CENNI DI CITOGENETICA

CARIOTIPO: definisce il numero e la morfologia dei cromosomi di un individuo.

Nell’uomo tutte le cellule (ad eccezione delle cellule germinali) hanno cariotipo diploide (23 coppie di cromosomi) e la morfologia dei cromosomi è determinata dalla posizione del centromero e dalla lunghezza.

Ogni cromosoma metafasico è costituito da due cromatidi (cromatidi fratelli), uniti a livello del centromero che viene così a dividere i cromatidi in due parti chiamate bracci ; le estremità sono dette telomeri.

In base alla posizione del centromero i cromosomi vengono classificati in:

-metacentrici, quando il centromero divide il cromosoma in due bracci apparentemente uguali;

-submetacentrici, quando il centromero divide il cromosoma in due bracci di dimensioni diverse;

-acrocentrici, quando il centromero èsubterminale;

In tutti i cromosomi viene distinto il braccio p (corto) e il braccio q (lungo).

banda

Braccio p

Braccio q

Le bande che si evidenziano lungo i cromosomi umani possono essere ottenute con metodi diversi:

-bande Q (bande fluorenza con chinacrina, Quinacrina)

-bande G (bande G con tripsina e Giemsa)

CARIOTIPO UMANO NORMALE

gruppo A: 1-3 metacentrici lunghi

gruppo B: 4-5 submetacentrici lunghi

gruppo C: 6-12 e X submetacentrici medi

gruppo D: 13-15 acrocentrici lunghi

gruppo E: 16-18 metacentrici o submetacentrici relativamente corti

gruppo F: 19 -20 metacentrici corti

gruppo G: 21-22 e Y acrocentrici corti

Metacentrici lunghi Submetacentrici lunghi

Submetacentrici medi

Acrocentrici lunghi Metacentrici relativamente corti

Metacentrici corti Acrocentrici corti

ANOMALIE CROMOSOMICHE

Qualunque cambiamento nel numero o nella struttura dei cromosomi

• Mutazioni numeriche

• Mutazioni strutturali

Rappresentano la patologia genetica più frequente al concepimento e, nonostante la fortissima selezione naturale dovuta all’aborto spontaneo, colpiscono circa l’1% dei neonati.

Numeriche

Le anomalie numeriche si verificano principalmente per il fenomeno della non-disgiunzione che può verificarsi durante la prima o la seconda divisione meiotica. Prendiamo in considerazione la spermatogenesi nella quale le 4 cellule derivate dalle meiosi sono tutte vitali.

- meiosi I: tutti gli spermatozoi originatisi saranno anormali; in particolare metà non conterra’ nessuno dei due membri della coppia di cromosomi, mentre l'altra metà li conterra’entrambi (22 o 24 cr)

- meiosi II: saranno soltanto 2 gli spermatozoi anormali fra i 4 totali

Nell'uomo la sola trisomia autosomica realmente compatibile con la vita è rappresentata dalla Sindrome di Sindrome di DownDown (interessa il cromosoma più piccolo cr 21).

Se la non-disgiunzione avviene durante la mitosi, lo zigote ènormale e l'aneuploidia* insorge nello sviluppo successivo�mosaico.

*aneuploidia= corredo cromosomico sbilanciato

Oltre alla trisomia 21 vi sono altre due tipi di aneuploidia ricorrenti, la trisomia del 18 o Sindrome di EdwardsSindrome di Edwards e la trisomia 13 o Sindrome di PatauSindrome di Patau.

Anomalia cromosomica

Correlazione con età materna

Trisomia 21 (S.Down) 1/1000 nati si

Trisomia 18 (S. Edwards) 1/2700 nati si

Trisomia 13 (S.Patau) 1/6600 nati si

Trisomia X (Femmina XXX) 1/1000 femmine si

Monosomia X (S. Turner) 1/2500 femmine no

47,XXY (S. Klinefelter) 1/500 maschi si

Maschio YY 1/1000 maschi no

Freq.

Stutturali

• delezioni �perdita di singoli frammenti cromosomici. La più comune è determinata da un singolo punto di rottura che porta a una delezione terminale.

Più rari: punti di rottura doppi.

Es: la delezione più comune trovata nell'uomo (1/50.000 nati vivi) è la perdita del braccio corto del cromosoma 5�Sindrome del pianto di gatto 5pSindrome del pianto di gatto 5p o piccole delezioni in 15q�Sindrome di PraderSindrome di Prader--Willi.Willi.

• duplicazioni� acquisto di frammenti cromosomici che puo’ avvenire qualora, in seguito a tre rotture, un segmento di cromosoma si inserisca altrove nel cromosoma omologo, oppure in un cromosoma diverso.

• traslocazioni� rotture in due o più cromosomi non omologhi che siano seguite da ricombinazioni dei frammenti in posizioni diverse. Fenomeno abbastanza comune che puòessere trasmesso alle generazioni successive.

- Si parla di t.reciproca quando il riarrangiamento delle parti di un cromosoma avviene in modo integrale (senza perdita di pezzi). L'eterozigote è detto bilanciato e il fenotipo è normale.

- Altri tipi di traslocazioni sono dette sbilanciate e danno luogo a trisomie parziali (anche a carico del cromosoma X; alcune sono responsabili di tumori, quali leucemie e linfomi- es.: cromosoma Philadelfia)

• Inversioni� in un unico cromosoma si verificano 2 rotture e i segmenti intermedi che ne derivano si riuniscono fra di loro.

-i.pericentrica: se l'inversione comprende il centromero;-i.paracentrica: se non comprende il centromero;

Anomalie cromosomiche

Numeriche

Strutturali

Poliploidie

Aneuploidie

Traslocazioni

InserzioniDelezioniDuplicazioniInversioniCromosomi ad anelloIsocromosomi

Triploidie

Tetraploidie

Trisomie

Monosomie

Reciproche

Robertsoniane

Diagnosi prenatale

L’obiettivo della diagnosi prenatale delle malattie genetiche è quello di offrire ai futuri genitori, qualora lo desiderino, la certezza che i loro figli siano sani quando il rischio di una malattia genetica sia effettivamente elevato. Questo NON equivale alla certezza di avere figli sani.

La diagnosi prenatale utilizza tecniche invasive (l’amniocententesi, il prelievo dei villi coriali e la cordocentesi) e non invasive (l’ecografia) e i test biochimici.

SCREENING BIOCHIMICI PRENATALI SU SANGUE MATERNO

Questi test non permettono di porre una diagnosi certa ma solo di calcolare la probabilità che il feto sia affetto.

- Un risultato rischio aumentato, rispetto a una soglia di riferimento, non significa che il feto sia sicuramente affetto ma che questa probabilità è sufficientemente elevata da giustificare approfondimenti diagnostici (Es: indagine citogenetica su villi coriali o amniociti per verificare la presenza di alterazioni cromosomiche).

- Un valore di rischio inferiore rispetto alla soglia, non garantisce che il feto non possa essere affetto ma che questo evento è poco probabile

1) Bitest

Il Bi-test è uno screening che si esegue dal 11°° trimestretrimestre di gravidanza (11°-12° settimana) e consente di valutare il rischio che un feto possa essere affetto da trisomia 21 o trisomia 18.

Il test si basa su una tecnica combinata:

-”traslucenza nucale” (NT), misurazione dello spessore tra la cute e i tessuti sottostanti a livello della nuca fetale e vienemisurata mediante l’ecografia. (> è lo spessore, maggiore èil rischio)

- dosaggio di 2 ormoni presenti nel sangue materno durante la gestazione: la free-beta hCG (frazione libera della gonadotropina corionica) e la PAPP-A (proteina A plasmatica associata alla gravidanza).

Traslucenza nucale

2) Tritest

Il Tri-test è uno screening che viene eseguito nel 22°°trimestretrimestre di gravidanza (15°-17° settimana) e consente di valutare il rischio che il feto possa essere affetto da tri 21 o tri 18 o difetti del tubo neurale. Si basa sulla misurazione di 3 ormoni:

-AFP: alfafetoproteina

-uE3: estriolo-non-coniugato

-hCG: gonadotropina corionica.

Dalla combinazione combinata di questi 3 analiti e di altri parametri (epoca gestazionale, età materna, peso corporeo, abitudine al fumo, origine etnica) possono essere individuate le gravidanze a rischio aumentato.

Sensibilità del 70%

Le malattie candidate alla dp:

• gravi, incurabili� se il feto è affetto, i genitori possono decidere di effettuare un aborto selettivo

• necessità trattamento precoce�malattie da deficit immunologico o metaboliche

La dp può essere richiesta per:

• gravidanze in cui il rischio di patologie fetale èprevedibile: an. cromosomiche, mutazioni geniche

• gravidanze in cui il rischio non è prevedibile:malformazioni fetali evidenziate ecograficamente, malattie materne ( es. m.infettive)

Indicazioni all’indagine citogenetica fetale:

-età materna >= 35aa rischio 0.5-7 %

-1° figlio con anom.crom. “ “ 0.7-1.4%

-genitore con riarr. strutturale “ “ 1-15 %

-malformaz. fetale ecografia “ “ 10-30 %

Ecografia

E’ uno strumento di routine per valutare l’età gestazionale, per controllare la crescita fetale e per identificare gravidanze gemellari.

Intorno alla 18 a-20 a settimana si può determinare il sesso del feto.

L’ecografia è fondamentale per diagnosticare malformazioni anatomiche, ma non è in grado di identificare specifici danni biochimici o molecolari

Amniocentesi

Prelievo di una piccola quantità (di solito 20ml) di liquido amniotico in cui sono presenti cellule desquamate della cute e degli epiteli dell’apparato gastrointestinale, respiratorio e genitourinario.

Viene eseguita di solito intorno alla 1616a a settimanasettimana di gestazione.

L’amniocentesi deve essere preceduta da una consulenza genetica accurata che spieghi le indicazioni e proponga una valutazione dei rischi e dei benefici così come dei limiti di questa procedura. Il liquido prelevato viene analizzato per la ricerca di specifiche proteine come ll’’aa--fetoproteinafetoproteina; le cellule possono essere messe in coltura e esaminate con le tecniche di citogenetica classica, tecniche biochimiche o con l’analisi molecolare di DNA.

Prelievo dei villi coriali (CVS)

Questa tecnica prevede il passaggio di un piccolo catetere flessibile di polietilene attraverso la cervice e poi dentro l’utero sotto guida ecografica dove avviene il prelievo attraverso l’aspirazione di piccole quantità di corion frondosum, il tessuto che successivamente si trasformerà in placenta. In alternativa si può passare per via transaddominale; la sicurezza e la validità delle due procedure è la stessa.

I villi del corion fetale vengono poi separati dalle cellule materne ed esaminate con le tecniche sopracitate.

Il prelievo viene eseguito di solito tra la 99 a a e la 12e la 12 a a settimanasettimana di gravidanza.

Questo permette di avere i risultati dei test diagnostici in un periodo in cui una eventuale interruzione è più sicura ed emotivamente piùfacile rispetto all’interruzione dopo l’amniocentesi.

Questa tecnica però non va bene per la ricerca dei difetti del tubo neurale ed inoltre è una tecnica più invasiva.

Prelievo di sangue fetale che viene effettuato dalla

1818 a a settimana di gravidanzasettimana di gravidanza in poi, sotto guida ecografica, attraverso un ago inserito nel cordone ombelicale.

Il prelievo per via percutanea viene fatta per l’incompatibilitàdel fattore Rh, per alterazioni ematologiche del feto o infezioni, oppure per eseguire un cariotipo in presenza di anomalie riscontrate all’eco.

Il rischio di aborto spontaneo di questa procedura è piùelevata delle altre due tecniche citate.

Cordocentesi

Malattie monogeniche in cui è possibile la dp attraverso l’analisi del DNA:

-autosomiche dominanti

- distrofia miotonica

- malattia del rene policistico dell’adulto

- Corea di Huntington

- neurofibromatosi tipo 1

- cancro mammario familiare

-autosomiche recessive

- anemia falciforme

- α e β-talassemia

- fibrosi cistica

- fenilchetonuria

- deficit di α1-antitripsina

- malattia di Tay-Sachs

-X linked recessive

- emofilia A e B

- distrofia muscolare di Duchenne e di Becker

- sindrome dell’X fragile

- deficit di ornitina transcarbamilasi

La consulenza genetica è un processo comunicativo che ha lo scopo di fornire agli individui ed alle famiglie che hanno una malattia genetica o sono a rischio di averla, una informazione completa sulla loro condizione, di analizzare le conseguenze personali di questa informazione e di aiutare le coppie a rischio a prendere delle decisioni responsabili sui loro rischi riproduttivi

(American Society of Human Genetics , 1975)

CONSULENZA GENETICA

Aspetti principali:

• diagnosi: una corretta diagnosi è la base essenziale per un corretto consiglio

• stima dei rischi: studiare la trasmissione della malattia, l’espressività, la penetranza; a volte è una fase molto complessa

• supporto: l’assicurarsi di aver trasmesso tutte le informazioni disponibili per usufruire al meglio delle forme di prevenzione disponibili (consulenza “non-direttiva”)

Momenti principali:

- raccolta delle informazioni di carattere genetico/ disegno del pedigree

- arrivare a una diagnosi ben definita, anche attraverso esami strumentali o di laboratorio addizionali e/o consulenza di medici specialisti

- dare informazioni al paziente sull’impatto della malattia in famiglia

- anticipazioni sulle possibili scoperte future

Indicazioni per la consulenza genetica:

- malattia ereditaria nota o sospetta in un paziente o in una famiglia

- difetti congeniti

- ritardo mentale

- età avanzata materna

- storia familiare di cancro con insorgenza in età giovanile

- aborti ripetuti

- esposizione a teratogeni

- consanguineità

Farmacogenetica

Studio delle basi genetiche della diversa risposta ai farmaci.

Una terapia ragionata dovrebbe tener conto dell’esistenza di ampie differenze individuali di risposta ai farmaci determinate geneticamente.

La succinilcolina è un farmaco usato in anestesia che provoca il rilassamento muscolare e ha una azione di breve durata. Tuttavia in 1/2000 pazienti l’arresto respiratorio èmolto più prolungato e può essere fatale. La pseudocolinesterasi plasmatica degrada il farmaco: individui sensibili presentano questo enzima modificato e sono omozigoti�il fenotipo “sensibilità alla succinilcolina” èrecessivo.

Quindi sia gli omozigoti sia gli eterozigoti hanno reazioni normali al farmaco.

Se si misura l’attività della pseudocolinesterasi i 3 genotipi sono indistinguibili per cui si utilizza una sostanza che agisce come inibitore competitivo alla pseudocolinesterasi: dibucaina.

La % di inibizione dell’attività dell’enzima da parte della dibucaina si vede sull’individuo normale, ma non su quello atipico; si va a vedere il n° di molecole di dibucaina che inibiscono (nd)

- omozigoti per enzima atipico: nd tra 10 e 20

- omozigoti per enzima normale: nd = 80

- eterozigoti: nd tra 50 e 70

La legge di Hardy-Weinberg

Genetica di tipo quantitativo:

1) genetica di popolazione

2) eredita’ multifattoriale

1) La genetica di popolazione è lo studio della distribuzione dei geni nella popolazione e dei fattori che mantengono o modificano la frequenza dei geni di generazione in generazione

2) L’eredità multifattoriale si occupa di caratteri e di malattie nè trasmesse con modalità mendeliane nèassociate ad anomalie cromosomiche, ma nelle quali ci siano considerevoli prove di un importante ruolo causale di fattori genetici (es: ipertensione)

La legge di Hardylegge di Hardy--WeinbergWeinberg spiega perchè i caratteri dominanti non tendono a sostituire automaticamente quelli recessivi nella popolazione.

Consideriamo un singolo locus autosomico con 2 alleli (A e a), la cui frequenza nella popolazione, negli spermatozoi e negli ovuli sia:

p = frequenza dell’allele A

q = frequenza dell’allele a

Poichè ci sono solo 2 alleli � p+q=1

Quindi utilizzando lo schema di Punnet:

A (p) a (q)

A (p)

a (q)

AA (p2) Aa (pq)

Aa (pq) aa (q2)

Le frequenze dei genotipi nella progenie sono quindi:

genotipo: AA Aa aa

frequenza: p2 2pq q2

Lo stesso si può fare per la generazione successiva sempre ottenendo p2 2pq q2

La popolazione è in equilibrio di Hardy-Weinberg e le frequenze genotipiche non cambiano, vale a dire che generazione dopo generazione, le frequenze dei tre genotipi rimangono costanti.

La legge di HW è valida se:

- gli accoppiamenti sono casuali;

- la popolazione è grande;

- le mutazioni relative ad A e a sono trascurabili.

L’applicazione medica più importante è la determinazione della frequenza degli alleli e dei portatori eterozigoti di una popolazione, in cui sia nota la frequenza di quel carattere.

Es: la fibrosi cistica ha un’incidenza di 1/2000 in Europa

q2 � frequenza degli individui omozigoti affetti è di 1/2000

q = frequenza dell’allele mutante

q = √√√√2000 = 1/45 o 0,022.

La frequenza dell’allele normale è:

p = 1-q= 1- 1/45 = 44/45 o 0,978

La frequenza dei portatori eterozigoti è 2pq

2 x p x q= 2 x 44/45 x 1/45 = 1/23 o 0,043

cioè il 4% degli individui di razza bianca è eterozigote per l’allele della fibrosi cistica, fatto questo di notevole importanza nella consulenza alle famiglie in cui segrega la malattia.

Le condizioni richieste dalla legge di Hardy-Weinberg in molte popolazioni non sussistono. Le popolazioni infatti frequentemente sono piccole e l’incrocio può non essere casuale. Inoltre possono esistere fenomeni che inducono cambiamenti nelle frequenze alleliche come la mutazione, la selezione, la migrazione e la deriva genetica,.

Mutazione

Una mutazione converte una forma allelica in un’altra. Il tasso con cui avvengono le mutazione nella popolazione in generale è molto basso ma varia da gene a gene e tra specie. Molti fattori ambientale possono aumentare il tasso mutazionale (agenti chimici, radiazioni ed agenti infettivi).

Questo rappresenta comunque l’unico mezzo con la quale una specie può acquisire nuovo materiale genetico.

Selezione

I diversi alleli per effetto di una mutazione possono portare a cambiamento o perdita di una determinata funzione.

nuova variante�miglioramento funzione�vantaggiosa

nuova variante�funzione compromessa�deleteria

nuova variante�nessun cambiamento funzione�neutra

La forza che fa sì che una caratteristica sia più o meno adatta all’ambiente circostante e che quindi l’individuo che lo porta sia più o meno avvantaggiato è definita selezione naturale.

Migrazione

Indicano spostamenti di popolazioni da una regione all’altra. Si parla di flusso genico in quanto individui provenienti da una popolazione con determinate frequenze geniche migrando possono introdurre nuovi alleli nel pool genico della nuova popolazione.

Deriva genetica

Può accadere che in una popolazione ad un certo punto per diverse cause si verifichi un isolamento di piccoli gruppi (religiose, geografiche) oppure una riduzione nel numero degli individui che la costituiscono(catastrofi naturali, epidemie). Quando la popolazione ha dimensioni limitate si verifica una fluttuazione delle frequenze geniche molto più spinta da una generazione all’altra dovute però al caso e non alla selezione naturale.

Ecco un albero genealogico di una famiglia affetta da ipercolesterolemia familiare:

Qual è il meccanismo con cui si trasmette la malattia?

1. La malattia è presente in tutte le generazioni. (trasmissione verticale)

2. Un individuo affetto ha sempre un genitore affetto.

3. La malattia ricorre con la stessa frequenza nei due sessi. Su un totale di 13 individui malati, 7 sono di sesso maschile, 6 di sesso femminile.

4. Gli individui III-9 e III-10 sono entrambi affetti e hanno avuto figli non affetti. Se il carattere fosse recessivo, due genitori affetti dovrebbero generare sempre prole affetta. Due genitori eterozigoti affetti invece, possono avere figli omozigoti non affetti.

5. Vi sono 21 figli di coppie in cui un solo genitore è affetto. Di questi individui, 10 sono affetti a loro volta => 10/21 (0,47)

Queste deduzioni ricavate dall’analisi dell’albero genealogico permettono di stabilire che la malattia è AUTOSOMICA DOMINANTE.

Determina nel seguente albero genealogico se il fenotipo mutato è dominante o recessivo.

Qual è il meccanismo con cui si trasmette la malattia?

1. Il fenotipo mutato è presente nella prima generazione, poi rimane "nascosto" nella II e nella III per poi ricomparire nella IV.

2. Il discendente affetto IV-1 ha due genitori non affetti.

� La trasmissione è AUTOSOMICA RECESSIVA.

L’albinismo è una malattia a trasmissione autosomica recessiva. Se Mario, fenotipicamente normale, figlio di un genitore albino sposa una donna albina, che percentuale di figli della coppia saranno albini?

a) 25%b) 50%c) tutti (100%)d) nessuno

Il genitore di Mario è albino, quindi omozigote recessivo per i due alleli che determinano il carattere. (aa)

Mario ha acquisito dal padre l’allele recessivo a, ma essendo normale avrà come genotipo Aa (sarà cioè eterozigote).

Sua moglie è albina, quindi anch’ella è omozigote recessivo per i due alleli (aa)

Allora ci chiediamo quanti figli generati dall’incrocio Aa (Mario) x aa (sua moglie) saranno omozigoti per il carattere?

Disegnamo l’albero

Secondo il quadrato di Punnet:

A a

a Aa aa

a Aa aa

Il 50% dei figli sarà albino (omozigote recessivo aa)

In un reparto di maternità accidentalmente vengono confusi quattro bambini.

Fortunatamente si conosceva il gruppo sanguigno ABO dei quattro bambini:

Andrea 0

Filippo A

Giovanni B

Davide AB

Viene determinato a quale gruppo sanguigno appartengono le quattro coppie di genitori e risulta:

a) AB x O

b) A x O

c) A x AB

d) O x O

Assegnare a ciascuna coppia di genitori il loro bambino.

Tenendo presente che ciascun bambino riceve un allele da ciascungenitore e ricordando che A e B sono alleli dominanti e O è un allele

recessivo (vedi definizioni), si ha che :

Andrea è figlio della coppia d)

Filippo è figlio della coppia b)

Giovanni è figlio della coppia a)

Davide è figlio della coppia c)