sono disposti l’uno accanto all’altro esono uniti da piccoli peptidi, la cui struttura dipende dallaspecie batterica. Le proprietà antigeniche dei batteri sonospesso dovute ai costituenti della parete.

•Il lisozima idrolizza il legame glicosidico del peptidoglicano(è presente nell’albume dell’uovo, nelle lacrime, come difesadegli occhi contro le infezioni batteriche)

Rottura della parete e/o membrana cellulare

Per le cellule vegetali e i funghi, che possiedono unaparete cellulare più resistente rispetto ai batteri, ènecessario rompere la parete con

metodi fisici (cicli ripetuti di congelamento-scongelamento, biglie di vetro, sonicazione, utilizzo dimortaio e pestello ecc.)

oppure

metodi enzimatici capaci di digerire la parete cellulare.

OMOGENIZZATORE A ROTORE -STATIVO

FRENCH PRESSOMOGENIZZATORE DI VETRO

SMERIGLIATO

PURIFICAZIONE di una PROTEINA

•Prendere le necessarie precauzioni durante la purificazione per minimizzare i danni (inattivazione irreversibile e perdita della proteina) temperatura agenti stabilizzanti eliminazione di proteasi

detergenti per proteine di membrana

•Cercare di usare il minor numero possibile di passaggi di purificazione

•Non purificare più del necessario allo scopo finale

TAMPONI FREQUENTEMENTE UTILIZZATI

INTERVALLO DI pHGLICINA /HCl 2.2-3.6Na2HPO4/acido citrico 2.6-7.6acido citrico/citrato 3.0-6.2acido acetico/sodio acetato 3.7-5.6NaH2PO4/Na2HPO4 5.8-8.0trietanolammina idocloruro/NaOH 6.8-8.6Tris/HCl 7.0-9.0Dietanolammina/HCl 8.0-10.0Sodio Borato/HCl 8.1-9.0Glicina/NaOH 8.6-10.6Sodio carbonato/sodio bicarbonato 9.0-10.7

GOOD BUFFERS

MES/NaOH 5.8-6.5ADA/NaOH 6.2-7.2PIPES/NaOH 6.4-7.2MOPS/NaOH 6.5-7.9HEPES/NaOH 7.0-8.0Tricine/HCl 7.6-8.8Bicine /HCl 7.8-8.8CHES/NaOH 9.0-10.1CAPS/NaOH 9.7-11.1

Il primo passo di qualunque tecnica di biologia molecolareconsiste nell’isolare e purificare acidi nucleici.I protocolli sperimentali variano a seconda

del materiale di partenzadel tipo di acido nucleico che si vuole separaredal tipo di esperimento che si deve effettuare, ecc.

In tutti i casi dovremo :

1. Rompere la parete e/o la membrana cellulare

2. Separare gli acidi nucleici dagli altri componenti cellulari

3. Separare gli acidi nucleici tra loro (per es. DNA da RNA)

Isolamento e purificazione di DNA e RNA

Rottura della parete e della membrana cellulareCellule batteriche

La rottura della parete batterica è effettuata mediantetrattamento con una miscela contenente

• Il lisozima idrolizza il legame glicosidico delpeptidoglicano• l’EDTA è un agente chelante che sequestra i cationibivalenti necessari per la stabilizzazione delle membrane(e per l’attività di molti enzimi tra cui la DNasi)• l’SDS (detergente anionico) solubilizza i lipidi dellemembrane e lega le proteine alterandone la strutturasecondaria

Rottura della parete e/o membrana cellulareCellule eucariotiche

Le membrane delle cellule animali sono solubilizzate condetergenti blandi quali SDS

Per un campione di tessuto è necessaria un’inizialeomogenizzazione che è realizzata mediante:

• Metodi meccanici: omogeneizzatore a pestello (potter).• Vibrazioni ultrasoniche• Congelamento/scongelamento

Separazione degli acidi nucleici da altri componenti cellulari

Una centrifugazione permette di eliminare i detriti cellulari dalcontenuto cellulare rilasciato nel mezzo, che è costituito da variecomponenti cellulari come DNA, RNA, lipidi, mono e polisaccaridi,

proteine e sali.

Una buona preparazione di DNA cromosomale permette diottenere frammenti di DNA lunghi al massimo di 25 kbp

- E’ importante deproteinizzare la soluzione e poi procedere allaprecipitazione dell’acido nucleico con alcol.

La rimozione delle proteine dal lisato cellulare è particolarmenteimportante sia perché tra le proteine sono presenti enzimi capacidi degradare gli acidi nucleici, sia per la presenza di proteinecapaci di legarsi agli acidi nucleici impedendone la funzione e/o lapurificazione.

Le proteine sono rimosse dalla preparazione mediante varietecniche da usare in combinazione, o l’una in alternativaall’altra.

1. Uso di enzimi proteolitici, tipo pronasi e proteinasi K.- la Pronasi: miscela di almeno 4 enzimi proteolitici di cui dueendopeptidasi (serina- e metallo-proteasi) e due esopeptidasi(carbossi e ammino-peptidasi).

- la Proteinasi K, così detta per il suo potere di idrolizzare lacheratina, è una endopeptidasi di origine fungina.La rimozione degli ioni Ca++ determina la perdita dell’80% della sua attività

enzimatica, ma l’attività residua è comunque sufficiente a degradare le proteineche contaminano gli acidi nucleici. Pertanto la digestione può essere condotta inpresenza di EDTA, necessario per inattivare le DNasi.

Gli enzimi proteolitici andranno poi eliminati.

Rimozione delle proteine

Estrazione con fenolo(miscela di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico 25:24:1)

E’ la tecnica comunemente utilizzata per rimuovere leproteine dagli acidi nucleici, e consiste nel trattare lasoluzione acquosa contenente gli acidi nucleici con unamiscela fenolo/cloroformio, immiscibile (quasi) in acqua.

Tale procedura può essere usata da sola o dopo ladigestione con enzimi proteolitici, al fine di rimuoverli.

Per le preparazioni di DNA, per eliminare l’RNA si usa la

ribonucleasi A (RNasi);

Per le preparazioni di RNA, per eliminare contaminazioni di

DNA invece è utilizzata la desossiribonucleasi (DNasi).

Anche queste attività enzimatiche vanno poi eliminate

C6H5OH

FenoloE’ un forte denaturante delle proteine che silega ad esse, alterandone la struttura.

Le proteine denaturate, con i gruppi idrofobiciesposti, diventano solubili nella fase fenolica oprecipitano all’interfase fenolo-acqua.

Cloroformio- completa la denaturazione delle proteine- rimuove i lipidi- grazie alla sua elevata densità facilita la separazione dellafase acquosa (contenente il DNA deproteinizzato) daquella organica (fenolica) stabilizzando l’interfaccia tra ledue fasi.

Alcol isoamilico: riduce la schiuma che si forma nel corsodell’estrazione.

Fase acquosa (DNA e RNA)

Interfase (proteine denaturate)

Fase fenolica (proteine solubili)

Dopo centrifugazione si ottengono tre fasi:1. superiore, che contiene la soluzione di acidi nucleici;2. interfase, proteine denaturate;3. inferiore, fase fenolica contenente lipidi e proteine ricche di aminoacidi idrofobici.

Preparazione del fenoloIl fenolo è fortemente igroscopico e deve essere sempreequilibrato con una soluzione tampone perché altrimentiassorbirebbe la soluzione acquosa contenente gli acidi nucleici.

Il fenolo tende ad ossidarsi facilmente assumendo un colore rossastro per lapresenza di chinoni. Si aggiunge la 8-idrossichinolina (antiossidante, parziale

inibitore delle RNasi e debole chelante di ioni metallici)

A un’estrazione fenolica fa seguito un’estrazione con

cloroformio/isoamilico (24:1)e una

precipitazione con alcol per concentrare gli acidi nucleici(le proteine sono insolubili in alcol e co-precipiterebbero in larga misura con gliacidi nucleici se non fossero preventivamente rimosse)

La soluzione acquosa contenente l’acido nucleico è miscelata con 2volumi di etanolo assoluto, in presenza di cationi monovalenti (Na+,K+, NH4

+) e viene lasciata precipitare a –80°C.

Estrazione e analisi dell’RNA

Una tipica cellula di mammifero contiene circa 20-30 picogrammi di RNA.

La popolazione di RNA cellulari è molto eterogenea:

RNA totale :•RNA codificante (~4%)Comprende le molecole di mRNA citoplasmatico e iprecursori nucleari (hnRNA: heterogeneous nuclear RNA)

•RNA non codificante (~96%)-RNA ribosomiali: 28S, 18S, 5,8S e 5S, con i relativi precursori, che costituiscono fino all’80% dell’RNA totale

-tRNA e altri piccoli RNA

Estrazione dell’RNA

Vincere la battaglia con le RNasi

Le DNasi richiedono ioni metallici per la loro attività e sono termolabili,

per cui sono facilmente inattivate da agenti chelanti e dalla

sterilizzazione in autoclave

Le RNasi non hanno bisogno di cofattori, resistono a trattamenti

drastici (ebollizione prolungata, sterilizzazione in autoclave) e sono

attive entro un ampio range di pH.

Fonti di RNasi in laboratorio

•Tamponi e soluzioni di uso comune che se utilizzati senza opportuneprecauzioni, possono ospitare batteri o altri microrganismi che rilascianoi loro enzimi; autoclavarli non inattiva le RNasi, anzi può introdurle neireagenti, per es. liberandole dai batteri contaminanti.•lavorare senza guanti può introdurre nelle soluzioni RNasi batteriche ecellulari•batteri veicolati dall’aria possono sedimentare sulla superficie dellesoluzioni, portando con sé RNasi•Pipette Mai utilizzare le stesse pipette che hanno già dispensatosoluzioni di RNasi

•E’ importante quindi :•Dividere le soluzioni in piccole aliquote•Utilizzare plastica garantita RNasi-free•Trattare la vetreria per almeno 4 ore a 200°C•Indossare sempre guanti e cambiarli spesso•Mantenere un’area di lavoro separata, dedicata all’RNA, con dotazione dipipette, puntali, provette, reagenti e tamponi esclusivi. Ciò è importanteparticolarmente, se nello stesso laboratorio si usa RNasiA per estrazionedi DNA.

Come proteggere l’RNA dalla degradazione da parte delle RNasi

Potenti agenti denaturanti:

Sali di guanidinio (guanidinio cloruro, guanidinio tiocianato) Il guanidinio cloruro è un elettrolita forte; le proteine sidissolvono in soluzioni concentrate (4M) perdendo la lorostruttura secondaria e attività biologica.

2-mercaptoetanolo un agente riducente in grado di rompere i ponti disolfurici delle proteine

Temperatura lavorare mantenendo le provette in ghiaccio è un modo di inibire le ribonucleasi

Sostanze deproteineizzanti: fenolo, cloroformio, SDS, proteinasi K

Come proteggere l’RNA dalla degradazione da parte delle RNasi

RNase inhibitor: proteine di origine umana (placenta) o non umana (E. coliricombinante), che si legano in modo non covalente alle RNasi e neinibiscono così più del 90% dell’attività. Il legame è però reversibile el’inibitore deve essere mantenuto attivo, evitando soluzioni contenenti agentifortemente denaturanti, come SDS o urea, mantenendo un ambienteriducente (presenza di DTT) e la temperatura < 65°C.

DEPC (dietilpirocarbonato): un agente alchilante molto reattivo che reagiscecon le proteine attaccando l’azoto imidazolico dei residui istidinici,determinando la perdita dell’attività enzimatica.Si usa alla concentrazione finale dello 0,1% per inattivare le RNasicontaminanti presenti nelle soluzioni.Al termine del trattamento deve essere inattivato in autoclave (è idrolizzatoad etanolo e CO2).Composti contenenti gruppi amminici primari, come il Tris reagiscono con ilDEPC; di conseguenza, le soluzioni devono essere preparate sciogliendo ilTris in acqua già trattata con DEPC ed autoclavata.

Estrazione dell’RNA totale

Metodo della guanidina tiocianato in gradiente di cloruro di cesio• Colture cellulari o tessuti molli si lisano direttamente.• Gli altri tessuti si polverizzano in azoto liquido.

(Le RNasi endogene si attivano quando si rompono le cellule!)

• Lisi cellulare e denaturazione delleproteine (RNasi) sono immediatenella soluzione di guanidinatiocianato.

• Aggiungendo detergenti (SDS) eagenti riducenti (DTT) si dissocianoi complessi proteine-acidi nucleici.

• L’RNA è più denso (> 1,8 g/ml)degli altri componenti cellulari equindi attraversa il cuscino dicloruro di cesio.

• Si perdono i piccoli RNA cellulari:tRNA e rRNA 5S.

• Si recupera l’RNA dal fondo e si trasferisce in provetta.

• Si precipita l’RNA in etanolo e sali, poi si sospende il pellet di RNA in una soluzione tampone.

• Si analizza la qualità dell’RNA estratto.

Isolamento dell’mRNA

La maggior parte degli mRNA eucariotici presentano la coda di poliA

all’estremità 3’.

L’mRNA poliadenilato può quindi ibridare con sequenze sintetiche di

oligo(dT) (corti polimeri di desossitimidina), mentre le altre specie di RNA

che non ibridano con l’oligo(dT) possono essere eliminate.

Questo metodo non è adatto per gli mRNA batterici, perché solo una

piccola percentuale degli mRNA è poliadenilato con code di poliA piuttosto

corte.

Isolamento dell’mRNA

•La preparazione di RNA totale èfatta passare attraverso una colonnacostituita da un polimero ricopertocon oligo(dT).

•Solo l’mRNA polidenilato ibrideràcon l’oligo(dT), mentre le altrespecie verranno eliminate mediantelavaggi con tamponi a bassaconcentrazione salina.

•L’eluato finale sarà costituito dallamiscela di tutte le specie di mRNApresenti nella cellula al momentodell’estrazione.