Complessi di Coordinazione nelle Scienze Biomediche

• Biologia– Metalloproteine: proteine che contengono uno o più

centri metallici necessari per la loro funzione Costituiscono circa il 25% delle proteine• Trasporto ed immagazzinamento di ossigeno• Trasferimento elettronico: riduzioni ossidazioni• Enzimi: catalisi di reazioni biochimiche

• Medicina– Diversi farmaci sono costituiti da complessi

metallici• Cisplatino ed analoghi di nuova generazione

1. Tipi di sistemi di trasporto ed immagazzinamento2. Struttura elettronica dei complessi di Fe(III) e Fe(II)3. Mioglobina 4. Emoglobina

Trasporto e immagazzinamento di ossigeno molecolare

(diossigeno)

Sistemi di trasporto ed immagazzinamento di ossigeno

molecolareGli organismi multicellulari richiedono opportuni sistemi di trasporto e immagazzinamento dell’ossigeno molecolare.

Sono noti tre sistemi di trasporto e tutti e tre impiegano metallo proteine di trasporto: emoglobina, emocianina, ed emeritrina.

La emoglobina Hb è una ferroproteina presente nella maggior parte degli organismi animali

La emocianina Hc è una cuproproteina (il biometallo è Cu) che si trova in diverse specie di artropodi e molluschi

La emeritrina Hr è una ferroproteina “non-eme” presente in alcuni invertebrati marini.

L’ossigeno trasportato può essere immagazzinato in alcuni tessuti come quelli muscolari grazie a metalloproteine di immagazzinamento quali la mioglobina (Mb) che hanno centri metallici analoghi a quelli delle metalloproteine di trasporto corrispondenti (Hb).

L’emoglobina e la mioglobina contengono uno ione ferro coordinato da un gruppo eme (porfirina) che lega l’O2

Porfirina Ferro porfirina

Heme

Proteina Eme

CHIMICA DI COORDINAZIONE DEL FERRO

Configurazione: [Ar] 3d64s2.

Stati di ossidazione: -I, 0, +I, +II, +III, +IV, +V e +VI.

Fe(II): è un sistema d6

Fe(III): è un sistema d5

Formano complessi con una gran varietà di leganti, quali ad esempio il [Fe(H2O)6]

2+ o [Fe(H2O)6]3+

I complessi di Fe(III) in acqua possono dar luogo ad idrolisi:

[Fe(H2O)6 ]3+ + H2O [Fe(OH)(H2O)5]2+ + H3O+ Ka = 1,8•10-3

Lo stesso vale per i complessi di Fe(II) :

[Fe(H2O)6 ]2+ + H2O [Fe(OH)(H2O)5]+ + H3O+ Ka = 3,2•10-9

ma in misura molto minore

In un complesso ottaedrico lo ione Fe(II), d6, può esistere negli stati ad alto e basso spin

0

E

dx2-y2 dz2

dxzdxy dyz

t2g

eg

basso spin

(t2g)6

0

Edx2-y2 dz2

dxzdxy dyz

t2g

eg

alto spin

(t2g)4(eg)2

Paramagnetico con 4 elettroni spaiati, S=2

Diamagnetico, S=0

In un complesso ottaedrico lo ione Fe(III), d5, può esistere negli stati ad alto e basso spin

0

E

dx2-y2 dz2

dxzdxy dyz

t2g

eg

basso spin

(t2g)5

0

Edx2-y2 dz2

dxzdxy dyz

t2g

eg

alto spin

(t2g)3(eg)2

Paramagnetico con 5 elettroni spaiati, S=5/2

Paramagnetico con 1 elettrone spaiato, S=1/2

Passando da un complesso ottaedrico ad uno piramidale e a uno quadrato planare, le energie degli orbitali d cambiano: gli orbitali con componente z si abbassano in energia

E

dz2

dxzdxy dyz

dx2-y2

dz2

dxz

dxy

dyz

dx2-y2

dx2-y2

dxy

dxz

dz2

dyz

n

n nn

n

geometriaottaedrica

geometriapiramidale

geometriaquadrato-planare

Complessi dell’O2

La molecola O2 può interagire con alcuni complessi di coordinazione per dare “addotti”, in cui l’unità dinucleare O2 viene conservata e, apparentemente, il metallo non cambia stato di ossidazione:

n [MLm] + O2 [MLm]n(O2)

Il primo esempio (Vaska, 1963) è il complesso [Ir(O2)Cl(CO)(PPh3)2]

Dal punto di vista strutturale i complessi di O2 possono essere divisi in mono-, di-, fino a tetra-nucleari. Si distinguono inoltre in terminali o mono dentati (1) e laterali o bi dentati (2).

6x2=12 elettroni di valenza ord. di legame=(8—4)/2=2

paramagnetica

2pE

2p2p

2s 2s2s

2s

2p

2p

2p

Struttura elettronica della molecola O2

2p*

2p

2p

O2 O2-

O22-

La molecola di O2 può acquistare uno o due elettroni formando gli ioni superossido O2

-e perossido O22- come in

KO2 e Na2O2

L’occupazione da parte di uno o due elettroni in più dell’orbitale antilegante 2p

* porta alla riduzione dell’ordine di legame

La distanza di legame O-O aumenta quindi nell’ordine:

O2 ossigeno o.l. = 2 2 el. spaiatiO2

- superossidi o.l. = 1.5 1 el. spaiatiO2

-2 perossidi o.l. = 1 diamagnetico

Parallellamante si osserva una riduzione della frequenza di stiramento (stretching) del legame O-O nello spettro IR

Addotti metallo-diossigeno

Gli addotti M-O2 possono essere caratterizzati dalla frequenza di stiramento del legame O-O nello spettro IR e la distanza interatomica O-O, che indicano la situazione elettronica del diossigeno coordinato.

Si parla quindi di:

Complessi tipo superossido quando tali parametri si avvicinano a quelli dello ione superossido (O-O = 1145 cm1 e d = 1,33 Å, in KO2)

Complessi di tipo perossido quando i parametri sono vicini a quelli dello ione perossido, O-O = 738 cm1 e d = 1,49 Å, in Na2O2).

I complessi mononucleari terminali 1 hanno O-O = 1130-1195 cm1 e d O-O = 1,25-1,35 Å, e sono quindi di tipo superossido

I complessi mononucleari laterali 2 hanno O-O = 800-932 cm1 e d O-O = 1,30-1,35 Å, e sono quindi di tipo perossido

In O2 la distanza internucleare è 1.207 Å

Natura del legame ferro-diossigeno

Il legame fra il metallo e l’O2 può essere descritto dalla combinazione lineare fra gli orbitali del frammento di tipo [FeIIL5] a geometria piramidale a base quadrata con gli orbitali della molecola di O2 (di energia e simmetria appropriate) che si coordina al ferro occupando la sesta posizione di coordinazione completando così un contorno ottaedrico.

Se la molecola O2 viene orientata nel piano yz, gli orbitali di simmetria appropriata che essa utilizza sono quelli 2p

*, semioccupati, che si combinano con gli orbitali dyz e dz2.

Fe LLL

LL

x

y

z

OO

Schema degli orbitali molecolari in FeIIL5-O2

I due MO di legame pieni (dz2-*) e (dxz-*) ricevono maggior contributo da quelli della molecola O2, suggerendo una polarizzazione del legame Fe+-O2

e quindi una ossidazione parziale del Fe(II). Questo accumulo di carica parziale negativa sul legante O2 spiega le caratteristiche tipo superossido di questo tipo di complesso

Al limite, il ferro può trasferire totalmente l’elettrone passando a Fe(III) e dando origine a un vero ione O2

Si noti che lo ione Fe(II) è ad alto spin mentre il complesso finale ha tutti gli elettroni appaiati ed è quindi diamagnetico

Mioglobina (Mb)

E’ una metalloproteina monomera che ha la funzione di immagazzinare O2 nei tessuti muscolari dei vertebrati.

Ciascuna molecola di Mb può legare una molecola di O2:

- nella forma deossigenata è denominata deossiMb

- quando contiene O2 è denominata ossiMb.

Entrambe le forme devono essere distinte dalla forma metaMb, (metamioglobina), che riguarda una mioglobina che è stata ossidata e contiene pertanto Fe(III) e non è capace di legare diossigeno

La molecola ha MM di circa 17,8 kDa. La sua struttura fu risolta per diffrazione di raggi X (1960) lavorando con un campione di sperma di balena.

La molecola è formata da una catena polipeptidica chiamata globina, costituita da 153 residui aminoacidici che sono disposti in 8 eliche , (identificate con le lettere comprese fra A e H) e in 7 segmenti di congiunzione fra le eliche “anse” (p. es. l’ “ansa” AB unisce le eliche A e B).

Struttura della deossimioglobina

La catena proteica si lega, per mezzo di un atomo N di un anello imidazolico di un residuo istidinico (la cosiddetta istidina prossimale, F8 = His-93), a un atomo di Fe(II) che è già coordinato da 4 atomi di N dell’anello porfirinico della protoporfirina o heme

Struttura della mioglobina con in evidenza il gruppo FeII-porfirina e le istidine prossimale (F8 = His-93) e distale (E7 = His-64)

istidina

Struttura della deossimioglobina

Protoporfirina IX e il gruppo eme

L’anello profirinico presente nella Mioglobina ed in altri metalloenzimi è noto come protoporfirina IX

Il corrispondente complesso con il ferro(II) è denominato Fe-protoporfirina IX o anche gruppo eme

Protoporfirina IX Fe-protoporfirina IX o eme

Lo scheletro ciclico aromatico di 24 atomi dell’anione porfirinato delimita una cavità centrale che è adatta ad coordinare cationi metallici di dimensioni compatibili con distanze di legame Np-M di 2,04 Å, anche se l’anello è flessibile e permette legami stabili leggermente più lunghi o più corti.

Tale cavità risulta particolarmente adatta ad alloggiare Fe(II) a basso spin, Fe(III) a basso spin, Co(II) o Co(III)

Nella struttura della deossimioglobina è presente un altro anello imidazolico che fa parte di una istidina situata nella elica E (istidina distale, E7 = His-64), che non è legato al metallo, ma è in prossimità della sesta posizione di coordinazione del ferro, quella occupata dalla molecola di diossigeno nella forma ossiMb.

Nella deossiMb il Fe è pentacoordinato; essendo ad alto spin e quindi più grande della cavità lo ione Fe(II) non riesce a coordinarsi nel piano della della protoporfirina IX, ma fuoriesce di circa 0,6 Å verso l’azoto imidazolico della istidina prossimale.

Aspetti strutturali della deossimioglobina

Ossimioglobina

Legandosi a O2 per dare la forma ossiMb, il ferro si sposta verso il piano del macrociclo. Si ottiene un complesso di diossigeno terminale, con un angolo Fe-O-O di 115°.

Nella deossiMb lo ione Fe(II) è in uno stato fondamentale ad alto spin con 4 elettroni spaiati

Quando viene legato il diossigeno, lo stato di ossidazione del metallo è più ambiguo a causa di possibili trasferimenti elettronici fra ossigeno e centro metallicoSono stati ipotizzati due modelli: (i) uno in cui si assume un parziale trasferimento elettronico dal metallo al legante per formare Fe(III) e O2

(superossido); (ii) uno in cui si assume che lo ione resti Fe(II) ma passi in uno stato di basso spin per l’aumento di campo cristallino

Ossimioglobina

Nella deossiMb lo ione Fe(II) è in uno stato fondamentale ad alto spin con 4 elettroni spaiati: la forma deossi è pertanto paramanetica con S=2

Quando viene legato il diossigeno, la forma ossi è diamagnetica e, se si considera il metallo ancora nello stato di ossidazione (II), si può parlare che nella ossiMb lo ione Fe(II) sia a basso spin con S=0 (diamagnetico)

Ciò riduce la dimensione effettiva dello ione e, di conseguenza, ne permette lo spostamento verso la cavità della porfirina trascinando la istidina prossima ad esso mentre il macrociclo recupera approssimativamente la sua forma piana.

Edx2-y2

dz2

dxz

dxy

dyz

In altre parole, il legame di O2 con Fe induce un cambiamento della coordinazione (da penta- a esa-coordinato) e di stato di spin del metallo (HS → LS).

Questo determina una diminuzione delle dimensioni del metallo e quindi un suo migliore assestamento nell’anello porfirinico.

Lo ione Fe(II) spostandosi verso l’anello porfirinico tira con se l’istidina prossimale ad esso coordinata e ciò comporta un lieve aggiustamento della struttura terziaria della globina, uno spostamento dell’elica F a cui l’istidina è ancorata, che non ha però alcuna conseguenza funzionale

Nella proteina alcuni residui amminoacidici sono in prossimità del centro metallico. In particolare istidina distale (His-64) chiude una angusta tasca idrofobica che è anche delimitata da un residuo Valina ed uno Fenilalanina

L’analisi ai raggi-X dimostra che His-64 può bloccare l’entrata in questa tasca e pertanto O2 non può accedere ad essa a meno che la istidina distale si muova verso l’esterno, lasciandogli il passaggio grazie alla flessibilità della globina.

L’ O2 che penetra nella tasca idrofobica oltre a coordinarsi al Fe interagisce con la istidina distale attraverso un legame a idrogeno che coinvolge il gruppo N-H.

Questo legame idrogeno stabilizza ulteriormente l’unione di O2 al metallo.

Ruolo della proteina nelle funzioni biologiche della Mb.

hhhh

L’istidina-64 ha l’ulteriore funzione di rendere difficile l’entrata di altri substrati capaci di legarsi al Fe occupando il posto dell’O2 (es. CO).

In particolare il monossido di carbonio è prodotto in modo naturale nel corso della degradazione metabolica dei gruppi eme e per questo può essere un legante competitivo in sistemi biologici.

La sua affinità per i gruppi eme, quando questi sono liberi in soluzione acquosa, è circa 20.000 volte più grande di quella di O2. Tuttavia i gruppi eme di Mb (e di Hb) legano il CO soltanto circa 250 volte più fortemente che l’O2.

L’effetto discriminante della proteina è stato messo in relazione con ragioni steriche.

Nella carbossimioglobina (complesso con CO), per permettere la formazione di un legame quasi lineare (Fe-C-O devia dalla linearità soltanto di 6-9°), la proteina deve spostare qualcuno dei suoi residui aminoacidici implicando una spesa addizionale di energia e, pertanto, un effetto di discriminazione positiva a favore dell’O2 che non ha bisogno di questi spostamenti.

Coordinazione del CO

Infatti:

O2 adotta una geometria piegata piuttosto che lineare, preferita da CO (ibrido sp2 in O2, sp in CO).

O2 legato è stabilizzato da legami H con la His distale, mentre la coordinazione di CO è inibita dall’ingombro sterico di residui aa in prossimità del metallo

Ruolo della globina e ossidazione delle Fe-porfirine

La globina ha un altro ruolo: impedire che Mb si ossidi irreversibilmente a metaMb con formazione dell’anione superossido.

O2 è un potente ossidante e dovrebbe reagire facilmente con la forma ridotta dell’eme. Perciò la stabilità dei complessi eme-O2 nelle proteine deve essere attribuita a fattori cinetici e non termodinamici.Infatti i complessi porfirinici di Fe(II) liberi si ossidano facilmente in soluzione acquosa, probabilmente con il seguente meccanismo:

Fe(II) + O2 ⇄ Fe(II)O2

Fe(II)O2 + Fe(II) ⇄ Fe(III)-O-O-Fe(III)

dove O-O rappresenta la forma perossido. In più, il dimero -perossido può essere a sua volta trasformato in un dimero -ossido attraverso l’intermedio FeIV=O.

L’ossidazione irreversibile di Fe(II) a Fe(III) è prevenuta se esistono barriere strutturali che inibiscono la riduzione bi-elettronica di O2, come dimostrato da Collman per modelli puramente inorganici (1974).

Emoglobina (Hb)

La emoglobina (Hb) è una molecola più complessa della Mb. Nei mammiferi è formata da quattro subunità (1, 2, 1, 2), ciascuna contenente un gruppo eme.

Dal punto di vista strutturale ciascuna delle quattro subunità somiglia a una molecola Mb

Le subunità di tipo sono costituite da 141 residui mentre quelle di tipo da 146 e la molecola ha in totale un PM di 64,5 kDa circa il quadruplo della Mb. Le subunità 1, 2, 1, 2 sono disposte attorno a una cavità centrale occupata da molecole di acqua. Ciascuna di esse è unita alle altre tramite interazioni elettro statiche (“ponti salini”) che legano più strettamente due “dimeri” 11 e 22

Heme

Struttura dell’emoglobina

1122

2

2

1

1

Deossiemoglobina e ossiemoglobina

Poiché l’emoglobina contiene quattro subunità, ciascuna con un gruppo eme e quindi uno ione Fe(II), essa può legare fino quattro molecole di O2.

L’ossigenazione dell’emoglobina altera la struttura di tutta la proteina: L’Hb può esistere in due conformazioni distinte note come stati T(deossi Hb) e R(ossiHb) che differiscono per la struttura quaternaria cioè per la disposizione delle quattro subunità 1, 2, 1 e 2

Le differenze fra i due stati sono così grandi che i cristalli di deossiHb possono spaccarsi quando assorbono ossigeno e si trasformano in ossiHb

La transizione da stato T a R avviene in seguito all’assorbimento di una o più molecole di O2 ed è innescata dallo spostamento dello ione Fe(II) verso l’anello porfirinico che tira con se l’istidina prossimale con un conseguente aggiustamento della struttura terziaria della globina (in particolare dell’ elica F a cui l’istidina è ancorata). Questo aggiustamento all’interno di ogni singola subunità, seppur lieve, comporta la rottura di una serie di ponti salini (interazioni elettrostatiche) fra le quattro subunità stesse. Poiché queste interazioni determinano la struttura quaternaria dell’emoglobina, questa viene a subire una significativa alterazione conformazionale.

Variazione strutturale a livello

di eme

Spostamento dell’istidina prossimale e dell’elica F

La coordinazione dell’O2 provoca lo spostamento verso l’anello porfirinico dello ione Fe(II) che tira con se l’istidina prossimale con un conseguente aggiustamento della struttura terziaria della globina e in particolare dell’ elica F a cui l’istidina è ancorata.

Piano della porfirina

elica F

deossi

ossi

Passando dallo stato T (deossi) a quello R (ossi) si hanno le seguenti variazioni della struttura quaternaria:

- le catene si avvicinano di circa 0.8 Å

- il dimero 11 ruota, come unità rigida, di 15° rispetto al dimero 22

- i contatti tra le subunità alle interfacce 12 e 21 si spostano

T R

Effetto cooperativo

La transizione dell’emoglobina dallo stato T a quello R avviene gradualmente quando i gruppi heme delle sue quattro subunità hanno coordinato da una a tre molecole di ossigeno. Lo stato R ha una maggiore affinità della forma T verso l’O2.

Di conseguenza, la coordinazione di una molecola di O2 ad una sub unità dell’emoglobina favorisce la coordinazione di una seconda molecola di O2 ad un’altra subunità e così via fino all’assorbimento di quattro molecole di O2. Tale effetto è noto come cooperativo.

…..

1

O2

2

O2 O2

4

1 1

1 1

O2

Il trasporto dell’ossigeno

Nel sangue la solubilità dell’O2 è molto maggiore che in acqua:

- In acqua la solubilità è 6.6 cm3 in 1 dm3 a 293 K e 1 atm ovvero di 3 x 10-4 M - Nel sangue, nelle stesse condizioni di T e P, la solubilità sale a 200 cm3 cioè 9 x 10-3 M

Questo è l’effetto della coordinazione dell’ossigeno alle molecole di emoglobina presenti nei globuli rossi.

L’assorbimento dell’ossigeno da parte dell’emoglobina o della mioglobina viene usualmente descritto da curve di ossigenazione in cui si riporta la frazione di proteina ossigenata in funzione della pressione parziale dell’ossigeno.

In queste curve il 100% corrisponde alla saturazione, cioè all’assorbimento di una molecola di O2 da parte di tutte le molecole di mioglobina o di quattro molecole di O2 da parte di tutte le molecole di emoglobina.

Comportamento della mioglobina

Nel caso della mioglobina in cui i siti di legame al centro metallico M dei gruppi eme a cui si coordinano le molecole di O2 sono indipendenti, la reazione può essere descritta dall’equilibrio:

M + O2 MO2 Kp = [MO2]/[M]P(O2)

Se chiamiamo la frazione di M ossi genata, si ricava facilmente che in funzione della P(O2) segue una funzione iperbolica:

= [MO2]/([M]+[MO2])

= Kp·P(O2)/ [1+ Kp·P(O2)]

E’ conveniente esprimere l’affinità di M per O2 come la pressione parziale di O2 necessaria per saturare il 50% della specie M, P1/2 (O2).

In tali condizioni, [M]= [MO2], ottenendo: P1/2 (O2) = 1/Kp

Comportamento della emoglobina

Il comportamento fisiologico della emoglobina (Hb) è diversa da quello della mioglobina.

La curva di ossigenazione di Hb ha una forma sigmoidale invece della forma iperbolica che si osserva per Mb (curva b a pH fisiologico di 7.2)

Questa forma indica che le 4 subunità non si comportano come una semplice somma di 4 Mb, ma che esse presentano un effetto cooperativo quando legano progressivamente le quattro molecole di O2.

Così, le due prime subunità vengono ossigenate peggio della Mb, ma le ultime due mostrano praticamente la stessa affinità per O2 di Mb.

Sistema emoglobina-mioglobina

Nei polmoni la P(O2) è circa tre volte maggiore che nei tessuti (90-100 contro 30-35 mmHg)Nei polmoni, dove ci sono elevate pressioni di O2, l’Hb assorbe efficentemente l’O2 venendo praticamente saturataNei tessuti, dove le pressioni di O2

sono basse, Hb è meno efficiente di Mb e rilascia l’O2 alla Mb che mantiene il 90% della saturazione

Emoglobina trasporto di O2

Mioglobina immagazzinamento O2

L’affinità della Hb per O2 viene diminuita da conc. crescenti di H+, Cl-, CO2 e 2,3-D-difosfoglicerato (DPG). La cavità centrale della deossiHb contiene un certo numero di leganti positivi ai quali DPG può legarsi.

Poiché il cambiamento di conformazione conseguente alla ossigenazione rompe questi siti di interazione, DPF stabilizza la forma deossi (inibendo perciò la coordinazione di O2)

L’affinità per l’O2 diminuisce inoltre al diminuire del pH e si ha un’ abbassa mento della curva di ossigenazione (pH=7.2 curva b, pH=6.8 curva c)

Ciò è dovuto al fatto che la transizione fra stato T ed R che è responsabile dell’aumento di affinità per l’O2 all’aumentare della frazione di Hb ossigenata (effetto cooperativo) è inibito dagli ioni H+ in quanto essi protonano alcuni anioni responsabili di ponti salini che stabilizzano lo stato R