Carlo Artusi UOC Medicina di Laboratorio – Prof. Mario Plebani

Azienda Ospedaliera – Università degli Studi di Padova

Roma, 13/15 maggio 2015

• Oltre 60 000 pubblicazioni (dal 1922)

• Circa 14 000 sono review article

• solo circa 4 200 sono RCT

• 20 correlazioni tra vit.D e altrettante patologie

PubMed Maggio 2015

PubMed Maggio 2015

“This media coverage has caused a massive

rise in demand for measurement of blood

concentrations of vitamin D from the public

and physicians.”

Sattar N et al., Lancet 2012

● Australia

23 000 (2000) – 2.2 million (2010) HUNDREDFOLD

● Auckland (New Zeland)

8 500 (2000) – 32 800 (2010) QUADRUPLED

● Glasgow Royal (Scotland, UK)

18 862 (2008) – 37 830 (2010) DOUBLED

● An hospital in London (England, UK)

7 537 (2007) – nearly 46 000 (2010) SIXFOLD

• USA (2004-2007) SIXFOLD

Sattar N, Lancet 2012 - Grey A, Lancet 2012 - Farrell CL, Clin Chem 2012 – Holick MF, Clin Chem 2010

“25OHD measurement being one of the most-ordered, if

not the most-ordered, esoteric assay in the US”

20874

25701 29322

31872

45416

52232

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

2009 2010 2011 2012 2013 2014

Campioni analizzati Medicina di Laboratorio

2010 2014

DOUBLED

Costo al SSN per test di 25OHD : 15 euro

Paziente ambulatoriale

Medicine generali

Pediatrie

Malattie infettive

Servizio per la patologia della riproduzione umana

Endocrinologia

Clinica geriatrica

Case di riposo

IOV

Lungodegenze

Nefrologie

Cliniche chirurgiche

Chirurgia epato-bliare

Ematologia ed immunologia

Clinica Ortopedica

Reumatologia

Malattie del metabolismo

Altri

Campioni analizzati Medicina di Laboratorio

61%

● 25OHD è il migliore indicatore dello stato complessivo

della vitamina D, per cui è l’unico metabolita che viene

utilizzato per valutare se un paziente è vitamina D

carente, insufficiente, sufficiente o intossicato.

● 25OHD è la principale forma circolante di vitamina D e ha

un’emivita di circa 3-4 settimane.

● 25OHD è il risultato della somma della vitamina D

prodotta in seguito all’esposizione solare e quella

assunta con la dieta

● 25OHD non viene influenzato da variazioni di calcio e

PTH

Holick MF, J Clin Invest 2006

< 30 nmol/L deficient

30 – 50 nmol/L inadequate

50 – 125 nmol/L adequate

< 50 nmol/L deficient

50 – 75 nmol/L insufficient

75 – 250 nmol/L sufficient

Principali problematiche analitico-metodologiche

Molecola molto idrofobica (instabile in acqua), scarsamente

antigenica e fortemente legata alla VDBP

Esiste in diverse forme molecolari, interferenza dei

metaboliti inattivi

Altri interferenti (es. anticorpi eterofili)

Mancanza di standardizzazione dei metodi

Immunometrici competitivi, sia RIA (tracciante

isotopico) che metodi automatizzati, in

prevalenza chemiluminescenti (CLIA) ma

anche immunoenzimatici (EIA)

HPLC-UV (cromatografia liquida con

rivelazione UV)

LC-MS/MS (cromatografia liquida abbinata a

spettrometria di massa tandem)

Farrell CL et al. Clin Chem 2012

RIA DiaSorin

IA Abbott (Architect)

IA DiaSorin (LIAISON)

IA IDS (ISYS)

IA Roche (E170, monoclonal 25OH-D3 assay)

IA Siemens (Centaur)

2 LC-MS/MS methods

Analizzatori confrontati misurando 25OHD in 170 soggetti

Farrell CL et al. Clin Chem 2012

Farrell CL et al. Clin Chem 2012

• When 25OHD > 20 nmol/L the DiaSorin LIAISON,

compared to the other immunoassays, exhibited the

better concordance with LC-MS/MS results

• None of the automated immunoassays can reliably

quantify 25OHD concentrations < 20 nmol/L

• Inaccuracy at very low concentrations have a limited

impact on treatment decision but may influence the

lower limit to which laboratories report

Farrell CL et al. Clin Chem 2012

Differenti principi analitici e metodologie per la

misurazione della 25OHD

Differenti metodi per rilasciare la 25OHD dalle VDBP

Differente impatto nell’interferenza da anticorpi

eterofili

Differente cross reattività con la 25OHD2 e gli altri

metaboliti (es. 24,25(OH)2D, C3-epi-25OHD)

Principali differenze analitiche tra gli analizzatori

VDSP: Vitamin D Standardization Program ODS, NIST, CDC, DEQAS, CAP, AACC, IFCC

2010

“large assay variation remains a critical barrier

to standardizing clinical and research assay

measurements and to developing clinical and

public health guidelines based on standardized

research results.”

Metodo di riferimento accettato dal NIST e

riconosciuto nel 2011 dal JCTLM: LC-MS/MS che

prevede estrazione, separazione cromatografica,

utilizzo di standard interni deuterati e rivelazione

altamente specifica in spettrometria di massa

tandem (MS/MS)

Dal 2009 materiale di riferimento del NIST: SRM 972

e successivamente SRM 2972

Standardization-Certification Program for Vitamin D

2013

Programmi di VEQ:

● DEQAS*

● VitDQAP

● ABVD del CAP

* da Ottobre 2013 il NIST assegna il valore atteso nei materiali utilizzati nel programma

“Since lab results with potentially high variabilities have

been used to define reference ranges for 25OHD, it is

unclear if the ranges are truly representative of the 25OHD

levels in the general population or if they are biased.”

Bedner M et al., Clin Chim Acta 2013

Fraser WD et al., Calcif Issue Int 2013

16 methods, 1119 users

Immunoassays 86%, LC-MS/MS 11%

Results

70-75% positive bias

15-20% close to the mean

5-10% negative bias

La scelta del metodo analitico da utilizzare per la

determinazione della vitamina D è un compromesso tra:

● Specificità e accuratezza del dato analitico ottenuto

● Total turn around time (produttività)

● Costo

● Convenienza in termini organizzativi

Non sempre risulta facile da valutare, soprattutto

quando non sono chiari i traguardi analitici di

imprecisione e accuratezza del dato e il relativo impatto

clinico.

Fraser WD et al., Calcif Tissue Int 2013

DiaSorin LIAISON XL®

dal 2013

Principio analitico

chemiluminescenza (CLIA)

LOQ = 10 nmol/L

Cromatografia Liquida abbinata a

Spettrometria di Massa Tandem

UPLC-MS/MS

UPLC Acquity Triplo quadrupolo TQD

WATERS

Confronto LC-MS vs DiaSorin LIAISON

25OHD (n=40, range 7-261 nmol/L)

Farrell C, Clin Chem Lab Med 2012

• “The DiaSorin assay did show good agreement with the LC-

MS/MS method in the samples tested.”

• “The DiaSorin assay would reliably report an accurate total

25OHD result for the types of specimens likely to be encoutered

with appreciable frequency in a high testing volume laboratory.”

1. “The DiaSorin LIAISON total method provides readily

accessible, uniform and standardized technology for high

volume reference laboratories.”

2. “The DiaSorin LIAISON total method scored the highest

results respect the other immunoassays.”

3. “The DiaSorin LIAISON assay demonstrated the best

performance characteristics.”

1. Hollis BW, Brit J Nutr 2010

2. de la Hunty A et al, Brit j Nutr 2010

3. Farrell CL et al, Clin Chem 2012

“With the knowledge that most children and adults are vitamin D

deficient or insufficient, and that this deficiency places them at

high risk for chronic disease, should everyone be tested for their

blood 25(OH)D concentration, as we do for blood lipids, given that

vitamin D status may play a more important role in health than

almost any other biochemical marker ?”

“differences of opinion exist on what defines

25OHD deficiency, what should be measured to

determine deficiency, and even whether 25OHD

measurement is needed.”

● “Many laboratories will accept the limitations of fully

automated assays as a price worth paying for their ease

of use and high sample throughput.”

● “Partecipation in external quality assessment schemes

is absolutely essential”

● “Editors of scientific journals should insist that, for

clinical studies involving 25-OHD measurements,

submitted manuscripts give full details of methods used

and their performance in an external quality assessment

scheme.”

Carter GD, Current Drug Targets 2011

● “Does knowing the result of 25OHD usefully improve clinical

practice and patient wellbeing?”

● “We remains cautious about the recommenendation of

widespread supplementation for chronic disease prevention.”

● “Until the results of large randomised trials are reported, we

urge all clinicians to stop and think critically before measuring

25OHD, particulary in conditions not linked to bone disease.”

● “Such practice will avoid many unnecessary tests, reduce

laboratory backlog, and save a lot of health-service time and

money without affecting patients’ health.”

Sattar N et al., Lancet 2012