Tecniche cromatografiche Principi teorici Tipi di cromatografia.
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Tecniche cromatografiche
Principi teorici Tipi di cromatografia
Metodi cromatografici
Coefficiente di distribuzione
Il principio su cui si basano tutte le tecniche cromatografiche è il
Coefficiente di distribuzione o partizione = Concentrazione nella fase A
Concentrazione nella fase B
= Kd
• descrive il modo in cui una sostanza si distribuisce tra due fasi immiscibili• dipende dalla temperatura
B
A
Coefficiente effettivo di distribuzione =quantità totale in A
quantità totale in B= Kd ·VA/VB
Separazione di due sostanze in cromatografia
Coefficiente di distribuzione Tutti i sistemi cromatografici hanno due fasi:
la fase stazionaria la fase mobile
solida o liquida liquida o gassosa,
che scorre attraverso la fase stazionaria
scelte in modo che i composti da separare abbiano differenti coefficienti di distribuzione
Concentrazione nella fase mobile
Concentrazione nella fase stazionaria Kd =
Equilibri tra fasi stazionarie e fasi mobili in cromatografia
fase stazionaria fase mobile
Cr. di assorbimento, solida liquidacr. ad interazione idrofobica
Cr. ad esclusione molecolare, fase liquida intrappolata o gel cromatografia all’interno di una struttura liquida
porosa
Gas cromatografia liquida gassosa
Cr. a scambio ionico scambiatori di cariche liquida (con elettroliti)
Cr. di affinita’ ligando immobilizzato liquida
Esempio di separazione cromatografica su colonna
TIPI DI CROMATOGRAFIA
Cromatografia su
colonna strato sottile carta
la fase stazionaria viene impaccata in
colonne di vetro o di metallo
la fase stazionaria ricopre sotto forma di strato sottile
piastre di vetro, plastica o di metallo
la fase stazionaria aderisce alle fibre di
cellulosa di un foglio di carta
Apparato per cromatografia su colonna
A valle della colonna:
rivelatore,
registratore,
collettore di frazioni
Teoria della cromatografia
Durante una separazione cromatografica avvengono due processi:
• Interazione dell’analita con le fasi stazionaria e mobile (meccanismi, di
adsorbimento, scambio ionico, ecc.)
• Diffusione dell’analita, che si oppone alla buona riuscita della separazione
tR : tempo di ritenzione (VR = tRx Fc)
tM : tempo morto (VM = tMx Fc)
tempo di ritenzione aggiustato: t’R = tR - tM
Fc : velocita’ di flusso
Fattore di capacità k'
Tempo relativo che occorre all’analita per eluire dalla colonna rispetto ad un analita non trattenuto
Fattore di capacita’Fattore di capacita’
tR - tM t’R
k’ = = tM tM
t’R MS VS
k’ = = = Kd x tM MM VM
MS = massa dell’analita nella fase stazionaria
MM = massa dell’analita nella fase mobile VS = volume della fase stazionaria
VM= volume della fase mobile
Selettivita’ o fattore di separazioneSelettivita’ o fattore di separazione
k’A KdA t’RA
= = = k’B KdB t’RB
Efficienza della colonna e risoluzione
Efficienza della colonnaEfficienza della colonna
Si puo’ pensare che colonna cromatografica consista di un numero di zone adiacenti in ognuna della quali c’e’ spazio sufficiente perche’ un analita si equilibri completamente tra le due fasi piatto teoricopiatto teorico
2
Altezza del piatto H = —— x
Numero di piatti teorici N = L/H = Lx/ 2
16 L2 tR 2
Se x = L N = ——— = 16 —— w2 w
I valori di N e di H per una colonna sono espressi in funzione di un determinato analita
è la deviazione standard della banda gaussianax è la distanza percorsa dall’analitaall’interno della colonna
w è la larghezza della base del picco= 4
L’efficienza della colonna può esere misurata
dal numero di piatti teorici o da H
Più piccola è l’altezza del piatto teorico(più grande è il valore di N) più stretto è il picco dell’analita
Esempio : Esempio : un analita eluisce da una colonna sotto forma di un picco Gaussiano con un tempo di ritenzione di 7 min 45 s e una larghezza della base del picco di 30 s.Calcolate: (i) il numero di piatti teorici della colonna; (ii) l’altezza dei piatti se la colonna e’ lunga 7 cm
(i) N = 16 x (465/30)^2, quindi N = 3844
(ii) H = L/N = 7.5 x 10^4 / 3844, quindi H = 19.5 m
Risoluzione: capacità di separare un picco da un altro
2 (tRA tRB) tR
RS = —————— = —— se RS = 1 overlap = 2.3%
wA wB wav se RS = 1.5 overlap = 0.2%
N 1 k’2
RS = —— ——— ———
4 1 + k’av
Fattori che determinano la risoluzione di una colonna cromatograficaFattori che determinano la risoluzione di una colonna cromatografica
wav
valore medio delle larghezze
di base
Cromatografia di adsorbimento
Si basa sul fatto che alcuni materiali solidi hanno la capacita’ di trattenere le molecole alla loro superficie - sono coinvolte forze di interazione deboli, quali forze di Van der Waals e legami a idrogeno.
I diversi analiti si ripartiscono tra fase mobile e adsorbente in modo diverso a seconda delle relative forze di interazione. Queste dipendono dalla natura chimica dell’ adsorbente, della fase mobile e degli analiti.
La forza di legame di un analita dipende da specifici gruppi funzionali (OH e aromatici aumentano le interazioni)
Un tipico adsorbente e’ la silice, che presenta gruppi silanolo (Si-OH). Altri adsorbenti comunemente usati sono allumina e carbone.
La cromatografia di adsorbimento puo’ essere condotta sia su strato sottile che su colonna (FPLC e HPLC). E’ il metodo piu’ comunemente usato per la separazione di composti non ionici, insolubili in acqua, quali trigliceridi, PTH-aminoacidi, vitamine, vari farmaci.
Cromatografia di adsorbimento: idrossiapatite
Hydroxyapatite
Hydroxyapatite (Ca5(PO4)3OH)2 is a form of calcium phosphate which can be used for the separation and purification of proteins, enzymes, nucleic acids, viruses, and other macromolecules. Hydroxyapatite chromatography can be utilized at any stage ina process from initial capture to final polishing. Hydroxyapatite has unique separation properties and unparalleled selectivity and resolution. It often separates proteins shown to be homogeneous by other chromatographic and electrophoretic techniques.
Applications of hydroxyapatite chromatography include separation of monoclonal and polyclonal antibodies of different classes, antibodies which differ in light chain composition, antibody fragments, isozymes, supercoiled DNA from linear duplexes, and single-stranded from double-stranded DNA.
Il meccanismo di adsorbimento non e’ ben chiaro, si pensa coinvolga ioni Ca e PO4 piu’ interazioni elettrostatiche e dipolo-dipolo
Cromatografia di adsorbimento:Cromatografia di adsorbimento:cromatografia per interazione idrofobica (HIC)cromatografia per interazione idrofobica (HIC)
E’ un tipo di cromatografia sviluppato per la purificazione di proteine, le separa sulla base della loro idrofobicita’ di superficie.
I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni idrofobiche, sottraendo le molecole d’ acqua ordinate le proteine tendono cosi’ ad interagire fra loro (“salting out”). Nella HIC queste regioni cosi’ esposte tendono ad interagire con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici.
E’ una cromatografia che e’ vantaggioso applicare ad esempio dopo il frazionamento con ammonio solfato.
L’ eluizione puo’ essere fatta con forza ionica decrescente oppure per ‘spiazzamento’ con detergenti non ionici come ad es. Tween 20, Triton X-100.
Potenziali svantaggi: - in alcuni casi le condizioni di eluizione possono provocare denaturazione - non e’ predicibile, puo’ applicarsi bene ad alcune proteine ma non ad altre
Cromatografia per interazione idrofobica (HIC)Cromatografia per interazione idrofobica (HIC)
Cromatografia di partizione
Usa fasi stazionarie e fasi mobili liquide
cromatografia liquido-liquido
cellulosa legano fino al amido 50% di acqua silice
cromatografia liquida a fase legata
In questo caso la maggior parte delle fasi legate utilizza come matrice la silice, derivatizzata con organoclorosilani:
cr. liquida in fase normale cr. liquida in fase inversafase stazionaria ad es. fase stazionaria e’ apolarealchilammina butile, ottile, ottadecilefase mobile e’ di solito fase mobile puo’ essere unun solvente organico tampone acquoso, metanolo,in gradiente acetonitrile. tetraidrofurano, o miscele ordine di eluizione: ordine di eluizione polarita’ crescente polarita’ decrescente
Cromatografia in fase inversafase stazionaria: apolare (introduzione di catene idrofobiche) (C4, C8, C18...) sulla silice mediante derivati alchilici del tricloroesano:
fase mobile: relativamente polare (acqua o tamponi acquosi, metanolo, acetonitrile, miscele di questi solventi). Principio: gli analiti instaurano interazioni apolari con la fase stazionaria (ricettiva ma passiva) e la separazione cromatografica avviene principalmente sulla base delle caratteristiche della fase mobile. Gli analiti polari eluiscono per primi e quelli non polari per ultimiTeoria solvofobica: spiega la cromatografia in fase inversa in termini di bilanciamenti tra
variazioni di energia libera ed di entropia, interazioni acqua-acqua instaurate quando l’analita si lega alla fase stazionaria
Cromatografia in fase inversa per accoppiamento ionico
La separazione cromatografica di composti polari, come aminoacidi, nucleotidi, ecc. può essere migliorata con due tipi di approccio:• Soppressione ionica (variando il pH si neutralizzano composti acidi o basici)• Accoppiamento ionico (si aggiunge un contro-ione con carica opposta a quello da separare)
RCOO- + R4N+ [RCOO-N+R4]
RN+H3 + RSO3- [RN+H3
-SO3R]
Es. tetrabutilammonio
Es. sodio eptansolfonato
Le coppie ioniche diventano più lipofiliche e sono meglio trattenute dalla fase stazionaria
o
Si produce una superficie attiva di scambio ionico
Cromatografia chirale
Gli enantiomeri hanno proprieta’ fisiche e chimiche identiche ma vengono riconosciuti in modo differente dai sistemi biologici.
Fino a 15-20 anni fa era impossibile risolvere miscele di enantiomeri, il che costituiva un impedimento notevole allo sviluppo dell’ industria farmaceutica e dell’ uso clinico dei farmaci.
1) trasformazione degli enantiomeri in diastereoisomeri con un agente derivatizzante chirale:
(R + S) + R’ RR’ + SR’ miscela di agente miscela dei enantiomeri derivatizzante diastereoisomeri 2) fase mobile chirale
3) fase stazionaria chirale meccanismo probabilmente interazione a 3 punti tra fase stazionaria ed enantiomero.
Cromatografia chirale
• Fasi stazionarie di Pirkle : derivati nitrobenzoici di aminoacidi come la fenilglicina che vengono legati alla silice. • Ciclodestrine (oligosaccaridi ciclici con struttura a tronco di cono aperta).
• Proteine immobilizzate - si sono rivelate particolarmente adatte per molte applicazioni la AGP (acidic 1-glycoprotein) e la HSA (human serum albumin). Entrambe si trovano nel plasma dove legano i farmaci. La 1-glicoproteina acida tollera concentrazioni di solventi organici relativamente alte, pH alti e bassi, e alte temperature.
Il meccanismo con cui operano e’ ancora in gran parte sconosciuto.
Cromatografia a scambio ionicoSi basa sull’attrazione tra particelle di carica opposta.
(Ion Exchange Chromatography)
pI
4 6 8 10
pH
Ca
rica
ne
tta
de
lla p
rote
ina
++
+
- --
-
Sulla base della carica netta (+ o
-)
nelle fasi precoci di purificazione, ma non solo
La risoluzione dipende: - dalla “capacità della resina (porosità) - dal pH dell’eluente - dal pI delle proteine da separare
Requisiti strumentali da semplici asofisticati (per caduta, FPLC e sueevoluzioni)
Equilibri di scambio ionico
RSO3-…Na+ + +NH3R’ RSO3
-…+NH3R’ + Na+
Scambiatore cationico
Scambiatore anionico
Scambiatore Contro-ione Molecolacarica da scambiare
Ione molecolarelegato
Ione scambiato
(R)4N+….Cl- + -OOCR’ (R)4N+…. -OOCR’ + Cl-
Principi della cromatografia a scambio ionico
Capacità totale di scambio =Numero di milliequivalenti di ioni scambiabili disponibili per grammo di resina secca
Effetto Donnan: repulsione tra le cariche dello stesso segno che si trovano all’interno della matrice, variazioni di pH diverse rispetto al volume vuoto
Cromatografia a scambio ionico (IEC),Cromatografia a scambio ionico (IEC),alcuni tipi di matrici e scambiatorialcuni tipi di matrici e scambiatori
Scambiatori forti =Totalmente ionizzati a tutti i valori di pH a cui si opera
Cromatografia a esclusione molecolare (permeazione)
La separazione delle molecole avviene in base alle loro dimensioni e alla loro forma
Setacci molecolari
Se l’analita è grandeè completamenteescluso (Kd=0) Se l’analita può accedereCompletamente ai pori del gel Kd=1
Vs= (Kd’-Kd”)Vi
Applicazioni della gel filtrazione
• Purificazione di proteine• Determinazione della massa molecolare relativa (logMr vs Ve)• Concentrazione di soluzioni• Dissalazione• Studi proteina-ligando
Cromatografia di affinitàK+1
K-1
M + L MLLigando legato alla matrice
Sfrutta interazionispecifiche,la separazione non avviene per differenza nelleproprietà fisiche delle macromolecole
Il braccio spaziatore tra ligando e matrice deve avere una lunghezza di 6-10 atomi di C. Alcuni bracci sono di natura idrofobica e altri di natura idrofila. Si usano 1,6-diaminoesano, acido 6-aminoesanoico e 1,4-bis(2,3-epossipropossi)butano
Matrici per cr. affinità
deve contenere gruppi reattivi numerosi e adatti a legare covalentemente il ligando e deve risultare stabile nelle condizioni in cui avviene tale attacco;
deve essere stabile nelle condizioni di interazione della macromolecola e nella successiva eluizione;
non deve interagire, se non debolmente, con altre macromolecole, per evitare un adsorbimento aspecifico;
deve possedere buone capacità di flusso.
In pratica si usano particelle uniformi, sferiche e rigide, solitamente costituite da derivati del destrano (Sephacryl S), dell'agarosio (Sepharose 4B e 6B, Bio-Gel A), gel di poliacrilammide (Bio-Gel P) e cellulosa.
Applicazioni della cromatografia di affinità
• Cromatografia con lectine: glicoproteine
• Cromatografia di immunoaffinità: i ligandi sono anticorpi monoclonali
• Cromatografia con chelati di metalli: Cu++, Zn++, Hg++, Cd++,Co++, Ni++, Mn++
la reazione di legame è con i gruppi imidazolici di istidine, tiolici di cisteine,
indolici di triptofani
• Cromatografia con ligandi colorati: coloranti triazinici, Cibacron Blue