Accoppiamento fra tecniche cromatografiche e spettrometria di massa

Le principali tipologie di accoppiamento fra le cromatografie GC e HPLC e laspettrometria di massa sviluppate finora sono:

Tecnica Tipologia di accoppiamento

GC-MS con interfaccia (a getto, a tubo/membrana porosi)

diretto (per GC con colonne capillari)

HPLC-MS Particle Beam (PB)

Ionizzazione ElectroSpray (ESI)

Ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI)

Accoppiamento GC-MS

Colonne impaccate

In questo caso il flusso di gas eluente dalla colonna è troppo elevato (da 10a 40 mL/min) perché lo si possa introdurre direttamente all’interno dellasorgente di ionizzazione dello spettrometro di massa, che è posta sottovuoto.

Occorre quindi inserire, fra gas cromatografo e spettrometro di massa,un’interfaccia che elimini parte del gas di trasporto:

Separatore a getto (Becker-Ryhage)

L’estremità della colonna GC termina inuna camera sotto vuoto e si affacciasull’ingresso dello spettrometro di massa.

Le molecole di gas di trasporto (azzurre),di solito più piccole di quelle di analita(arancione), vengono allontanate dal flussomolto più efficacemente, mediante unapompa rotativa.

pompa rotativa(10-2 torr)

GC MS

Separatore a tubo

Fra GC ed MS è posto un tubo porosoche può essere attraversato soltantodalle molecole di gas di trasporto, piùpiccole, che vengono facilmenteallontanate.

Separatore a membrana

E’ impiegato nei casi particolari in cui lemolecole di gas di trasporto siano piùgrandi di quelle dell’analita (ad esempionell’analisi GC di gas inorganici).

Quelle di analita riescono a passareattraverso i pori della membrana eraggiungono lo spettrometro di massa.

MS

GC scarico

membrana

GC MS

pompa rotativa(10-2 torr)

tubo poroso

Colonne capillari

In questo caso il flusso di gas eluente dalla colonna è sufficientementepiccolo (pochi mL/min) da consentire il suo ingresso diretto nella sorgentedi ionizzazione.

Oltre ai quadrupoli in GC-MS vengono impiegati analizzatori a trappola ionica o ToF.

I sistemi ToF consentono la registrazione di spettri di massa in tempi rapidissimi.

La linea di trasferimento è di solito un tubo capillare riscaldato a temperatureparagonabili a quelle del forno gas-cromatografico, in modo da evitare laricondensazione degli analiti prima dell’ingresso nello spettrometro.

Modalità di analisi in GC-MS

A differenza degli altri rivelatori GC lo spettrometro di massa nonfornisce direttamente un responso (ad es. dell’intensità di corrente in unFID) al passaggio di un analita.

Durante l’eluizione cromatografica esso acquisisce continuamente, conun’opportuna frequenza, spettri di massa, che vengono conservati nelcomputer che gestisce lo strumento.

Il cromatogramma GC-MS viene ricostruito mediante un’elaborazione ditali spettri, che può avvenire secondo due modalità:

Total Ion Current (TIC)

Si acquisisce uno spettro di massa su ampio intervallo di rapporto m/z (disolito da 50 a 2000) del gas effluente dalla colonna cromatografica.

Il computer somma le intensità dei picchi presenti nello spettro di massaottenuto ad un certo tempo durante la corsa cromatografica.

Il dato risultante (abbondanza) viene usato come ordinata del puntocorrispondente a quel tempo nel cromatogramma GC-MS.

Il dominio dei dati è di tipo tridimensionale: ad intervalli prestabiliti di tempodi ritenzione si ottiene uno spettro di massa, tipicamente di tipo EI o CI.

In corrispondenza dei tempi di ritenzione in cui avviene l’eluizione della solafase mobile lo spettro MS conterrà picchi poco intensi, legati ad impurezzedel gas di trasporto (spettro verde).

Gli spettri corrispondenti invece a picchi cromatografici (ad es. quelli in rossoe in blu) contengono spesso i frammenti, e quindi informazione utile sullastruttura molecolare, della sostanza eluita in corrispondenza di quei picchi.

0 30

Analisi qualitativa in GC-MS

L’ottenimento di spettri di massa sottesi ai picchi via via eluiti nel cromatogramma consente di avviare ricerche in banca dati per risalire all’identità dei composti corrispondenti:

Il confronto, in modalità automatizzata, con le centinaia di migliaia di spettridi massa conservati in opportune banche dati consente molto spesso diidentificare direttamente un composto incognito:

Selective Ion Monitoring (SIM)

Quando si è interessati alla ricerca di un particolare analita (o di un lororistretto numero) all’interno di una miscela sottoposta a separazione GC-MS è possibile impostare l’acquisizione MS soltanto in un ristrettointervallo di rapporti m/z (di solito 10 unità al massimo), contenente quellodell’analita d’interesse, realizzando così un cromatogramma di tipo SIM.

Il cromatogramma GC-MS SIM verrà dunque costruito dal computerriportando in ordinata solo l’intensità degli ioni presenti nel piccolointervallo di rapporti m/z esplorato:

tempo / min

abbo

ndan

za

Composti isomerici/isobarici(o aventi un frammento in comune)

La modalità SIM è utilesoprattutto quando si vuolecercare un particolareanalita all’interno di miscelecomplesse, che in modalitàTIC forniscono solitamentedecine (o anche centinaia)di picchi diversi: SIM

Poiché la scansione SIM èmolto più breve di quellaTIC è possibile ricostruireun picco cromatograficocon molti più punti rispettoal caso della TIC, dunque inmodo più fedele:

SIM TIC

E’ possibile costruire uncromatogramma simile adun tracciato SIM anche apartire da un’acquisizioneTIC, imponendo alcomputer di estrarre daglispettri MS totali soltantol’intensità relativa allo ionecon il rapporto m/zdesiderato.

Il tracciato ottenuto vienedefinito Cromatogramma diCorrente Ionica Estratta(eXtracted Ion Current,XIC, talvolta indicatoanche con l’acronimo EIC):

TIC

XIC

XIC

XIC

Accoppiamento HPLC-MS

Si è reso necessario sviluppare interfacce in grado di trasferire in fasegassosa (aerosol) la fase mobile HPLC e gli analiti in essa disciolti e,successivamente, trasferire parte di tale fase gassosa, arricchita inanalita, all’interno dello spettrometro di massa.

HPLC-MS: la “strana coppia”

L’HPLC è adatta all’analisi di analiti troppo poco volatili per essereseparati in gas-cromatografia mentre la spettrometria di massa èapplicabile solo ad analiti volatili

I flussi di liquido tipicamente impiegati in HPLC (1 mL/min), sevaporizzati, corrispondono a flussi di gas dell’ordine di 1 L/min,assolutamente non gestibili dai sistemi da vuoto degli spettrometri dimassa.

Interfaccia Particle Beam (PB)

Anche se non è storicamente la prima sviluppata, l’interfaccia PB,introdotta nel 1984, è la prima che abbia dimostrato una discretaapplicabilità pratica in HPLC-MS.

L’eluente proveniente dalla colonna HPLC viene trasformato in aerosolall’interno di un nebulizzatore, l’aerosol viene desolvatato in una camerariscaldata e le molecole di analita in esso presenti vengono selezionate daun sistema di skimmer per l’ingresso nello spettrometro di massa.

Principio dello skimmer

Le particelle di analita (arancione)liberate nella camera didesolvatazione tenderanno,essendo di solito più grandi (equindi più pesanti), a mantenere latraiettoria rettilinea che collegal’orifizio del nebulizzatore all’assedegli skimmer.

Vantaggi e svantaggi dell’interfaccia PB

Tipicamente è possibile ottenere spettri MS di tipo EI o CI, ricchi diinformazioni sulla struttura molecolare

E’ compatibile con flussi di fase mobile relativamente elevati (0.1-0.5mL/min)

La sensibilità è bassa, perché parte dell’analita viene inevitabilmentepersa attraverso gli skimmer, specialmente se è leggero

Non è compatibile con l’uso di tamponi non volatili

Può indurre degradazione termica negli analiti

skimmer 1

skimmer 2

MS

Interfaccia a Ionizzazione Elettrospray (ESI)

E’ attualmente l’interfaccia di gran lunga più usata in HPLC-MS (uno deisuoi inventori, John B. Fenn, è stato insignito del Premio Nobel per laChimica nel 2002).

La fase mobile proveniente dalla colonna HPLC viene introdotta in uncapillare o ago metallico posto ad un’elevata differenza di potenziale(alcuni kV) rispetto ad uno schermo provvisto di un foro centrale, che fada ingresso allo spettrometro di massa.

In ESI l’analita è di solito già presente come ione (positivo o negativo) nellafase mobile HPLC, grazie all’azione di acidi/basi.

Nel caso sia carico positivamente il suo controione (negativo) si scarica sullepareti del capillare di spray, mentre l’accumulo di cariche positive faassumere alla soluzione in uscita una caratteristica forma a cono (cono diTaylor), dovuta alla repulsione elettrostatica fra loro.

Quando la repulsione vince la coesione garantita dalla tensione superficialedella fase mobile dal vertice del cono di Taylor si staccano prima filamenti diliquido e poi, da questi, gocce cariche di dimensioni relativamente grandi.

Il processo che porta alla formazione di singoli ioni dell’analita,eventualmente solvatati, a partire dalle gocce può avvenire secondo duemeccanismi:

Fissione coulombiana

A B C

A. Le gocce più grandi rimpicciolisconoper evaporazione del solvente

B. La concentrazione delle carichepositive in un volume inferiore faaumentare la repulsione fino asuperare la tensione superficiale: lagoccia esplode in gocce più piccole

C. Il processo prosegue a catena fino adarrivare al singolo ione, che puòessere dotato di più cariche positive[M + nH]n+.

qRY carica-limiteε0 permittività del vuotoγ tensione superficiale

del solventeR raggio della goccia

Limite di Rayleigh

Evaporazione ionica (Modello di Iribarne-Thompson)

Rispetto al meccanismo precedente, in questo caso uno ione può essereespulso dalla superficie di una goccia piccola prima che questa si riducaulteriormente (C’), a causa della repulsione elettrostatica da parte degliioni ad esso adiacenti.

I due meccanismi descritti si verificano spesso in modo complementare,sebbene l’evaporazione ionica sia favorita nel caso di analiti leggeri;entrambi implicano comunque un livello molto basso di frammentazione.

L’ESI è una tecnica di ionizzazione “soft”: negli spettri ESI-MS lo ioneprincipale è nella quasi totalità dei casi lo ione molecolaremono(de)protonato o multi(de)protonato, detto quindi “ione quasi-molecolare”.

A B C’

Assistenza pneumatica nel processo ESI

Nella maggior parte delle interfacce ESI un flusso di gas inerte (azoto)principale (nebulising) ed eventualmente uno ausiliario (drying) vengonoimpiegati per facilitare l’evaporazione del solvente dalle goccioline,nonché per direzionare l’aerosol verso il foro d’ingresso dellospettrometro di massa.

Inizialmente l’interfaccia ESI assistita pneumaticamente fu definita Ion-Spray, tuttavia questo termine è ormai in disuso.

Un esempio di spettrometro HPLC-ESI-MS

HPLC

infusione consiringa

interfacciaESI ottapoli

trappolaionica

rivelatore

sensoreper ilvuoto

Esempi di applicazioni particolari dell’ESI-MS

Spettro ESI-MS di un peptide:

si noti la presenza sia delloione molecolare monoprotonato(rapporto m/z = (M+1)/1 =773.0) sia di quello bi-protonato, con rapporto m/z =(M+2)/2 = 387.0 (si noti che infigura spicca nel patternl’isotopologo M+1, il cuirapporto m/z è pari a 387.5)

Spettro ESI-MS di unaproteina:

si nota una distribuzione di ionidi carica via via crescente (equindi rapporto m/zdecrescente)

Un esempio speciale dell’effetto del pH sugli spettri ESI-MS: spettrodella mioglobina di cuore di cavallo

In condizioni di elevata acidità (pH 2) la molecola della mioglobina,normalmente “raggomitolata” intorno al gruppo eme, si apre, venendoprotonata in modo esteso, per cui i rapporti m/z sono bassi (z alto) esi nota anche il picco del gruppo eme.

A pH neutro la molecola rimane nella conformazione originaria per cuisolo poche cariche positive possono essere introdotte, inoltre l’emenon viene liberato (il suo picco è assente nello spettro).

Interfaccia per la Ionizzazione Chimica a Pressione Atmosferica (APCI)

Il capillare dell’ESI è sostituito da un nebulizzatore riscaldato. Laionizzazione dell’analita (M) avviene in questo caso per cessione (o cattura)di protoni da parte di uno ione reagente (XH+) generato dalla scarica acorona creata all’estremità di un ago mantenuto ad alta tensione (positiva onegativa a seconda del segno degli ioni che si vogliono generare).

+ 3 - 6 kV

350-500 °C

H2O+., O2+., N2

+. (ioni primari, tempo di vita: 1 µs)

Formazione degli ioni reagenti nella modalità APCI-positiva

H2O, O2, N2 (aria)

e-

ago

M + H3O+ [M+ H]+ + H2O

H2O+. + H2O H3O+ + OH.

N2+. + H2O N2 + H2O+.

O2+. + H2O O2 + H2O+.

ione reagente, tempo di vita 500 µs

Formazione degli ioni reagenti nella modalità APCI-negativa

O2 (aria) (ioni primari, tempo di vita: 1 µs) e-

O2- , O-

ago

OH- + M [M-H]- + H2O

HCO3- + M [M-H]- + H2CO3

HO2 + OH-O2- + H2O

O- + H2O OH + OH-

OH + HCO3-O- + CO2 + H2O

ioni reagenti

Confronto fra ESI e APCI

ESI

è adatta ad analiti polari/moltopolari, che subisconoprotonazione/deprotonazionegià nella fase mobile;

è compatibile con l’HPLC diripartizione in fase inversa manon diretta;

tollera flussi fino a 0.2-0.3mL/min;

ha un limite di rapporti m/zesplorabili piuttosto elevato,fino a 100000 (compatibilmentecon l’analizzatore impiegato)

APCI

è adatta ad analitimediamente/poco polari, la cuiprotonazione/deprotonazioneavviene sopratutto in fase gassosa;

è compatibile con l’HPLC diripartizione in fase diretta e,moderatamente, con quella in faseinversa;

tollera flussi fino a 1-2 mL/min;

ha un limite relativamente basso dirapporti m/z esplorabili (fino a1000)

APCI

ESI

PB

GC-MS

Confronto fra i campi di applicabilità delle diverse tecniche di cromatografia-spettrometria di massa

Modalità di analisi in HPLC-MS

Le modalità TIC e SIM descritte per la tecnica GC-MS possono essererealizzate in modo del tutto analogo in HPLC-MS.

Tuttavia, gli spettri HPLC-MS forniscono generalmente un numero moltoinferiore di informazioni sulla struttura (e quindi sull’identità) degli analiti,essendo la frammentazione in sorgente (ESI o APCI) pressoché assente.

Si accoppiano al cromatografo liquido spettrometri di massa tandem(MS/MS) o sequenziale (MSn).

MS/MS - TIC

SRM

CRM

MS/MS - TIC

Si registra uno spettro MS in modalità TIC, evidenziando i pesimolecolari degli analiti eluiti sotto i vari picchi del cromatogramma:

C:\Ilario\...\DatiLCQ\stracchino2201 13/10/2003 17.38.22

RT: 0,00 - 45,66

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

38,83

38,89

36,96

38,59

39,13

4,86 36,6834,87 39,8333,40 40,8829,84 31,83 43,71 45,3127,8424,84 25,369,011,40 23,7218,024,09 9,475,24 11,902,34 7,23 16,3815,61 20,8512,81 19,63

NL:2,44E6Base Peak F: + p ESI Full ms [ 50,00-2000,00] M S stracchino2201

stracchino2201#1055-1062 RT: 36,82-37,06 AV: 8 NL: 5,63E5F: + p ESI Full ms [ 50,00-2000,00]

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000m/z

0

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

819,3

1570,1

1344,5688,5 1237,7470,1 541,1 1668,91383,3841,5342,1 1818,5 1979,9733,3229,2 948,3 1008,5 1192,2189,3

Cromatogramma TIC

Spettro MS

si effettua una nuova corsa cromatografica impostando l’isolamentodi uno degli ioni d’interesse (ad esempio in trappola ionica) e la suasuccessiva frammentazione: il cromatogramma viene ricostruito dallacorrente ionica totale relativa agli spettri MS/MS acquisiti:

L’informazione sui frammenti osservati negli spettri MS/MS puòconsentire di fare ipotesi sulla struttura dell’analita d’interesse (esistonodelle banche dati anche per gli spettri ESI-MS/MS, sebbene più limitatedi quelle relative agli spettri EI-MS).

RT: 0,00 - 47,65

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46

Time (min)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

36,96

stracchino22MSMS01 # 1124-1177 RT: 36,10-37,42 AV: 5 NL: 1,96E3F: + p ESI Full ms2 819,00@30,00 [ 225,00-834,00]

250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800m/z

0

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

744,7

635,1478,1 775,5719,2

442,8341,3 686,3783,1670,1 799,3459,1 754,3276,3

Cromatogramma MS/MS-TIC

Spettro MS/MS, ione m/z 819.3

819.3

Confronto fra i cromatogrammiSIM ed SRM ottenuti per unestratto di latte contaminatodalla micotossina nota comeacido ciclopiazonico (CPA):

180 è la massa del frammentoevidenziato in figura.

SRM (Selective Reaction Monitoring)

In questo caso si parte già dall’informazione sulla frammentazione di unparticolare ione. L’acquisizione è di tipo MS/MS ma viene limitata all’intervallodi rapporti m/z che contiene uno specifico frammento di quello ione.

NH

NNO

OOHN

O

OO-

SIM su m/z 335

SRM335 > 180

CRM (ConsecutiveReactionMonitoring)

E’ una modalitàanaloga all’SRM maottenuta conun’acquisizione MSdi tipo sequenziale(MSn, con n > 2),utile quando laSRM non èsufficiente, comenel caso dellamicotossina notacome ocratossinaA (OTA).

La modalità SRM può consentire anche di visualizzare in modo separatospecie isomeriche parzialmente co-eluenti purché i corrispondenti spettriMS/MS differiscano per almeno un frammento.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 190

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

12,401,66

13,80

9,12

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

3,36

18,215,25 12,385,00

11,659,19 15,91

9,847,384,431.66

Rel

ativ

e Ab

unda

nce

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Modalità SRM404 > 358

Modalità CRM404 > 358 > 341

Cll

O

O

H

C H 3

H H

O

N H 2

OHO O H

OTA

tempo di ritenzione / min

Accoppiamento fra Plasma Induttivamente Accoppiato e Spettrometria di Massa (ICP-MS)

Sviluppata alla fine degli anni ’80, l’ICP-MS è attualmente la tecnica piùsensibile esistente per l’analisi elementare in ultra-tracce (concentrazioniinferiori alle ppt, parti per trilione).

Gli ioni generati a partiredal campione nella torciaICP vengono trasmessiattraverso un’interfacciaopportuna all’interno di unospettrometro di massa (infigura dotato di unanalizzatore a quadrupolo).

Interfaccia fra ICP e MS

L’interfaccia fra ICP ed MS deve consentire il passaggio dalla pressioneatmosferica, a cui lavora la torcia ICP, all’ultra-alto vuoto (10-6 torr) dellospettrometro di massa, attraverso uno stadio di vuoto intermedio:

Il cono di campionamento (sample) ha un orifizio più largo (diametro 0.8-1.2mm) di quello del cono skimmer (diametro 0.4-0.8 mm) ed il loroalloggiamento è raffreddato da una serpentina ad acqua.

Dopo aver attraversato anche il cono skimmer gli ioni derivanti dall’ICPvengono attratti da una serie di lenti elettrostatiche all’interno dellospettrometro di massa e guidati da altre lenti all’ingresso dell’analizzatore aquadrupolo.

Quest’ultimo si trova di solito fuori asse rispetto agli skimmer, in modo cheparticelle neutre e fotoni provenienti dall’ICP (non deviabili con campielettrici) non entrino nell’analizzatore.

interfaccialenti elettrostatiche multiple fotoni e

particelle neutre

quadrupolo

lenti ioniche fascio ionico collimato deviazione del fascio ionico all’interno dell’analizzatore

Al posto del quadrupolo si puòutilizzare un analizzatore atempo di volo, aumentando cosìl’intervallo di rapporti m/zesplorabile, oppure unanalizzatore a doppiafocalizzazione, che ha unarisoluzione molto maggiore.

Il costo di un ICP-MS conanalizzatore di massa a doppiafocalizzazione è però moltoelevato (circa un milione dieuro).

Esempi di spettri ICP-MS

Gli spettri ICP-MSevidenziano chiaramentei rapporti isotopicielementari per gli ionimonoatomici.

Rispetto ad uno spettro ICP-OES l’interferenza dovuta all’argon è decisamente inferiore.

La tecnica ICP-MS è particolarmente sensibile nei confronti degli elementidella serie f della Tavola Periodica, con intervalli di linearità comprendenti 4-5ordini di grandezza.

1 ng/L = 1 ppt

Limiti di rivelabilità in ICP-MS

In molti casi (soprattutto per gli elementi transuranici), la sensibilità puòaddirittura essere migliore di 0.01 ppt!

Esempi di applicazioni delle tecniche MS