Cromatografia. Tecniche cromatografiche Basate sulla ripartizione Basate sulladsorbimento.
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Cromatografia
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Cromatografia
Tecniche cromatografiche
• Basate sulla ripartizione
• Basate sull’adsorbimento
Metodi di ripartizione
B
AR S
SK
[S]A = 1[S]A = 0.09
[S]B = 0.91
1.091.0
09.0RK
EQUILIBRIO
FASE STAZIONARIA
FASE MOBILE
A
A
EQUILIBRIO
FASE STAZIONARIA
FASE MOBILE
A
A
EQUILIBRIO
FASE STAZIONARIA
FASE MOBILE
S S
S S
100 50
50 50
25
25 12.5
37.5
37.5
12.5
6
6
38
25
25
100 10
90 18
81
1 0
2.7
24
73
0
66
5
0
29
100 90
10 18
1
81 73
24
3
0
66
0
5
29
0
100
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15
20
25
30
Con
cent
razi
one
Segmento di colonna
0 2 4 6 8 10
0
5
10
15
20
25
30
Con
cent
razi
one
Segmento di colonna
0 20 40 60 80 100
0
5
10
15
20
25
30C
once
ntra
zion
e
Segmento di colonna
Cromatografia su colonna
Volume di ritenzione
SRMCRR VKVFtV
Rapporto di ripartizione
M
SR
MM
SS
V
VK
VC
VCk
'
β
Per una specie non ritenuta: VR = VM e k’ = 1
M
MR
M
MR
t
tt
V
VVk
'
0 20 40 60 80 100
0
5
10
15
20
25
30
Con
cent
razi
one
tempo di ritenzione
Risoluzione
21
12 )(2
ww
ttR RRS
A metà altezza: wh = 1.1775 w
Risoluzione
Piatti teorici e larghezza dei picchi,capacità di picchi
2
216
w
tN R
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0
5
10
15
20
25
30
Con
cent
razi
one
tempo di ritenzione
N
tw R
2
V
VNn ln
161
Cromatografia su carta
Tipi di matrici utilizzate• Agarosio Polisaccaride derivante da particolari alghe rosse cosituito
da residui alternati di D-galattoso e 3,6-anidro-L-galattoso. Disponibile commercialmente come Sepharose, Sepharose CL (cross-linking con 2,3-dibromopropanolo), Superose, Bio-Gel A. Limiti di esclusione 10-40000 kD.
• Cellulosa Polimero di unità glucosidiche unite da legami -1,4. Tramite epicloridrina vengono ottenuti i legami crociati essenziali per l’utilizzo come matrice in cromatografia, il numero dei quali determina la dimensione dei pori.
• Destrano Polimero di residui di glucosio uniti da legami -1,6 prodotto dal batterio Leuconostoc mesenteroides. In commercio con il nome di Sephadex. La porosità dei gel a base di destrano è controllata dalla massa molecolare del destrano usato e dall’ introduzione di legami crociati ottenuti con epicloridrina. Limiti di esclusione 0.7-800 kD. Il Sephacryl è destrano con legami crociati ottenuti con N,N’-metilene bisacrilamide. Limiti di esclusione 1-8000 kD. Il Superdex e’ un gel composito costituito da destrano covalentemente legato ad agarosio.
Formazione della matrice
OO
OOH
CH2OHOH
O
O
OH
O
Agarosio
NHNH
OO
CH2
CH2 n
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
O
O
O
O
OH
OH
OH
OONH
NH
O
O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
O
O
O
Sephacryl®
O
OH
OH
OH
O
OO
OH
OH
O
OO
OH
OH
OH
O
OH
O
OO
O
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OO
OH
OH
O
OH
O
O
Sephadex®
Tipi di matrici utilizzate
• Poliacrilamide: Polimero di acrilamide e N,N’-metilenbisacrilamide (quest’ultimo determina la formazione di legami crociati). E’ disponibile in commercio come Bio-GelP, con limiti di esclusione tra 0.2 e 400 kD.
• Polistirene Polimero di stirene legato con divinilbenzene.
• Silice Polimero prodotto a partire dall’ acido ortosilicico. I molti gruppi silanolo (Si-OH) rendono la matrice altamente idrofilica. Il loro eccesso può essere eliminato derivatizzando con triclorometilsilano.
Colonne
