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Gli Enzimicatalizzatori biologici
rendono possibile da un punto di vista cinetico le reazioni chimiche
Sono le proteine più importanti e più specializzate
Presentano un elevato grado di specificità per il substrato
Operano in soluzioni acquose con temperature e pH blandi
Parte proteica
Coenzima
(natura organica: vitamina o altro)
Struttura generale degli enzimi
Cofattore
(ione metallico) Gruppo
Prostetico
Parte
non-proteica
Sono proteine
globulari complesse :Addotto
enzima-substrato
Addotto ES
SITO ATTIVO:
specifica
porzione
dell’enzima,
deputata al
legame con il
substrato che
porta alla
formazione
dell’addotto ES
Proprietà dei
Catalizzatori
I catalizzatori sono
sostanze capaci di
abbassare l’energia di
attivazione rendendo piú
facile la formazione
dell’addotto ES: la reazione
diviene quindi piú veloce.
favoriscono
lo stato di transizione
formando l’addotto ES
I catalizzatori abbassano
l’energia di attivazione
delle reazioni
A(S) B(P)
Gprodotti-Gsubstrati (G°’) < 0
Reazione esoergonica
Risultato:
accelerazione della
reazione globale.
Molti catalizzatori non facilitano la formazione dello stato
di transizione, ma sostituiscono la reazione ‘difficile’ con
2 o più reazioni entrambe con uno stato di transizione
facile da formare
ΔG↨
=energia di attivazione
E+S ES EP E+P
L’energia usata per
aumentare la velocità
enzimatica deriva dalle
interazioni deboli (legami
idrogeno, interazioni
ioniche e idrofobiche) che si
formano tra enzima e
substrato
ENERGIA di LEGAME
ADDOTTO
Enzima-Substrato
Adattamento
indotto
CATALISI ENZIMATICA
• velocità di una reazione (V):
numero di molecole di substrato che si
trasformano in prodotto nell’unità di tempo.
• (V) si esprime come mmol/L di prodotto
formatosi in un minuto (mM/min).
• Velocità iniziale V0
• Nelle analisi delle reazioni enzimatiche si
utilizzano soltanto le velocità di reazione
iniziali (v0), quelle che si misurano non appena
si mescolano l’enzima ed il substrato.
• In tal modo la variazione di [S] può essere
considerata trascurabile.
CINETICA ENZIMATICA
FATTORI CHE MODIFICANO LA VELOCITA’
DELLE REAZIONI ENZIMATICHE:
1) pH (curva a campana)
2) temperatura (curva bifasica a causa della
denaturazione)
3) [S] (iperbole rettangolare a causa della
saturazione)
4) inibitori
CINETICA ENZIMATICA
• Ciascun enzima ha un pH ottimale al quale la reazione
è catalizzata con la massima efficienza.
Esso in genere rispecchia il pH dell’ambiente in cui
l’enzima svolge normalmente le sue funzioni.
• La concentrazione degli H+ (pH) influenza l’attività enzimatica modificando la geometria del sito attivo e la
distribuzione delle cariche elettriche dei gruppi
coinvolti nel legame del substrato o nel processo
catalitico stesso.
• Valori di pH estremi possono anche provocare la
denaturazione dell’enzima.
CINETICA ENZIMATICA: pH
CINETICA ENZIMATICA: pH
• La velocità di reazione aumenta con
l’aumentare della temperatura fino a
raggiungere un picco.
• Un ulteriore innalzamento della
temperatura provoca una
diminuzione della velocità di
reazione a causa della
denaturazione dell’enzima.
CINETICA ENZIMATICA:
temperatura
CINETICA ENZIMATICA: temperatura
• La velocità di una reazione catalizzata da un
enzima aumenta all’aumentare della concentrazione del substrato fino a
raggiungere una velocità massima (Vmax). In
questa condizione i siti attivi dell’enzima sono
saturi del substrato
Quando tutto l’enzima è saturato con il substrato:
[ES] = [Etot]
V0 = Vmax
CINETICA ENZIMATICA:
concentrazione del substrato
L’equazione di
Michaelis-Menten
• descrive la variazione della velocità di reazione al variare della
concentrazione del substrato.
v0 = velocità iniziale della reazione
Vmax= velocità massima
Km = costante di Michaelis-Menten
[S] = concentrazione del substrato
Costante di
Michaelis e
Menten
La Km è quella concentrazione
di substrato a cui la V0 è pari a
metà della Vmax
La curva che esprime la
relazione tra V0 e S ha un
andamento iperbolico ed è
espressa algebricamente dalla
equazione di Michaelis-Menten
Caratteristiche della Km
• La Km è pari alla concentrazione di substrato alla quale
la velocità della reazione (V0) è 1/2 della Vmax.
• La Km riflette l’affinità dell’enzima per il substrato:
Km piccola = alta affinità dell’enzima per il substrato
Km grande = bassa affinità dell’enzima per il substrato.
• Ogni enzima ha una Km caratteristica per un dato substrato.
• La Km non varia al variare della [E].
I PARAMETRI
CINETICI
POSSONO
ESSERE USATI
PER
CONFRONTARE
LE ATTIVITA’
DEGLI ENZIMI
Inibizione Enzimatica
Inibitori
ostacolano o impediscono il funzionamento degli
enzimi
Inibitore reversibile:Ha un azione
temporanea, è
possibile allontanare
l’inibitore dall’enzima,
consentendo il
regolare esplicarsi
dell’attività catalitica.
inibitore irreversibile:la ripresa dell’attività
enzimatica non è
possibile, in quanto
non è possibile in
nessun modo
allontanare l’inibitore
dall’enzima
•Aumentano o diminuiscono la loro attività catalitica in
risposta a determinati segnali
• tali enzimi non seguono la cinetica di Michaelis–Menten
e sono responsabili della modulazione della velocità con
cui decorre interi processi metabolici
• struttura quaternaria (due o più subunità proteiche)
• in essi esistono più siti chimicamente attivi
ENZIMI ALLOSTERICI
Enzimi regolatori
Legano Effettori o MODULATORI:
molecola che interagendo con
l’enzima in siti lontani dal sito
attivo, esercita un effetto positivo
o negativo sulla sua attività
Modificazioni covalenti
reversibili
Modificazione
allosterica
Enzimi regolatori
Enzimi allosterici:Agiscono mediante
legame non covalente
e reversibile di
Modulatori allosterici
OMOTROPICI
Il substrato è
esso stesso un
modulatore ETEROTROPICI
Il modulatore è
una molecola
diversa dal
substrato
Enzimi regolatori
Inibizione retroattivaGli enzimi allosterici possono essere inibiti dai
prodotti terminali di una via metabolica
Enzimi regolatori
un enzima regolatore controlla le quantità di sostanze che devono
essere trasformate in una via metabolica
(catalizza la reazione più lenta, in genere la prima di una serie)
modificazione covalente reversibile
Enzimi regolatori
modificazione covalente
irreversibile
(zimogeno inattivo)
Scissione proteolitica di un precursore
Enzimi regolatori
Molti enzimi per poter essere attivi richiedono la
presenza di ioni metallici o di altre molecole,
talvolta legate con legami covalenti:
Coenzimi o cofattori
Cofattore:
ione o molecola NON PROTEICA la cui presenza è
indispensabile perché l’enzima possa svolgere la sua
attività catalitica. Interagiscono con l’apoezima solo
durante il ciclo catalitico.
Tra i cofattori hanno rilevante importanza gli ioni di alcuni
elementi metallici,
Ca, Mg, Mn, Zn, Cu
(tutti gli enzimi che utilizzano ATP richiedono la presenza
di ioni Mg2+).
Coenzimi e Cofattori
Molti enzimi per poter essere attivi richiedono la
presenza di ioni metallici o di altre molecole,
talvolta legate con legami covalenti:
Coenzimi o cofattori
Coenzimi: sono molecole organiche (alcuni di
essi derivano da vitamine idrosolubili)
• prendono parte direttamente all’azione
catalitica dell’enzima
• spesso si ritrovano modificati chimicamente al
termine della reazione (es. NAD+ / NADH).
Coenzimi e Cofattori
Coenzimi• I coenzimi da soli sono cataliticamente inattivi ma,
unendosi all’apoenzima, formano l’enzima
cataliticamente attivo.
• Uno stesso coenzima può essere unito a diverse proteine
per cui si deduce che la specificità dell’azione
enzimatica è proprietà dell’apoenzima e non del
coenzima.
• La maggior parte dei coenzimi è strettamente legata alle
vitamine.
• Per diventare coenzima, la vitamina subisce delle
trasformazioni che vanno dalla semplice fosforilazione
(uno dei casi più comuni) a trasformazioni più complesse.
• La trasformazione della vitamina in coenzima avviene
all’interno delle cellule ed è di natura enzimatica.
• I coenzimi possono essere classificati in gruppi diversi,
in base al tipo di reazione catalizzata.
Coenzimi derivati dalle vitamine idrosolubili
• Le vitamine sono necessarie per la sintesi di
coenzimi e devono essere ottenute con la dieta
• Piante e microorganismi sono produttori di
vitamine
• La maggior parte delle vitamine deve essere
ulteriormente trasformata per generare coenzimi
Coenzimi
Cofattori
La niacina (acido nicotinico) è un precursore di
NAD + e NADP +
NAD = Nicotinamide Adenina Dinucleotide
NADP = Nicotinamide Adenina Dinucleotide
Fosfato
NAD+ e NADP+ fungono da coenzimi in molte
reazioni di ossidoriduzione
Niacina
(Vit. B3 o PP)NAD + e NADP +
CofattoriNAD + NADH
Cofattori
Il NAD+ funziona da deidrogenante:
porta via 2 atomi di H dal substrato.
Uno viene perso sotto forma di ione
H+, l’altro viene perso come idruro
H- che si lega immediatamente
all’anello piridinico cationico
PROTEINE
RESPIRATORIE
EMOGLOBINA
&
MIOGLOBINA
→un sistema circolatorio;
→molecole trasportatrici di O2,
che permettono di superare la
limitazione imposta dalla bassa
solubilità dell’ossigeno in acqua.
Nel corso
dell’evoluzione, con il
passaggio dalla vita
anaerobia alla vita
aerobia si sono
progressivamente
differenziati due
meccanismi che sono in
grado di garantire alle
cellule dei tessuti un
flusso di O2 sufficiente e
costante:
Legano reversibilmente l’O2 (LIGANDO)
ne rendono possibile il trasporto dai
polmoni ai tessuti e l’immagazzinamento
nel muscolo.
Nei vertebrati le molecole coinvolte nel rifornimento
dell’ossigeno sono:
Emoglobina (Hb)
Mioglobina (Mb)
Proteina monomerica
(153 AA)
Immagazzinamento
dell’O2 nella cellula
80% degli AA sono
disposti ad α-elica
Mioglobina (Mb)
La Mb si trova nei muscoli e
funziona soprattutto come
deposito di O2;
Facilita la diffusione dell’ossigeno nel
muscolo che sta respirando rapidamente
Eterotetramero
Emoglobina (Hb)
costituita da 4
diverse subunità:2 subunità α2 subunità β
Trasporto dell’O2
dai polmoni alla cellula
L’Emoglobina trasporta
l’O2 dai polmoni ai tessuti
La Mioglobina lega
l’ossigeno rilasciato
dall’ Emoglobina nel
circolo
Sanguigno e ne facilita
la diffusione nel
muscolo che sta
respirando rapidamente
EME
Emoglobina Mioglobina
EME:
PROTOPORFIRINA IX
Fe2+
4 anelli pirrolici
Fe2+ al centro
EME
EME
EME
EME
EME
O2
CO
H2O
(metaemoglobina)
Fe2+ → Fe3+
EMEIl Fe2+ dell’eme può legare:
Il Fe2+ dell’eme può legare:
O2
EME
(ossiemoglobina)
Il Fe2+ dell’eme può legare:
CO
EME
(carbossiemoglobina)
I derivati carbossi-mioglobina e
carbossi-emoglobina presentano CO
(non CO2!!!) legato al gruppo eme.
Il legame con il CO è circa 300 volte più
stabile di quello con l’O2 ed è
irreversibile !
Quando nell’aria è presente 0.2% di CO
in 1 ora si ha perdita di coscienza e in
circa 4 ore si ha morte per asfissia
(circa 2/3 di Hb sono legati a CO).
Protezione dell’eme da parte della globina
Le globine che circondano l'eme in Mb ed in Hbhanno funzioni di estrema importanza:
- impediscono al ferro dell’eme di ossidarsi daFe2+ ferroso a Fe3+ ferrico;
- creano un sito attivo idrofobico, in cui si lega O2
che è lipofilo*;
- proteggono l’eme da ligandi indesiderati(esempio CO).
*la solubilità di O2 nel plasma è molto bassa; grazieall'emoglobina nel sangue c'è una concentrazione di O2
100 volte superiore a quella del plasma.
Mioglobina (Mb)
Costituita da 153 residui aa
8 α-eliche
Gruppo emeTasca idrofobica eliche E ed F
His E7: istidina distale; His F8: istidina prossimale
Deposito di O2 a livello muscolare
Muscolo a riposo: Mb lega O2 Muscolo attivo: consumo di O2
Quando diminuisce la pressione a livello dei tessuti, Mb rilascia l’O2
Legame all’ossigeno della Mb (MbO2)
Pressione
tessuti
Pressione
polmoni
P50Pressione parziale di O2 alla
quale è saturato il 50% delle
molecole
SEMISATURAZIONE
Misura dell’affinità per l’O2 Più piccola è la P50
maggiore è l’affinità
Numero di molecole
che hanno legato
l’O2 rispetto al totale
Y
Curva iperbolica
Sa
tura
zio
ne
fra
zio
na
le
1. contenuta negli eritrociti
2. trasporto di O2 dai polmoni ai tessuti (legame reversibile)
3. trasporto reversibile di CO2.
La sostituzione delle catene β (Hb adulta) con le catene (Hb fetale)
comporta differente funzionalità.
struttura quaternaria tetramerica
4 catene polipetiditiche
4 gruppi eme
HbA (α2β2):
emoglobina adulta umana
2 catene α, 2 catene β
HbF (α22):
emoglobina fetale
2 catene α, 2 catene
Emoglobina (Hb)
La struttura terziaria è simile tra subunità α e subunità β,
entrambe inoltre sono simili alla Mb, anche se le tre
catene polipeptidiche hanno solo il 18% dei residui aa in
comune
Emoglobina (Hb)
Interazioni tra subunità di tipo diverso:
Emoglobina (Hb)
Interazioni idrofobiche
Legami idrogeno
Legami ionici
Emoglobina (Hb)
L’emoglobina esiste in due forme:
ossigenata =R; deossigenata =T
Il legame di Hb con O2determina una grande modificazione della struttura
quaternaria. La proteina passa da una forma tesa T, mantenuta da interazioni
ioniche (ponti salini) fra catene laterali di aminoacidi (es. Asp-His) presenti nelle
subunità, a una forma rilassata R (ponti salini spezzati). Il fenomeno avviene in
direzione opposta quando l’emoglobina rilascia l’ossigeno.
Modificazione conformazionale:
Transizione T↔R
Le modificazioni della struttura quaternaria avvengono alle interfacce α1β2 e α2β1
Il dimero α1β1 ruota di circa 15° rispetto al dimero α2β2
deossigenata =T ossigenata =R
Modificazione conformazionale:Transizione T↔R
deossigenata =T ossigenata =R
passando da T ad R, il
Fe 2+ si sposta nel
centro del piano
dell’EME. Questo
movimento trascina
anche l’His F8 che a sua
volta trascina con se
tutta l’elica F.
deossigenata =T ossigenata =R
Modificazione conformazionale:Transizione T↔R
proteine con struttura
quaternaria possono
andare incontro a
modificazioni nella
disposizione spaziale
delle subunità
costituenti.
Allosterismo(modificazione della struttura quaternaria)
L’emoglobina è una proteina allosterica la cui struttura
quaternaria viene modificata dal legame di O2 alle 4
subunità: i 4 siti attivi cooperano positivamente, legando
O2 con affinità crescente e questo causa cambiamento
progressivo di struttura quaternaria.
Hb Hb + 4O2 = Hb(O2 )4
Curva di dissociazione dell’O2 per l’Emoglobina
sigmoidale
La quantità di
ossigeno legato si
modifica
significativamente
anche con piccole
variazioni di pO2 .
Hb lega l’O2 quando la
pressione parziale del
gas (pO2) è elevata
(polmoni) e lo rilascia
quando la pressione è
bassa (tessuti).
La mioglobina è un
ottimo sistema per
immagazzinare O2:
-si lega all’O2 anche a
basse pO2 e lo lega
strettamente.
L’emoglobina è un
ottimo sistema per
trasportare l’O2:
-si carica di O2 quando
pO2 è alta e cede O2
quando pO2 è bassa.
Hb lega O2 con affinità
crescente
Hb + 4 O2 =Hb(O2)4
La curva di
dissociazione sigmoide
indica la presenza di
interazioni
cooperative:
il legame di una
molecola influenza il
legame delle altre
Modello
simmetrico Modello sequenziale
Fattori che influenzano l’affinità dell’Hb per O2
piccole molecole e ioni, presenti negli eritrociti possono
regolare il legame di O2 ad Hb
EFFETTORI O MODULATORI ETEROTROPICI:
[H+] , CO2, acido 2,3 bisfosfoglicerico (2,3-BPG)
si legano con interazioni deboli in siti diversi da quello di
legame dell’O2
diminuiscono l’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno.
MODULATORI ETEROTOPICI NEGATIVI.
L’aumento di concentrazione di questi modulatori causa
una diminuzione dell’ affinità di Hb per O2 e stabilizzano la
forma T.
Il legame di Hb con O2 è fortemente influenzato dal
pH e dalla pCO2.
Polmoni:
pH alto; pCO2 bassa:
l'affinità di Hb per O2 aumenta, O2 viene legato e H+ e
CO2 vengono rilasciato.
Aumentando il pH si rimuove il protone (H+) legato
all’Hb, stimolandone l’ossigenazione
EFFETTO BOHR
Il legame di Hb con O2 è fortemente influenzato dal
pH e dalla pCO2.
Tessuti:
pH basso; pCO2 alta:
l'affinità di Hb per O2 diminuisce, O2 viene liberato e
H+ e CO2 si legano ad Hb.
Nei tessuti Hb(O2)4 perde affinità per O2, lo rilascia a
causa delle basse pO2 e, essendo la forma
deossigenata più affine per H+, si comporta come un
ottimo tampone intracellulare (azione di alcuni
residui di istidina). L'azione tampone si accompagna
al trasporto dell'anidride carbonica.
EFFETTO BOHR
In aggiunta al trasporto di O2 dai polmoni ai tessuti,
Hb trasporta anche due prodotti della respirazione,
H+ e CO2, dai tessuti ai polmoni ed ai reni, organi
deputati alla loro escrezione.Trasporto della CO2
•CO2 liberamente disciolta nel plasma
•CO2 trasportata come bicarbonato (HCO3-)
•CO2 trasportata come carbammati(15-20%)
formatosi dalla reazione con i gruppi α– aminici
terminali non ionizzati dell’Hb
EFFETTO BOHR
Dai tessuti verso i capillari, la CO2
diffonde disciolta in acqua. Mentre negli
eritrociti, l’enzima anidrasi carbonica,
catalizza la reazione seguente:
H+ HCO3-
Si lega all’Hb che
viene indotta a
rilasciare l’O2
passano dal globulo
rosso al plasma
attraverso una
proteina di membrana
CO2 + H2O → H2CO3 → H+ + HCO3-
EFFETTO BOHR
Quindi la maggior parte di CO2 nel sangue viene
trasportata sotto forma di bicarbonato.
Gli ioni H+ si legano a 3 coppie di siti sull’Hb: la
più nota è l’His 146 delle catene β
Nei tessuti ad elevato metabolismo, come nei
muscoli in attività in cui c’è una notevole
produzione di composti acidi e di CO2, l’Hb cede
più facilmente l’O2 e lega gli H+ e la CO2.
Nei polmoni avviene esattamente il contrario.
EFFETTO BOHR
venoso
arterioso
EFFETTO BOHR
pH & pCO2
Il legame di ioni H+ induce l’Hb a rilasciare l’ossigeno nei
tessuti e a legare la CO2 prodotta dalla respirazione
muscolare.
EFFETTO BOHR
pH & pCO2
pCO2↓
pCO2↑
Influenza della pCO2
Influenza del pH
tessuti polmoni
Influenza del
2,3- BPG
2,3-bisfosfoglicerato
Il 2,3 BPG è una piccola
molecola dotata di cariche
negative che consentono il
legame a una serie di cariche
positive delle catene laterali
di AA situati sulle due catene
β, formando ponti salini e
stabilizzando la forma T
(deossigenata)
Il sito per il 2,3 BPG è
presente solo nella forma
tesa T.
Influenza del
2,3- BPG
Nell’Hb
deossigenata (T) è
presente una cavità
centrale che si
restringe
consistentemente in
Hb in forma R
(ossigenata): tale
cavità nella forma T
ospita il 2,3 BPG,
modulatore
allosterico negativo.
Influenza del
2,3- BPG
Nell’Hb
deossigenata (T) è
presente una cavità
centrale che si
restringe
consistentemente in
Hb in forma R
(ossigenata): tale
cavità nella forma T
ospita il 2,3 BPG,
modulatore
allosterico negativo.
Influenza del
2,3- BPG
EMOGLOBINA FETALE (HbF)
L'O2 rilasciato nella circolazione placentare dall’ Hb materna a certe
pressioni parziali, viene assunto dall’ Hb fetale, più affine, e ciò
soddisfa l'esigenza fisiologica di rifornimento di O2 al feto da parte
della madre.
Il significato del 2,3 BPG
appare chiaro se si confronta
la curva di saturazione dell’
HbA materna e dell’ Hb e
fetale. Gli eritrociti fetali
contengono un Hb con
struttura quaternaria α2 2.
Fra le catene il 2,3-BPG si
lega più debolmente rispetto
a quello che avviene nell’
HbA. La curva di saturazione
dell’’Hb fetale è a sinistra
rispetto a quella della HbA
materna, indicando
maggiore affinità per O2.
emoglobinopatie
Anemia falciforme
emoglobinopatie
Le talassemie
P. Champe, R. Harvey, D. R. Ferrier, LE BASI DELLA BIOCHIMICA, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006