CORSO AV-AVANZATOESPERIMENTI CON GRADIENTIESPERIMENTI CON GRADIENTI

Corrado Dallacosta

Bruker BioSpin s.r.l.

Corrado.dallacosta@bruker.it

Agenda

• Concetti preliminari: coerenza, ordine di coerenza, CPT, ecc.

• I gradienti in NMR

• Gradienti di spoiling

2

• Selezione di coerenze mediante gradient

• Esperimenti omo- e etero-correlati con gradienti (COSY, COSY

DQF, HMQC, HSQC, HMBC) …

Coerenza

Per un campione macroscopico all’equilibrio all’interno di un campo magnetico statico B0, le componenti x e y della magnetizzazione sono nulle.

Un impulso di radiofrequenza applicato con le opportune modalità (di potenza, durata, orientazione, ecc.) genera magnetizzazione potenza, durata, orientazione, ecc.) genera magnetizzazione trasversale nel piano xy.

In quantomeccanica la presenza di magnetizzazione trasversale è considerata il prodotto di una certa coerenza presente nel campione

Ordine di coerenza

L’ordine di coerenza p, riferito ad una certa magnetizzazione (coerenza), dipende da ciò che accade ad essa quando è sottoposta ad una rotazione di un angolo φ attorno all’asse z.

Se, a seguito della rotazione, la coerenza acquisisce una fase (-p x φ) , la coerenza è detta di ordine p.

L’ordine di coerenza può essere positivo o negativo e zero.

p = ± 1 coerenza di ord. 1 coerenza a singolo quanto

p = ± 2 coerenza di ord. 2 coerenza a doppio quanto

p = 0 coerenza a zero quanto magnetizzazione z

)exp(ˆˆ )()()( ϕρρ ϕip

pzrotp −× →

Cammini di/ trasferimenti di coerenza

Un esperimento NMR passa attraverso precisi step:

1) generazione di coerenza

2) trasferimento di coerenza (attraverso legami, spazio, ecc..)

3) selezione delle varie coerenze (cicli di fase o gradienti)

4) Acquisizione

Un sistema di n spin ha a disposizione 2n+1 livelli di coerenza: ad Un sistema di n spin ha a disposizione 2n+1 livelli di coerenza: ad esempio, un sistema di tre spin (AMX) potrà avere ordine pmax=3 e generare 7 livelli di coerenza con ordine -3, -2, …, 0, …+3

Gli impulsi di radiofrequenza possono trasferire la coerenza da un livello ad un altro. Una sequenza di impulsi può generare diversi cammini di coerenza, ma solo alcuni daranno luogo ad un segnale osservabile.

Solo la coerenza a singolo quanto è osservabile (per convenzione p =-1). In un esperimento NMR solo i cammini che generano un livello di coerenza finale p=-1 sono utili al fine della rilevazione del segnale.

Cammini di coerenza

In ogni esperimento NMR i cammini di coerenza partono da p=0 e finiscono a p=-1

Il primo impulso inviato alla magnetizzazione all’equilibrio (lungo z) genera solamente coerenza a singolo quanto (p=±1)

+2+10-1-2

Therm eq.

90°

Acq.

Cammini di coerenza

Un impulso di 90°±kπ applicato a qualsiasi ordine di coerenza i produce tutti i possibili ordini di coerenza compresi fra –p e +p

+2+10-1-2

90°

Da un ordine di coerenza i otteniamo p, (p-1), …, 0, …, -(p-1), -p con –p ≤ i ≤ +p

Un impulso di 180°±kπ applicato a qualsiasi ordine di coerenza iproduce solamente coerenza -i

+2+10-1-2

180°

Cos’è un gradiente?

Gradiente di campo

magnetico statico (B0) è un

campo magnetico aggiuntivo

8

campo magnetico aggiuntivo

al campo principale la cui

intensità varia nello spazio

Cos’è un gradiente?

L’applicazione del gradiente rende la velocità di precessione dipendente

dalla posizione del nucleo.

In pratica si introduce una marcatura spaziale.

9

( ) ( ) ( )tzGitBBitzGBBiBti zcszcs eeMeMeM∆+∆++ == γγγγ 00

000

Cos’è un gradiente?

10

( )∫∆

∆+

z

tzGitBBi zcs eeMγγ 0

0

Il gradiente provoca la perdita di fase della magnetizzazione, che

può essere rifocalizzata da un secondo gradiente.

Cos’è un gradiente?

11

x

y

x

y

G1 G2

y

x x

y

τ

Cos’è un gradiente?

Con il termine Pulses Field Gradients (PFG) si intende la variazione

lineare del campo magnetico (B0) lungo una data direzione:

PFG = G(r) = δB(r)/δr

Solitamente si applica un gradiente lungo la sola direzione z; questo

significa che spin posti a diverse coordinate z risentono di campi

magnetici diversi e quindi precedono a frequenze di Larmor diverse:

B(z) = B + z Gz

12

B(z) = B0 + z Gz

ω(z) = γ B(z) = γ [B0 + z Gz ].

Quindi le fasi delle componenti della magnetizzazione dopo un PFG di

durata ττττ dipenderanno a loro volta dalla posizione z degli spin:

φ(z) = ωωωω(z) τ = γγγγ B(z) ττττ = γγγγ [B0 + z Gz ] ττττ = γγγγ B0 ττττ + γγγγ z Gz ττττ

φG(z) = γγγγ z Gz ττττ

Cos’è un gradiente?

Questa espressione vale per magnetizzazione trasversale, cioè coerenza

singolo quantica. In generale, per coerenza di ordine p, essendo la

velocità di precessione proporzionale all’ordine di coerenza p, avremo:

φG(z) = g z Gz τ

13

φG(z) = γ z Gz τ p

HW Gradienti

La bobina di gradiente è immersa in un cilindro ceramico che fa da

supporto meccanico e da dissipatore

14

Il generatore di corrente è una scheda del BSMS, che eroga fino a

10A. Il gradiente totale risultante è dell’ordine dei 50G/cm

HW Gradienti

15

PROBE

16

Gk

p16 d16

S

GRANDEZZE DA IMPOSTARE

17

- Intensità del gradiente (Gk). E’ il valore massimo che

assume l’impulso di gradiente

- Durata del gradiente: p16. In alta risoluzione si usa

1ms – 1.5ms

- Gradient stabilization delay: d16=100µsec

- Forma del gradiente (S). Di solito sine.100

Sintassi gradienti: Avance GP

1 ze

2 d1

3 p1 ph1

d0

50u UNBLKGRAD

p16:gp1

UNBLKGRAD: unblanking del amplificatore dei gradienti

+ ignora il lock

(UNBLKGRAMP: blanking del amplificatore dei gradienti )

Nella sintassi GP i gradienti sono trattati come impulsi

18

p16:gp1

d16

p0 ph2

d13

p16:gp2

d16

4u BLKGRAD

go=2 ph31

d1 wr #0 if #0 id0 zd

lo to 3 times td1

exit

(UNBLKGRAMP: blanking del amplificatore dei gradienti )

BLKGRAD: blanking del amplificatore dei gradienti

+ riattiva l’azione del lock

(BLKGRAMP: blanking del amplificatore dei gradienti )

Nella cartella dei parametri di acquisizione, i parametri dei

gradienti sono immediati

Sintassi gradienti: Avance GP

19

In spettroscopia i gradienti di campo hanno varie funzioni:

1. Imaging (es. Gradient Shimming)

2. Distruggere magnetizzazioni non desiderate (spoil gradient, es. Noesy)

A cosa servono i gradienti

20

3. Sopprimere segnali indesiderati (es. soppressione del solvente)

4. Selezionare dei cammini di coerenza

5. Misurare coefficienti di diffusione

Imaging

Posso acquisire un FID con il gradiente accesso:

1H

21

L’acquisizione in presenza di gradiente fa si che la velocità di

precessione (e quindi la frequenza a cui viene acquisito il

segnale) dipendano dalla posizione: imaging.

G

Gradshim

Confronto tra

22

-30-20-1050 40 30 20 10 0 ppm

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

Confronto tra

spettro zg e

spettro “tipo

gradshim”

Gradienti di spoil

Per gradiente di spoiling si intende un gradiente che viene applicato

per DEFOCALIZZARE L’ORDINE DI COERENZA NON DESIDERATO.

Questi gradienti vengono principalmente applicati quando è attesa

solo coerenza di ordine 0 sulla quale il gradiente non ha alcun

effetto:

φφφφG(z) = γγγγ z Gz τ τ τ τ p = 0

23

Per funzionare correttamente questi impulsi:

• Sono impulsi singoli

• Devono essere sufficientemente intensi

• Non devono interferire con gli altri gradienti presenti nella sequenza

Gradienti di spoil

Effetto del gradiente durante il RELAXATION DELAY.

RD

π/2

RF

24

G

p 0

+1

- 1

+2

- 2

Gradienti di spoil

Effetto del gradiente durante il MIXING TIME in esperimento NOESY.

RD

π/2

RF

π/2 π/2

t1 τm

25

G

p 0

+1

- 1

+2

- 2

Noesy senza spoil gradient: d1=1s

ppm

3

2

1

Current Data ParametersNAME prepcorsoEXPNO 4PROCNO 1

F2 - Acquisition ParametersDate_ 20050510

Time 13.34INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBI 1H-PULPROG noesyph

TD 2048SOLVENT C6D6NS 8

DS 16SWH 4807.692 HzFIDRES 2.347506 HzAQ 0.2130420 sec

RG 32DW 104.000 usecDE 6.00 usec

TE 300.0 Kd0 0.00009394 sec

26

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

9

8

7

6

5

4

3 d0 0.00009394 secD1 1.00000000 secD8 0.40000001 sec

IN0 0.00020800 secMCREST 0.00000000 secMCWRK 0.50000000 sec

ST1CNT 128

======== CHANNEL f1 ========NUC1 1H

P1 7.90 usecPL1 6.00 dBSFO1 400.1318800 MHz

F1 - Acquisition parametersND0 1TD 256

SFO1 400.1319 MHzFIDRES 18.780048 HzSW 12.015 ppm

FnMODE States-TPPI

F2 - Processing parametersSI 2048

SF 400.1299650 MHzWDW QSINESSB 2LB 0.00 Hz

GB 0PC 1.00

F1 - Processing parametersSI 1024MC2 States-TPPISF 400.1300000 MHz

WDW QSINESSB 2LB 0.00 Hz

GB 0

Noesy con spoil gradient: d1=1s

ppm

3

2

1

Current Data ParametersNAME prepcorsoEXPNO 5PROCNO 1

F2 - Acquisition ParametersDate_ 20050510Time 14.30INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBI 1H-PULPROG noesygpphTD 2048SOLVENT C6D6NS 8DS 16SWH 4807.692 HzFIDRES 2.347506 HzAQ 0.2130420 secRG 32DW 104.000 usecDE 6.00 usecTE 300.0 Kd0 0.00009394 secD1 1.00000000 secD8 0.40000001 secD16 0.00010000 secIN0 0.00020800 secMCREST 0.00000000 secMCWRK 0.50000000 secST1CNT 128TAU 0.19890000 sec

======== CHANNEL f1 ========

27

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

9

8

7

6

5

4======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 7.90 usecP2 15.80 usecPL1 6.00 dBSFO1 400.1318800 MHz

====== GRADIENT CHANNEL =====GPNAM1 sine.100GPNAM2 sine.100GPX1 0.00 %GPX2 0.00 %GPY1 0.00 %GPY2 0.00 %GPZ1 30.00 %GPZ2 -40.00 %P16 1000.00 usec

F1 - Acquisition parametersND0 1TD 256SFO1 400.1319 MHzFIDRES 18.780048 HzSW 12.015 ppmFnMODE States-TPPI

F2 - Processing parametersSI 2048SF 400.1299650 MHzWDW QSINESSB 2LB 0.00 HzGB 0PC 1.00

F1 - Processing parametersSI 1024MC2 States-TPPISF 400.1300000 MHzWDW QSINESSB 2LB 0.00 HzGB 0

Confronto tra i noesy

In rosa:

spettro con

spoil gradient

28

spoil gradient

In verde:

spettro senza

spoil gradient

Eliminazione picchi indesiderati

Si possono eliminare in modo molto efficiente segnali

indesiderati, come ad esempio quello del solvente.

1H

29

G

Il gradiente rifocalizza solo i segnali che hanno subito l’echo: gli altri

vengono ulteriormente defocalizzati.

In questo esperimento i gradienti lavorano in coppia.In questo esperimento i gradienti lavorano in coppia.

Excitation sculpting:

90% H2O saccorosio 2mM

spettro zgspettro zg

30

6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm

6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 ppm

spettro con spettro con soppressionesoppressione

HH22OO

Selezione di coerenze

Le COERENZE assieme alle popolazione dei singoli livelli energetici quantizzati

descrivono completamente un sistema di spin.

COERENZA si verifica quando piú spin si muovono all’unisono, con la stessa fase.

Per esempio:

• Dopo un ’impulso di 90°, la parte polarizzata degli spin si muove

all’unisono nel moto di precessione. E’ questo “moto coerente” che ci

permette di osservare la FID

31

permette di osservare la FID

• L’energia fra spin che si muovono all’unisono e spin defocalizzati è quasi

la stessa. In un caso (a) ho coerenza, nell’altro (b) no

(a) (b)

Selezione delle coerenze mediante PFG

Gli impulsi di RF consentono di cambiare il livello di coerenza.

La combinazione di impulsi e delay consente di creare diversi cammini di

coerenza. In genere la stessa sequenza consente di creare molti percorsi

di coerenza, anche se uno solo é quello desiderato in quanto porta ad

osservare ciò che interessa.

Uno specifico cammino di coerenza può essere selezionato utilizzando gli

impulsi di gradiente in alternativa ai cicli di fase. A tale scopo è

32

impulsi di gradiente in alternativa ai cicli di fase. A tale scopo è

necessario che sia verificata la seguente condizione:

γ = rapporto giromagnetico, dipende dal tipo di nucleo

p = ordine di coerenza

G τ = integrale del gradiente

Σi φi = Σ (γi pi Gi τi ) = 0

Selezione delle coerenze mediante PFG

Supponendo di applicare sempre gradienti di uguale durata τ la suddetta condizione

diventa:

Σi φi = τ Σi (γi pi Gi) = 0

Quindi per esperimenti ETERONUCLEARI deve essere verificata la condizione:

33

Quindi per esperimenti ETERONUCLEARI deve essere verificata la condizione:

Σi (γi pi Gi) = 0

e per esperimenti OMONUCLEARI deve essere verificata la condizione:

Σi (pi Gi) = 0

Selezione delle coerenze mediante PFG

G1 G2

τ1 τ2

p1p2

La coerenza acquisisce un defasamento in funzione di z a causa del primo gradiente –viene trasferita ad opera dell’impulso e subisce un ulteriore defasamento dal secondo gradiente. La fase acquisita dipende anche dal livello della coerenza. E’ possibile fare in modo che il primo defasamento sia di intensità uguale e contraria al primo – in questo modo la coerenza che percorre il cammino desiderato viene rifocalizzzata.

Effetto di G1 φ1(z) = -p1γG1zτ1 Effetto di G2 φ2(z) = -p2γG2zτ2

Se vogliamo rifocalizzare il percorso p1 p2 occorre che la dipendenza spaziale sia nulla per quel percorso, cioè deve verificarsi la condizione:

φtot(z) = -p1γG1zτ1-p2γG2zτ2= 0 ovvero

1

2

22

11

p

p

G

G−=

τ

τ

Volendo selezionare il percorso +2 -1 mediante gradienti della stessa durata, la condizione di rifocalizzazione diventa: G2=2G1

Selezione delle coerenze mediante PFG

Nel caso di sistemi eteronucleari la fase acquisita da I dipende da pI e γI mentre la fase di S dipende solo da pS e γS.

φφφφtot(z)=-(pIγγγγI + pSγγγγS)Gzt

Il primo gradiente quindi provoca:φ1(z)=-(-1γI + 1γS)G1zτ1

Il secondo provoca:φ2(z)=-(-1γI + 0γS)G2zτ2

I

S

G

+10-1

pI

+1

G1 G2

τ1 τ2

1)/(

1

22

11

−=

−=

ISIS

I

G

G

γγγγ

γ

τ

τ

φ2(z)=-(-1γI + 0γS)G2zτ2

Applicando la condizione di rifocalizzazione φφφφ1(z)+φφφφ2(z)=0 otteniamo:

+10-1

pS

Nel caso in cui I = 1H e S = 13C e assumendo (γS/γI)=1/4, otteniamo:

3

4

22

11 −=τ

τ

G

G

COSY con gradienti: cosygpqf

RD t1

π/2 π/2

RF

G

Percorso di coerenza G1 G2

?

Determinare il

rapporto G1:G2 che

consente di

selezionare il

percorso di coerenza

36

p 0

+1

-1

percorso di coerenza

indicato

ΦTOT= p1*G1 + p2*G2

ΦTOT= p1*G1 + p2*G2= 0ΦE= p1E*G1E + p2E*G2E= 0

ΦE= 1*G1E – 1 *G2E= 0

G1E - G2E= 0

G1E = G2E

1 ze2 d1

G1 G2

COSY con gradienti: cosygpqf

37

2 d13 p1 ph1d050u UNBLKGRADp16:gp1d16p0 ph2d13p16:gp2d164u BLKGRADgo=2 ph31d1 mc #0 to 2 F1QF(id0)

exit

G1 G2

;pl1 : f1 channel - power level for pulse (default)

;p0 : f1 channel - 20 to 90 degree high power pulse

;p1 : f1 channel - 90 degree high power pulse

;p16: homospoil/gradient pulse

;d0 : incremented delay (2D) [3 usec]

;d1 : relaxation delay; 1-5 * T1

;d13: short delay [4 usec]

;d16: delay for homospoil/gradient recovery

;in0: 1/(1 * SW) = 2 * DW

;nd0: 1

;NS: 1 * n

;DS: 16

COSY con gradienti: cosygpqf

38

;DS: 16

;td1: number of experiments

;FnMODE: QF

;use gradient ratio: gp 1 : gp 2

; 10 : 10

;for z-only gradients:

;gpz1: 10%

;gpz2: 10%

;use gradient files:

;gpnam1: SINE.100

;gpnam2: SINE.100

COSY QF con gradienti

COSY con gradienti – phase-sensitivecosyetgp

L’esperimento viene acquisito in modalità echo-antiecho e contiene le informazioni di fase nella dimensione indiretta. E’ quindi “fasabile”. E’ una modalità che ha il vantaggio di avere un gradiente durante t1 (perdendo informazioni sulla fase) mantenendo la “fasabilità”.

40

Phase-sensitive vs. magnitude

Phase-sens – FnMODE Echo/Anti-echo

41

Magnitude –FnMODE QF

Spesso all’esperimento COSY è preferibile la variante con filtro doppio quanto,

in quanto offre i seguenti vantaggi:

- I picchi diagonali sono in parte cancellati

- I segnali che non hanno accoppiamenti omonucleari (cioè i singoletti) sono

eliminati e questo è particolarmente vantaggioso in campioni in acqua.

COSYDQF

42

In generale fare l’esperimento in modalità phase sensitive comporta una

maggiore risoluzione rispetto all’esperimento magnitude in quanto le righe

sono più strette

RD t1

π/2

RF

G

π/2 π/2

?

Determinare i rapporti che

devono avere i 2 gradienti

indicati nello schema in

modo da poter effettuare

l’esperimento in modo phase

sensitive.

RD t1

π/2

RF

G

π/2 π/2

+1

+2

COSY DQF

43

sensitive.p 0

+1

- 1

- 2

ΦTOT= 0

ΦTOT= p1* G1 + p2* G2= 0

ΦTOT= 2 * G1 - 1 * G2= 0

2 * G1 = G2

COSY DQF

Tra gli esperimenti che hanno maggiormente giovato dell’introduzione dei

gradienti ci sono gli esperimenti di eterocorrelazione 1H-X.

Storicamente le prime eterocorrelate prevedevano l’acquisizione diretta del

nucleo X.

Il vantaggio principale è che non è necessario sopprimere il segnale dei 1H

Esperimenti correlazione inversa

45

Il vantaggio principale è che non è necessario sopprimere il segnale dei H

legati a nuclei non attivi all’NMR, per esempio nel caso di 13C l’99% della

magnetizzazione.

Più recentemente si sono introdotti esperimenti con acquisizione su 1H detti

esperimenti inversi.

Questi esperimenti sono HSQC, HMQC e HMBC.

Strategia esperimenti correlazione inversa

1. Si parte da magnetizzazione 1H

2. Si trasferisce la magnetizzazione 1H al nucleo X, mediante

accoppiamento J (INEPT e simili)

3. Evoluzione in X

4. Si ritrasferisce magnetizzazione ad 1H

5. Si osserva 1H

46

5. Si osserva 1H

Vantaggi:

Si parte da magnetizzazione “robusta” (1H)

Si osserva 1H

Svantaggi:

Bisogna eliminare tutto il segnale 1H non accoppiato a X (per esempio 13C). Sono richieste caratteristiche strumentali ottimali (impulsi esatti,

strumentazione stabile).

Negli esperimenti di correlazione eteronucleare uno specifico cammino di

coerenza può essere selezionato utilizzando impulsi di gradiente di uguale

durata purché sia verificata la condizione:

Σ (γi pi Gi ) = 0

γ = rapporto giromagnetico (dipende dal tipo di nucleo)

Esperimenti di correlazione eteronucleare

47

γ = rapporto giromagnetico (dipende dal tipo di nucleo)

p = ordine di coerenza

G = integrale del gradiente

Per calcolare correttamente il rapporto tra gradienti bisogna considerare i

livelli di coerenza di entrambi i nuclei e può essere conveniente definire un

livello di coerenza p’:

p’ = p(1H) + p(X) γ(X)/γ(1H)

HMQC – Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

Funziona in modo diverso da HSQC anche se gli spettri risultanti sono all’apparenza simili.Il primo impulso di 90°genera il termine di antifase su 1H. Il valore

di τ che garantisce il massimo di trasferimento da H a X è pari a 1/(2J). L’impulso di 90°su X trasforma l’antifase in multi-quanto 2IxSy, che evolve durante t1. A questo punto il segnale non è osservabile (multiquanto). Il

τ τ

t1

t2

x

AB

CD

E

garp

acq1H

X

180°

F

2IxSz 2IxSz

48

osservabile (multiquanto). Il 180°su H rifocalizza l’offset del protone; in questo modo l’unica cosa da valutare è l’evoluzione della costante di accoppiamento. L’impulso di 90° su X (D) viene dato lungo x – generando il termine in antifase 2IxSz. L’antifase evolve durante l’intervallo E formando il termine in-fase Iy. Questo termine è osservabile come doppietto (distanziato di J) o come singoletto disaccoppiato.

ω1

ω2ΩH

ΩCdec

ω1

ω2ΩH

ΩC

2IxSyIy

Sapendo che γγγγ(1H)

26.7519 107 rad/T*s e

γ(γ(γ(γ(13C) 6.7283 107 rad/T*s,

determinare i rapporti

G1:G2:G3 che consentono

di selezionare il cammino

di coerenza echo e quello

antiecho nell’esperimento

t1

∆

X

1H

G

∆

G2 G3G1+1

HMQC

49

antiecho nell’esperimento

HMQC 1H-13C.

γ(1H)/γ(13C) = 3.97 ≈ 4

1H

13C

+10-1

+10-1

ΦTOT= [4γC(1) + γC(1)] * G1 + [4γC(-1) + γC(1)] * G2+ [4γH(-1) + γC(0)] * G3= -5 G1 + 3 G2+ 4G3

=0

ΦTOT= -[γHp1H + γCp1C] * G1 - [γHp2H + γCp2C] * G2- [γHp3H + γCp3C] * G3 = 0

ΦTOT= -[4γC(1) + γC(-1)] * G1 - [4γC(-1) + γC(-1)] * G2- [4γH(-1) + γC(0)] * G3= -3G1 +5G2+ 4G3

=0

G1 = G2 -5G2+3G2+4G3=0 2G2=4G3 G2=2G3 G1:G2:G3 = 2:2:1

G1 = G2 -3G2+5G2+4G3=0 -2G2=4G3 G2=-2G3 G1:G2:G3 = 2:2:-1

Spettro HMQC con

Spettro HMQC con gradienti

50

Spettro HMQC con

gradienti NS=2

HSQC – Heteronuclear Single Quantum Coherence

L’esperimento HSQC evidenzia le correlazioni 1H-X. Lo spettro che ne deriva è del tutto simile a quello generato dall’HMQC ma è diverso il modo in cui il rilassamento influisce sui due esperimenti. Generalmente HMQC da risultati migliori per le piccole molecole, mentre per molecole di dimensioni più grandi e macromolecole è preferibile l’esperimento HSQC

τ1τ1 τ2

t1

τ2t2

y

AB

CD

E

garp

acq1H

13C

INEPT 1H 13C Retro-INEPT 13C 1H l’esperimento HSQCINEPT H C Retro-INEPT C H

Durante (A) si ha l’evoluzione di J (mentre l’off-set viene rifocalizzato). Il valore ideale di

τ è circa 1/(4J), che assicura il massimo del trasferimento. Si genera un termine di antifase che viene trasferito da H a C mediante gli impulsi (B). Durante (C) il sistema evolve sotto l’azione dell’accoppiamento e dell’off-set. Mediante gli impulsi (D) si trasferisce la parte di magnetizzazione in antifase da 13C a 1H. Questo termine contiene varie informazioni: ΩH, ΩC (in funzione di t1) , J. Durante (E) questo termine evolve da anti-fase a in-fase.

ω1

ω2ΩH

ΩC

dec

ω1

ω2ΩH

ΩC

?

Sapendo che γγγγ(1H)

26.7519 107 rad/T*s e

γ(γ(γ(γ(15N) -2.712 107 rad/T*s,

si calcoli il rapporto G1:G2

per un esperimento HSQC

1H-15N

HSQC

t1/2

τ τ τ

t1/2

X

1H

G

τ

INEPT 1H --> X INEPT X ---> 1H

G1 G2

52

1H-15N

γγγγ(1H)/γγγγ(15N) = -9.86 -≈ -10ΦTOT= [γHp1H + γNp1N] * G1 + [γHp2H + γNp2N] * G2= 0

ΦTOT= [-10 γNp1H + γNp1N] * G1 + [-10γNp2H + γNp2N] * G2= 0

ΦTOT= [-10 γN(*(0) + γN *(-1)] * G1 + [-10 γN*(-1) + γN * (0)] * G2= 0

ΦTOT= [-10 γN(*(0) + γN *(1)] * G1 + [-10 γN*(-1) + γN * (0)] * G2= 0

-1 G1 -10 G2= 0 G1 = - 10 G2

G1 - 10 G2= 0 G1 = 10 G2

HSQC con gradienti phase-sensitive - hsqcetgp

NS=4Echo-Antiecho

53

Echo-Antiecho

HSQC edited - hsqcedetgp

Phase sens.Echo-antiecho

54

La sequenza di impulsi è concepita in modo che i segnali relativi a gruppi –CH2 vengano dati in negativo

HSQC con impulsi adiabatici (180°X inversion)

55

Gli impulsi adiabatici hanno fase e frequenza non costanti nel tempo. Per loro natura riescono a coprire un ampio intervallo di frequenza e non necessitano di calibrazioni accurate. Sono quindi molto usati nelle sequenze eteronucleari per invertire o rifocalizzare gli eteronuclei. Il trasferimento è efficace anche agli estremi dello spettro.

Come si ottiene l’aumento di sensibilità?

I

S GARP

56

La pulse sequence viene modificata aggiungendo degli impulsi

che permettono di rifocalizzare altri cammini di coerenza.

Molto utile per campioni diluiti o per nuclei poco sensibili (15N).

A volte compaioni artefatti COSY.

1H

X

τ

t1/2

τττ ∆ ∆

φ

t1/2

y

y

INEPT 1H --> X ‘Sensitive Improvement’

HSQC Sensitive Improved

57

Fino al tempo di evoluzione la sequenza e’ del tutto identica alla precedente e quindi durante t1

evolvono gli operatori IzSy e IzSx. Nell’esperimento phase sensitive vengono alternativamente

acquisiti modulati in seno e in coseno, ma per ogni esperimento uno solo dei due porta a

magnetizzazione osservabile in t2. Dal momento che il blocco di impulsi e delay che consentono

di ottenere questo guadagno è inserito tra i due gradienti il rapporto G1:G2 non cambia

rispetto alla sequenza descritta nella diapositiva precedente.

G

Sensitivity Improvement

In rosso: spettro hsqcetgpsi

In blu: spettro hsqcetgp

58

150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ppm

HSQC vs. HMQC

I due esperimenti si differenziano per il tipo di magnetizzazione

(SQ o MQ) che evolve durante il T1, ma danno lo stesso tipo di

informazione.

59

HSQC è più lunga e quindi è meno sensibile nel caso di

molecole con T2 breve.

La magnetizzazione SQ fornisce picchi meglio risolti in F1.

Confronto HSQC-HMQC

In verde:

hsqcetgp

60

hsqcetgp

In rosso:

hmqcetgp

Correlazioni lungo raggio

In pratica posso usare tutti gli esperimenti visti sopra con J

piccola per il trasferimento di magnetizzazione.

Esiste anche un esperimento dedicato: HMBC

(heteronuclear multibond correlation). Si tratta di un

HMQC non disaccoppiato eventualmente con un filtro low

pass per eliminare J dirette.

61

pass per eliminare J dirette.

I

S GARP

d0

G1 G2 G3

δ

1/2J1/2J1/2J1/2J

t1X

1H

G

∆(1J) ∆(Jlr)?

Sapendo che γγγγ(1H) è

circa 4 volte quello

del 13C determinare

quali rapporti

G1:G2:G3 consentono

di selezionare il

HMBC

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G1 G2 G3 cammino di coerenza

antiecho

nell’esperimento

HMBC 1H-13C

+10-1

+10-1

1H

13C

ΦTOT= [γHp1H + γCp1C] * G1 + [γHp2H + γNp2C] * G2 + [γHp3H+γCp3C]*G3= 0

ΦTOT= [4γCp1H + γCp1C] * G1 + [4γCp2H + γNp2C] * G2 + [4γCp3H+γCp3C]*G3= 0

ΦTOT= [4γC(1) + γC(1)] * G1 + [4γC(-1) + γN(1)] * G2 + [4γC(-1)+γC(0)]*G3= 0

ΦTOT= [5γC] * G1 + [-3γC] * G2 + [-4γC]*G3= 0 5* G1 -3* G2 -4*G3= 0 G1:G2 :G3= 5:4:3

HMBC con gradienti – magnitude –hmbcgpndqf / hmbcgplpndqf

63

HMBC senza filtro low-pass per la soppressione delle correlazioni dirette

HMBC con filtro low-pass per la soppressione delle correlazioni dirette

Pulse sequence “miste” 2D

HSQC+DEPT = hsqcedetgp, hsqcedetgpsi, hsqcedetgpsisp2,

hsqcedetgpsp

HSQC+TOCSY=hsqcetgpml, hsqcdietgpsi, hsqcdietgpsisp, etc.

HSQC+NOESY=hsqcetgpnosp

HSQC+ROESY=hsqcetgprosp, hsqcetgprosp.2

64

HMQC+TOCSY=hmqcdietgp, hmqcdietgpsi, hmqcdietgpsi.2

HMQC+NOESY=hmqcetgpno

HSQC+ROESY=hmqcetgpro, hmqcetgpro.2

65

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