L C t fiL C t fiLa CromatografiaLa Cromatografiageneralitàgeneralitàgeneralitàgeneralità

ITI Manciano A.S. 2009-10 classe V

Questa presentazione è stata redatta con la finalità di fornire una rappresentazione h ti ti d ll i i / ti d l b E i t d ischematica e non esaustiva delle nozioni e/o argomenti da elaborare. Essa non intende in alcun modo sostituirsi ai libri di testo ai quali ci si deve necessariamente riferire per lo studio dell’argomento in questione.

L’autoreprof. Gianni ROMEO

La cromatografia è il metodo più diffuso per effettuare separazioni analiticheseparazioni analitiche.

Fu inventata e così denominata da unbotanico russo, Mikhail Tswett, nel 1906.

Separò pigmenti vegetali come clorofillef ll f d de xantofille, facendo passare etere di

petrolio attraverso una colonna riempitacon carbonato di calcio. I vari pigmentip gdavano luogo alla formazione di strati didiverso colore.

Esperimento di Tswett

Etere di petrolio

Miscela di pigmenti

CaCO3pigmentiseparati

Principi generaliLa cromatografia è un metodo di separazione che sfrutta la diversa affinità delle molecole e degli ioni nei confronti di due fasi differenti.affinità delle molecole e degli ioni nei confronti di due fasi differenti.

Fase stazionaria: è fissa (solido o liquido supportato). Rappresenta laresistenza alla migrazione di un soluto.

F bil ( l t ): li id s h s s ll f s fiss ; lFase mobile (o eluente): liquido o gas che scorre sulla fase fissa; provoca lamigrazione di un soluto nella direzione del suo scorrimento.

La migrazione differenziale:

Esperimento fondamentale

a. Caricamento in colonna di una miscela di tre sostanze (A, B, C); lafase stazionaria è saturata dall’eluentefase stazionaria è saturata dall eluente.

b. Via via che viene aggiunto l’eluente, i diversi componenti si separanoe formano delle bande (ben visibili nel caso di sostanze colorate).( )

c,d. Raccolta di frazioni di volume noto in uscita dalla colonna.

Dinamica della separazione pDurante l’eluizione si realizza una sorta di competizione tra fasestazionaria e fase mobile nei confronti delle sostanze eluitestazionaria e fase mobile nei confronti delle sostanze eluite.

Ogni componente della miscela tende a distribuirsi tra le due fasipassando (in condizioni ideali) attraverso una serie infinita di statipassan o ( n con z on a ) attra rso una s r nf n ta statdi equilibrio che si realizzano in ogni strato di spessore infinitesimodella colonna.

Dinamica della separazione

I componenti maggiormentet tt ti d ll ftrattenuti dalla fasestazionaria si muovono piùlentamente con il flusso di faselentamente con il flusso di fasemobile.

I componenti più debolmenteI componenti più debolmentetrattenuti dalla fasestazionaria si muovono piùz mu p ùrapidamente.

Per la differente mobilità, i componenti del campione siseparano in bande discrete (analisi qualitativa e

tit ti )quantitativa).

Classificazione delle tecniche Classificazione delle tecniche cromatograficheg f

Le tecniche cromatografiche possono

essere suddivise in base a:

- tipo di fase mobile;

- meccanismo di meccanismo di separazione;

tecnica di eluizione- tecnica di eluizione.

Classificazione in base al tipo di fase mobilef p f

Classificazione in base al tipo di eluizionef p

Classificazione in base al meccanismo di fseparazione

AdsorbimentoAFase stazionaria: solido in polvere; sulla superficie dei granuli si trovano deisiti attivi in grado di stabilire legami deboli con le molecole della miscela dasiti attivi in grado di stabilire legami deboli con le molecole della miscela daseparare.

Fase mobile: se é un liquido si parla di cromatografia liquido-solido (LSC); se éun s di cr m t r fi s s lid (GSC)un gas, di cromatografia gas-solido (GSC).

Durante l’eluizione le molecole siDurante l eluizione, le molecole siciascuna sostanza si ripartisconotra le due fasi, in misura variabilesecondo l’entità dell’adsorbimentosecondo l entità dell adsorbimento.

Adsorbimento

la quantità di adsorbato dipende dalla la quantità di adsorbato dipende dalla la quantità di adsorbato dipende dalla la quantità di adsorbato dipende dalla superficesuperfice di contatto tra il gas ed il solido.di contatto tra il gas ed il solido.

ma dipende anche dallapressione del gas e dalla pressione del gas e dalla temperatura

Ri ld d il i tRiscaldando il sistemale molecole di gastendono a staccarsi dallafase fissa

Adsorbimento Equazione di Freundlich

L’ d bi t è ill t t d d tt iL’ d bi t è ill t t d d tt iL’adsorbimento è illustrato da detta equazioneL’adsorbimento è illustrato da detta equazioneCCff = a P= a P1/n1/n in cui :in cui :CCff = = concconc. nella fase fissa. nella fase fissa

P = pressione del gas, a ed ndipendono dalla natura delle CCff

psostanze e dalla temperaturaCCff

saturazioneIn genere si scelgono le In genere si scelgono le condizioni operativelontane dalla saturazione d ve l’andament è quasi

pressione

dove l andamento è quasi rettilineo

pressione

Ripartizionep

L1L1 in questa rappresentazione i puntinin questa rappresentaz one punt nindicano le molecole di sostanza SS ;

le freccette invece indicano il movimento

L2L2

le freccette invece indicano il movimentodi queste tra le due fasi sino alraggiungimento dell’equilibrio

Ripartizione – Equaz. di Nernst

La sostanza La sostanza SS si scioglie ripartendosi tra le due fasi si scioglie ripartendosi tra le due fasi L1L1 e e L2L2 secondo l’equazione di secondo l’equazione di NernstNernst CC /C/C = K = K L1L1 e e L2L2 secondo l equazione di secondo l equazione di NernstNernst CCL1L1/C/CL2L2 = K = K (costante)(costante) CCL1L1= = ConcConc di S in L1 ; di S in L1 ; CCL1L1 ConcConc d S n L ; d S n L ; CCL2L2 = = ConcConc di S in L2di S in L2 KK = dipende dalle sostanze presenti e dalla temperatura.= dipende dalle sostanze presenti e dalla temperatura.

CCL1L1CCL1L1

CCL2L2

RipartizionepFase stazionaria: é un liquido, che impregna un solido granulareinerte in cui le sostanze da separare si solubilizzano Esse siinerte, in cui le sostanze da separare si solubilizzano. Esse siripartiscono fra le due fasi (immiscibili tra loro), secondo la diversasolubilità in ciascuna di esse.

K = Cs/Cm

K = coefficiente di ripartizione.Cs = concentrazione della sostanza nellaffase stazionaria.Cm = concentrazione della sostanza nellafase mobile

F bil è i l di fi li id (GLC)

fase mobile.

Fase mobile: se è un gas si parla di cromatografia gas-liquido (GLC),se invece é un liquido, di cromatografia liquido-liquido (LLC).

RipartizioneNelle colonne Nelle colonne cromatografiche lacromatografiche la

R pmolecole di gas

cromatografiche la cromatografiche la ripartizione si realizza ripartizione si realizza impregnando con unaimpregnando con unaimpregnando con una impregnando con una sostanza oleosa i sostanza oleosa i microgranuli che microgranuli che riempiono la colonnariempiono la colonna

sito di adsorbimentoadsorbimento

sito di ripartizione

Ripartizione /AdsorbimentoR p /ASiSi deducededuce cheche siasia ilil diagrammadiagramma dell’adsorbimentodell’adsorbimento checheggquelloquello delladella ripartizioneripartizione hannohanno lolo stessostesso andamentoandamento..

Per descrivere la separazione si A

Per descrivere la separazione si preferisce quindi parlare di: concentrazione in fase fissaconcentrazione in fase mobileB concentrazione in fase mobileB

Cmobile

Scambio ionicoFase stazionaria: polimeri con gruppi ionici o ionizzabili, acidi obasici (resine a scambio ionico), in grado di scambiare gli ioni mobilid ll i lli i ll l idella resina con quelli presenti nella soluzione a contatto con essa.

Si instaura una competizione fra i controioni della fase stazionariae quella della miscela in analisi nei confronti dei siti attivi presentie quella della miscela in analisi nei confronti dei siti attivi presentisulla fase stazionaria.

Esclusione

F t i i l i l i di i i i i bFase stazionaria: gel con pori le cui dimensioni variano in basealla composizione chimica e al modo in cui viene preparato.

Le molecole di analita disciolte nella fase mobile penetrano nelLe molecole di analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nelgel e vi permangono per un certo tempo. Quelle grandi sonoescluse dai pori ed escono dalla colonna in tempi molto brevi.

Affinità

a. Le molecole da separare si legano a gruppi funzionalif d ll f d b lspecifici della fase stazionaria mediante una reazione reversibile.

b. e c. Eluendo con una fase opportuna, si rompono i legami conla fase stazionaria e si recuperano le molecolela fase stazionaria e si recuperano le molecole.

Il cromatogrammaFatta eccezione per la TLC e la PC, tutte leseparazioni cromatografiche si concludono

i d i l i ècon un tracciato ed ogni sostanza eluita èdetto picco cromatografico.

Il tracciato descrive l’andamento delrivelatore in funzione del tempo o delvolume di eluente a t =0volume di eluente, a t =0.

tM: tempo morto = tempo di ritenzione di unasostanza non trattenuta dalla fase stazionariasostanza non trattenuta dalla fase stazionaria

tR: tempo di ritenzione = tempo impiegato daciascuna sostanza per scorrere attraverso la

l d l t 0 fi l t i i i h ilcolonna, dal t=0 fino al momento in cui non si ha ilmassimo del picco.h: altezza del picco = distanza tra il massimo e la linea di base.pwb: larghezza alla base del picco = lunghezza del segmento interpolatoall’intersezione fra le tangenti ai flessi della gaussiana e la linea di base.

l i i àSelettività

La selettività indica la capacità di unpsistema cromatografico di eluire speciechimiche diverse a velocità il più possibilediverse in modo tale che siano ben separatediverse, in modo tale che siano ben separatel’una dall’altra all’uscita della colonna.

Efficienza

Bassa efficienza

Indica la capacità di un sistema cromatograficodi eluire tutte le particelle di una data speciechimica con la stessa velocità, in modo dachimica con la stessa velocità, in modo dafornire bande e picchi molto stretti.

Si può esprimere facendo riferimento allalarghezza del picco (ad es. wb), che è diversaper ogni specie chimica. Essa, però, dipende daltempo di ritenzione.p

Buona efficienza

RisoluzioneIndica il grado di separazione dei picchi ottenuti al rivelatore di unsist m c m t fic ; b nd b n s p t lun l c l nn n nsistema cromatografico; bande ben separate lungo la colonna generanopicchi distinti e sufficientemente stretti da non sovrapporsi. In talcaso si dice che i picchi sono “ben risolti”.

Effetto della selettività, dell’efficienza e del fattore di ritenzione sulla risoluzione.

Selettività ed efficienza insufficienti: ii hi d i ti A B ipicchi dei componenti A e B si

sovrappongono.

Se si migliora l’efficienza, la risoluzioneg ,diventa accettabile: le basi dei picchi sirestringono e i picchi risultano nettamenteseparatiseparati.

Se si migliora la selettività (ad es.cambiando la fase stazionaria) si ottieneuna buona risoluzione: i tempi di ritenzioneuna buona risoluzione: i tempi di ritenzionecambiano e i picchi sono separati.

La colonna ha una buona efficienza, ma lai l i è i ddi f t (b f ttrisoluzione è insoddisfacente (basso fattore

di ritenzione). La risoluzione può migliorareiniettando una minore quantità di miscela.