FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA I metodi immunometrici, sfruttando le...

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• I metodi immunometrici, sfruttando le caratteristiche uniche di selettività e di avidità del legame antigene (analita)-anticorpo, permettono lo sviluppo di metodi altamente specifici per la quantificazione dell’analita, anche in matrici complesse.

METODI IMMUNOMETRICI (I)

complesso analita-anticorpocomplesso analita-anticorpo

analitaanalita + anticorpoanticorpo

quantificazione delcomplesso analita-anticorpo

quantificazione delcomplesso analita-anticorpo

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L’avidità del legame analita-anticorpo si misura con la costante di

affinità Kaff che è a tutti gli effetti una costante termodinamica di

equilibrio (Keq). Un anticorpo idoneo per lo sviluppo di metodi

immunometrici deve avere una Keq >109-1012 M-1

CH2HN CH2

CH2

CH2

NH

CH2

CH2

HOOC

HOOC

COOH

COOH

EDTA: acido etilendiaminotetracetico

KM-EDTA

AgEDTA3-

CaEDTA2-

FeEDTA2-

HgEDTA2-

107 M-1

1010 M-1

1014 M-1

1022 M-1

Complesso

METODI IMMUNOMETRICI (II)

Per confronto, si riportano le costanti termodinamiche di alcuni complessi tra uno ione metallico ed EDTA, un legante poliamminocarbossilico, che forma complessi chelati molto stabili con numerosi ioni metallici

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1942 Coons descrive la procedura per marcare un anticorpo con fluorescina.

1959 Berson e Yalow descrivono il primo RIA (RadioImmunoAssay). Ricevono il Premio Nobel in medicina nel 1977.

1960 Singer e Schick descrivono la procedura per coniugare due proteine senza alterare le loro funzioni biologiche.

1969 Avrameas descrive la procedura per coniugare un anticorpo con l’enzima perossidasi utilizzando il metodo della glutaraldeide.

1969 Miles e Hales dimostrano che un enzima può essere utilizzato come marcatore, in alternativa ai radioisotopi, per lo sviluppo di metodi immunoenzimatici (Enzyme ImmunoAssay, EIA).

1971 Engvall e Perlmann descrivono l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) nel quale l’analita ed il tracciante (analita coniugato con un enzima) competono per gli anticorpi immobilizzati su una fase solida. La separazione tra fase libera e fase legata avviene mediante lavaggio della fase solida.

1972 Rubenstein descrive il primo EIA omogeneo (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique, EMIT).

1975 Köhler e Milstein descrivono la procedura per produrre anticorpi monoclonali. Ricevono il Premio Nobel in medicina nel 1984.

METODI IMMUNOMETRICI: STORIA

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Caratteristiche fondamentali di un

anticorpo sono l’affinità (misurata in

termini chimico-fisici dalla costante di

equilibrio K) e la specificità (capacità di

riconoscere l’analita, distinguendolo da

molecole a struttura simile).Gli anticorpi

più comunemente utilizzati per lo sviluppo

di metodi immunometrici sono le

immunoglobuline G (IgG). La molecola, a

forma di “Y”, è composta da due catene

aminoacidiche leggere e due pesanti,

unite da ponti disolfuro. La regione

variabile Fab, che contiene gli N-

terminali delle 4 catene, è responsabile

del legame altamente specifico con

l’antigene, quella costante Fc, che

contiene i C-terminali, è specie specifica.

CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI (I)

catena pesante

catena leggera

variabile

costantelegam

e Ag

sito legam

e Ag

sito

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Pontidisolfuro

catena L

catena H

Digestione con Papaina

Digestione con

Pepsina

Riduzione con Mercaptoetanolo

catena L

catena H

frammenti Fc

Fab Fab

Fc

F(ab’)2

Sono stati messi a punto

diversi protocolli di

digestione delle IgG che

permettono di ottenere

specifiche porzioni della

immunoglobulina.

CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI (II)

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ICA epitopo

paratopo

CDR

antigene

ponte disolfuro intracatena

ponte disolfuro intercatena

frammento Fab

frammento Fc

frammento Fab

Catena H

Catena L

In dettaglio è mostrata la porzione Fab

dell’anticorpo, con il sito di legame con

l’antigene. Si può vedere come in questa

porzione dell’anticorpo, perfettamente

complementare all’antigene, siano presenti dei

gruppi funzionali che stabiliscono numerose

interazioni con l’antigene.

CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI (III)

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macrofago

AntigeneT-dipendente

T linfocita

B B

IgM IgE IgG

B linfocita

IgG

AntigeneT-indipendente

CLASSI DI IMMUNOGLOBULINE

IgG - anticorpi che tendono a durare molto a lungo, anche tutta la vita;IgM - durano poco tempo, e indicano un contatto recente con l'antigene;IgA - non si misurano nel sangue, ma sono presenti sulla superficie di alcuni organi, come per esempio gli alveoli polmonari;IgD - presenti sulla superficie dei linfociti B maturi;IgE - immunoglobuline che intervengono nei processi che regolano le reazioni allergiche (ipersensibilità nei confronti di vari antigeni, alimentari, ambientali, ecc.).

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INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO (I)

L’interazione antigene-anticorpo interessa porzioni limitate delle due molecole. Essa tuttavia si stabilisce su un’area relativamente estesa, attraverso la formazione di numerose interazioni deboli che nel complesso determinano un legame molto stabile.

Antigene Anticorpo

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ICA

Il legame antigene-anticorpo si

forma inizialmente grazie a ponti

ad idrogeno, che agiscono a

lunga distanza (10 nm). Le

molecole di acqua riempiono gli

spazi tra antigene ed anticorpo,

creando nuovi ponti ad idrogeno

e contribuendo a rafforzare il

legame. Successivamente si

stabiliscono numerose altre

interazioni deboli, tipo forze di

van der Waals, forze

elettrostatiche ed interazioni

idrofobiche. Queste interazioni si

stabiliscono su un’ampia regione,

per cui il legame risulta

complessivamente molto stabile.

INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO (II)

ANTIGENE ANTICORPO

Ponti idrogeno

Legamiionici

Interazioniidrofobiche

Interazionidi Van der Waals

Legami ionici

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INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO (III)

Forze non covalenti

Forze elettrostatiche

Legami idrogeno

Forze di Van der Waals

Forze idrofobiche

Origine

Attrazione tra cariche opposte

Lo ioni idrogeno condiviso tra gruppi diversi crea parziali cariche opposte

Le fluttuazioni delle nuvole elettroniche attorno alle molecole generano polarità opposte su atomi vicini

I gruppi idrofobici interagiscono sfavorevol-mente con l’acqua e tendono a raggrupparsi insieme per escludere le molecole di acqua. L’attrazione coinvolge anche forze di Van der Waals

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I polimeri sartoriali rappresentano un tentativo di costruire in laboratorio una molecola con le caratteristiche di avidità e selettività degli anticorpi naturali, ma più stabili in condizioni non fisiologiche e disponibili in quantità illimitata.

Si tratta di polimeri con tasche di legame selettive per l’analita. Essi sono preparati mediante un processo di polimerizzazione, nel quale l’analita viene utilizzato come stampo.

I polimeri sartoriali sono stati utilizzati per diverse applicazioni: metodi immunometrici, fasi stazionarie per cromatografia di affinità ed estrazioni in fase solida, sensori, catalisi, ecc..

POLIMERI “SARTORIALI” (I)

MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS

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Sintesi: l’analita viene miscelato con uno o più monomeri funzionali. In

opportune condizioni si forma un complesso stabile di pre-

polimerizzazione, che può essere basato su interazioni di tipo covalente

oppure non covalente. Il primo approccio è applicabile ad un numero

ristretto di analiti, mentre il secondo è più flessibile. La scelta dei

monomeri è critica per l’ottenimento di un polimero in grado di legare

con buona selettività ed affinità l’analita.

analita

monomerifunzionali

cross-linkercomplesso di

pre-polimerizzazioneanalita-monomeri

POLIMERI “SARTORIALI” (II)


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Successivamente, si inizia la polimerizzazione, che avviene grazie alla

presenza di un cross-linker. Anche la scelta del cross-linker e del

solvente nel quale far avvenire la polimerizzazione è critica per

l’ottenimento di un polimero con le caratteristiche morfologiche e

meccaniche migliori. Il polimero viene poi triturato e setacciato per

ottenere particelle del diametro desiderato. Infine l’analita viene rimosso.

Nel polimero rimangono delle tasche, le quali, per dimensioni, forma ed

orientamento di gruppi funzionali, sono in grado di alloggiare

selettivamente l’analita.

POLIMERI “SARTORIALI” (III)


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ICA Vantaggi:

• Avidità e selettività di legame confrontabili con quelle

degli anticorpi;

• Elevata stabilità fisica (stress meccanici, temperature e

pressioni elevate) e chimica (acidi, basi, solventi organici);

• Disponibili in quantità illimitate e stabili per lunghi periodi di

conservazione;

• Possibilità di utilizzare le particelle per impaccare delle

colonne per cromatografia di affinità.

POLIMERI “SARTORIALI” (IV)


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Svantaggi:

• poiché sono preparati in un solvente organico, il legame con

l’analita è ottimale in ambiente organico, non in un fluido

biologico;

• è molto difficile stabilire a priori quali siano il monomero, il cross-

linker, il solvente e le condizioni di polimerizzazione più adatti per

un determinato analita;

• il processo di triturazione e setacciatura per ottenere particelle di

polimero nell’intervallo dimensionale desiderato è lungo e

laborioso e comporta una grossa perdita di polimero (circa 50%);

• la rimozione dell’analita dopo la polimerizzazione non è completa.

POLIMERI “SARTORIALI” (V)


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Un anticorpo specifico per l’analita si ottiene immunizzando un animale da laboratorio con l’analita stesso. L’analita è in grado di stimolare una risposta immunitaria, quindi la produzione di anticorpi solo se ha una massa relativamente elevata (PM > 1000 Da) e in questo caso viene chiamato antigene, altrimenti deve essere coniugato con una macromolecola. La regione di antigene che si trova in contatto diretto con l’anticorpo è detta epitopo o determinante antigenico.

COME SI OTTIENE UN ANTICORPO

L’antigene viene somministrato

Dal siero dell’animale si possono purificare le IgG totali (ricche in IgG anti-antigene somministrato)

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• Poiché su un antigene sono presenti numerosi epitopi, mediante

l’immunizzazione di un animale da laboratorio si ottiene un antisiero

contenente una popolazione eterogenea di anticorpi, diretti verso i

diversi epitopi dell’antigene e caratterizzati da diverse affinità. Questi

anticorpi sono detti policlonali.

• È possibile ottenere anticorpi monoclonali, cioè una popolazione

omogenea di anticorpi diretti verso un unico epitopo. Per questo

occorre, dopo avere immunizzato il topo, isolare i diversi cloni di

cellule B e testarli per individuare l’anticorpo migliore. Poiché le

cellule B normalmente non crescono in coltura, esse devono essere

fuse con cellule di mieloma per ottenere ibridomi in grado sia di

crescere in coltura sia di produrre quantità illimitate di anticorpo.

ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI (I)

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PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI

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Antisiero policlonale Anticorpi monoclonali

IBRIDOMA: mantiene la capacità della cellule della milza di produrre anticorpi, associata alla vitalità della cellule di mieloma.

ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI (II)

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CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI

Vantaggi Svantaggi

Caratteriestiche (affinità e specificità) note e costanti

Potrebbero essere troppo specifici: (difficoltà nel legare forme diverse dell’antigene)

Sono sufficienti piccole quantità di antigene, anche impuro, per la loro produzione

Tecniche di produzione più sofisticate

E’ possibile selezionare l’anticorpo con la specificità desiderata

Non sempre reagiscono con la proteina A

Può essere prodotto in quantità illimitata ed è semplice da purificare

Non formano precipitato in seguito al legame con l’antigene

Solitamente caratterizzati da elevata specificità

Spesso caratterizzati da bassa affinità

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Un aptene è una molecola rigida e di piccole dimensioni (PM compreso tra 80 e 1000 Da) che può stimolare la produzione di anticorpi SOLO se accoppiata ad una proteina “carrier”, che ne aumenta la massa complessiva.

In questo caso, tuttavia, si ottiene una miscela di anticorpi, non tutti diretti contro l’aptene. Anche isolando un anticorpo monoclonale, è necessario accertare che l’anticorpo sia diretto proprio contro l’aptene.

ANTIGENI ED APTENI

anticorpi che riconoscono una parte di aptene ed una parte di

braccio spaziatore

anticorpi che riconoscono il carrier

anticorpi che riconoscono l’aptene

Sintesi derivato aptene

braccio spaziatore

aptene

carrier

+a) +

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naphtalene antracenefenantrene

acenaphtene

acenaphtylene

fluorene

pyrenecryseneBenzo[a]anthracene

Benzo[a]pyrene dibenzo[a,h]anthracene

fluorantene

Benzo[e]pyrene

Benzo[k]fluoranthene

Benzo[b]fluorantene Indeno[1,2,3cd]pyrene Benzo[g,h,i]perylene

ANTIGENI ED APTENI

Esempio: reattività crociata di un anticorpo anti-benzo(a)pirene (BaP) verso altri idrocarburi policiclici aromatici

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Specificità e struttura immunogeno

Posizione e tipo di

derivato utilizzato per la produzione dell’anticorpo

100% 40% 100% 100%100%

Scarsa specificità per mancanza anche dell’anello aromatico

L’anticorpo è molto specifico per il BaP e gli altri IPA

non interferiscono

[BaP μg/L

Seg

nal

e

0.001 0.01 0.1 1 10

Una caratteristica fondamentale dell’anticorpo è la sua specificità (capacità di legare selettivamente l’analita, distinguendolo da altre molecole di struttura simile). Si definisce reattività crociata la tendenza dell’anticorpo a legare gli interferenti.

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Tipo di derivato e specificità dell’Anticorpo

Braccio spaziatore

aptene

proteina

HO

O

estrone

estrioloHO

OH

OH

HO

OH

C16

C17

Esempio: 17β-Estradiolo

proteina

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Esempio: produzione di un anticorpo anti-estradiolo.

estradiolo

HO

OH

C6

C16

C17

SPECIFICITA’ DEGLI ANTICORPI (II)

estrioloHO

OH

OH

HO

O

estrone

3,8 1,2 %

5,6 2,0 %

48 8 %

Reattività crociata

40 10 %

5,0 1,8 %

0,48 0,27 %

estrone estriolo

C6

C16

C17

Derivatizzazione

La reattività crociata verso altri ormoni steroidei varia in funzione della posizione di derivatizzazione dell’aptene scelta per la sintesi dell’immunogeno.

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Metodi immunologici per ioni metallici

• Si produce un anticorpo contro un chelate metal-ion -protein: per esempio Me-EDTA-BSA

L’anticorpo non riconosce il metallo ma l’intero complesso Me-EDTA

MeҮ

Me + EDTA

proteina

GSH

Me

Ү• Si produce un anticorpo contro un

complesso Me-Proteina o Me-Molecola organica:

Il GSH , i suoi gruppi tiolici liberi legano fortemente il Hg(II).L’Anticorpo riconosce il complesso Me-GSH

Me + GSH

proteina

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Il legame tra analita (An) ed anticorpo (Ab) può essere descritto dall’equilibrio:

dove An-Ab è il complesso analita-anticorpo, ka e kd sono le costanti di

velocità di associazione e dissociazione del complesso e Keq è la

costante di equilibrio del processo ed è una misura dell’affinità dell’anticorpo per l’analita, cioè della forza del legame An-Ab. L’unità di misura per Keq è L mol-1. Anticorpi con Keq 108-109 L mol-1 sono adatti

per lo sviluppo di metodi immunometrici.

Ab An+ An-Abka

kd

Keq =[An-Ab]eq

[An]eq[Ab]eq

ka

kd

=

ASPETTI TERMODINAMICI

INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO

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L’affinità dell’anticorpo per l’analita può essere determinata graficamente mediante diagramma di Scatchard. Sperimentalmente, occorre incubare quantità crescenti di analita con una quantità fissa di anticorpo e misurare all’equilibrio la concentrazione dell’ analita libero e quella dell’antigene legato.

Riprendendo l’equazione:

[An-Ab]eq

[An]eq

= Keq Abt - Keq [An-Ab]eq

SCATCHARD PLOT (I)

si definisce Abt = [Ab]eq + [An-Ab]eq (concentrazione totale di anticorpo). Riarrangiando l’equazione ed introducendo Abt si ottiene:

Keq =[An-Ab]eq

[An]eq[Ab]eq

ka

kd

=

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[An-Ab]eq

[An]eq

= Keq Abt - Keq [An-Ab]eq

Rappresentando [An-Ab]/[An] (rapporto tra analita legato ed analita libero,

cioè bound/free) rispetto ad [An-Ab] (bound) si ottiene un diagramma di

Scatchard, dove la pendenza è – Keq, l’intercetta sull’asse y è KeqAbt e

l’intercetta sull’asse x è Abt.

SCATCHARD PLOT (II)

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Il diagramma di Scatchard corrispondente ad un anticorpo monoclonale è una retta, dove:• pendenza = - Keq

• intercetta sull’asse x = Abt.

Il diagramma di Scatchard corrispondente ad un anticorpo policlonale, cioè una classe eterogenea di anticorpi con diversa Keq, è curvilineo, in quanto deriva dalla sovrapposizione di di-versi processi di associa-zione antigene-anticorpo, ciascuno caratterizzato dalla propria Keq. Per questo sistema si può calcolare una K apparente.

High affinity

Low affinity

Abt

Keq

SCATCHARD PLOT (III)

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[An-Ab]

[An

-Ab

]/[A

n]

Retta 1

Retta 2

Per un diagramma di Scatchard curvilineo si possono individuare le rette corrispondenti alla Keq massima ed alla Keq minima.

La retta 1 viene estrapolata per [An-Ab]eq che tende a zero.

La retta 2 viene estrapolata per [An-Ab]/[An]eq che tende a zero.

EFFETTI DELL’ETEROGENEITA’ DELL’ANTICORPO

La Keq massima a minima danno informazioni sull’anticorpo:

• eterogeneità (differenza tra le due Keq);

• specificità (gli anticorpi con Keq vicina alla Keq minima sono quelli con minore specificità e si possono cercare strategie per minimizzare il loro effetto).

SCATCHARD PLOT (IV)

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TRACCIANTI (I)

En + S EnS En + P

L’interazione enzima-substrato si autorivela attraverso la formazione del prodotto o scomparsa del substrato che hanno proprietà chimiche diverse

La formazione del complesso An-Ab non è sempre direttamente misurabile

La reazione è difficilmente rivelabile se non sfruttando le diverse proprietà fisiche del complesso An-Ab rispetto ad An liberoPer esempio: differenze di massa misurabili con biosensori piezoelettrici o diverse proprietà ottiche misurabili con il sistema Biacore

E’ più pratico utilizzare un tracciante cioè un reattivo che, partecipando alla reazione An-Ab in opportune condizioni, ne permetta la rivelazione sensibile

An + Ab An-Ab

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TRACCIANTI (II)

La formazione del complesso An-Ab viene solitamente misurata sfruttando un approccio indiretto, introducendo un tracciante, legato all’antigene o all’anticorpo, che partecipando alla reazione immunologica, la evidenzia con alta rivelabilità.

1 2 3

aggiunta reattivi

reazione

separazione liberolegato

analita

tracciante

Conc. analita

Tracciante legato

0 4 162

41

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Tra le molecole facilmente rivelabili si può utilizzare:

• un radioisotopo (radioimmunoassay, RIA)

• un enzima (enzyme immunoassay, EIA)

• un substrato enzimatico

• un coenzima o un inibitore enzimatico

• una molecola fluorescente o un quencher

Il tracciante deve essere una molecola caratterizzata da un elevato

rapporto segnale/massa.

Questo permette di ottenere un segnale altamente rivelabile anche

in presenza di piccole quantità di tracciante, quindi di fare avvenire la

competizione in presenza di poche molecole, abbassando il limite di

rivelazione del metodo.

TRACCIANTI (III)

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SCELTA DEL TRACCIANTE (I)

Amplificazione enzimatica:1 molecola di enzima

1000 molecole di prodotto

Aumenta con:- attività enzimatica- rivelabilità del prodotto- amplificazione ciclica

Luminescenza

Analita—Enzima

Substrato

Prodotto

FotometriaFluorescenza

Analita—125I

emissione

1 disintegrazione/sec

molecole (106)

Analita—Chemilum.

Reaz. chimica

Ic h

Ic aumenta con: cl (resa quantica)f (rapporto molecole chemilum/analita)

Ic = f ccl cl

Analita—Fluoroforo

I0 h

If h’

If aumenta con: I0 (intensità del raggio di eccitazione) (coefficiente di estinzione)c (concentrazione)

If = I0 F cd

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Il tracciante deve essere presente nel tubo ad una massa estremamente bassa (10-12-10-20 g) e facilmente rivelabile

TRACCIANTE: LIMITE DI RIVELAZIONETRACCIANTE: LIMITE DI RIVELAZIONE

SCELTA DEL TRACCIANTE (II)

10-16 – 10-18I emissioneMolecola chemiluminescente

10-15 – 10-16I fluorescenteMolecola fluorescente

10-20 – 10-21Amplificazione ciclica enzimatica

10-15 – 10-18Fluorescenza

10-16 – 10-18Luminescenza

10-15 – 10-16AssorbanzaEnzima

0.1 – 10 x 10-15≈ 10.000 dpm125I

MASSA (moli/tubo)SEGNALETRACCIANTE

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

SCELTA DEL TRACCIANTE (III)

TRACCIANTI LUMINESCENTITRACCIANTI LUMINESCENTI

10-20 moli (Bronstein et al. 1989)Fosfatasi alcalina/ adamantil-1,2-diossietano-fenil-fosfato

10-18 moli (Tsuji et al. 1986)Glucosio 6-fosfato deidrogenasi / perossidasi / isoluminolo

< 10-15 moli (Kricka et al. 1987)

8x10-17 moli (Motsenbocker 1988)

Perossidasi / luminolo / enhancer

Enzima: chemiluminescenza

10-13 moli (Woodhead et al. 1982)Fluorescina

2x10-17 moli (Soini e Kojola 1983)Ioni europio (III)Fluorescenza

10-19 moli (Geiger e Miska 1987)

10-19 moli (Tanaka e Ishikawa 1986)

Luc / luciferina con amplificazione enzimatica

5.6x1016 fotoni/min/mg luciferasi (attività specifica) (Wulff et al. 1982)

10-18-10-19 moli (Schram et al. 1981)

Luciferasi da lucciola (Luc) / luciferina

Bioluminescenza

Limite di rivelazioneEsempiTipo di tracciante

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Perché è vantaggioso utilizzare un enzima come marcatore per la sintesi di un tracciante?

L’attività catalitica dell’enzima permette di amplificare il segnale analitico (un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto). Il limite di rivelazione del metodo è quindi significativamente inferiore rispetto ai metodi basati sull’uso di substrati enzimatici o molecole fluorescenti o chemiluminescenti come marcatori.

E

S

La molecola di substrato utilizzata come marcatore produce una sola molecola di prodotto per ogni molecola di tracciante

L’enzima utilizzato come marcatore produce molte molecole di prodotto per ogni molecola di tracciante

METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) (I)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Perché è possibile utilizzare un enzima come marcatore?

E’ lecito chiedersi se un piccolo aptene (0,3-1 kDa) chimicamente legato ad un

enzima (40-100 kDa), non sia impedito nel legame all’anticorpo a causa di un forte

ingombro sterico. Tuttavia, visto che l’anticorpo è stato prodotto utilizzando come

immunogeno l’aptene coniugato con una proteina carrier (60-100 kDa), è molto

probabile che gli anticorpi riescano a legare l’aptene anche nella molecola di

tracciante.

La sintesi dell’immunogeno viene eseguita in modo da ottenere un elevato

rapporto di coniugazione aptene/proteina e quindi esporre numerose molecole

di aptene sulla superficie dell’immunogeno;

la sintesi del tracciante enzimatico viene condotta in modo

da ottenere un basso rapporto di coniugazione

aptene/proteina e quindi un elevato rapporto

segnale/massa, che produce

un limite di rivelazione del

metodo più basso.

E

METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) (II)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Un enzima ideale per lo sviluppo di un EIA deve essere:

• sufficientemente stabile nel tempo nelle condizioni di conservazione

• sufficientemente attivo dopo la coniugazione con l’antigene o

l’anticorpo e nelle condizioni sperimentali di esecuzione dell’EIA.

METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) (III)

Un parametro estremamamente importante è l’attività specifica

dell’enzima (attività per unità di peso dell’enzima), che generalmente

si esprime in unità per mg (U/mg).

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Vantaggi relativi all’uso di enzimi:

• sono facilmente reperibili in forma pura, relativamente economici e stabili;

• sono disponibili numerose metodiche semplici ed automatizzabili per la misura dell’attività enzimatica;

• una molecola di enzima può produrre moltissime molecole di prodotto;

• è possibile ottenere la modulazione dell’attività enzimatica in seguito al legame con l’anticorpo, permettendo lo sviluppo di EIA omogenei.

Svantaggi relativi all’uso di enzimi:

• l’attività enzimatica può variare in funzione della temperatura o della presenza di interferenti;

• la coniugazione chimica dell’enzima può ridurne l’attività specifica;

• si può avere rumore di fondo dovuto alla presenza di enzima nel campione.

METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) (IV)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

• L’attività enzimatica viene misurata valutando la velocità della reazione

enzimatica in condizioni di eccesso di substrato. Si può scegliere di misurare

la velocità di scomparsa del substrato o quella di comparsa del prodotto. Il

secondo metodo è preferibile poiché la misura è più accurata (ad es. da 0 a

1% per la comparsa del prodotto, da 100% a 99% per la scomparsa del

substrato), soprattutto considerando che occorre lavorare in condizioni di

eccesso di substrato.

• La velocità di una reazione enzimatica si esprime come quantità di substrato

trasformato nell’unità di tempo.

• La misura del prodotto della reazione enzimatica è proporzionale alla

concentrazione dell’enzima se:

- l’andamento della reazione è lineare nel tempo

- l’attività enzimatica è proporzionale alla quantità assoluta di enzima.

MISURA DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA (I)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Tempo

μm

ol

di

pro

do

tto

fo

rmat

o

x nmol di enzima

2x nmol di enzima

4x nmol di enzima

10 min 20 min

90

170

250

La comparsa del prodotto in un tempo lungo (10 o 20 minuti) non è proporzionale alla quantità di enzima.

Occorre quindi considerare la velocità iniziale della reazione.

MISURA DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA (II)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Secondo l’equazione di Michaelis-Menten:

mmax K]S[

]S[VV

V velocità della reazioneVmax velocità massima della reazione (enzima saturato dal substrato)[S] concentrazione del substratoKm costante di Michaelis-Menten

Se [S] >> Km, ne consegue che V = Vmax, quindi:

tempo

prod

otto

1

2

3

Quantità di enzima

velo

cità

iniz

iale

del

la

reaz

ione

3

2

1

MISURA DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA (III)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

La misura dell’attività enzimatica viene comunemente effettuata utilizzando un

substrato che viene trasformato dall’enzima in prodotto colorato, il quale viene

poi misurato tramite fotometria. L’uso di substrati fluorescenti o luminescenti

permette di ridurre il limite di rivelazione del metodo.

TRACCIANTI ENZIMATICI

Luminescenza2-naphthyl--D-galactopyranoside

Fluorimetria4-metilumbelliferone

Fotometria2-nitrofenolo-galattosidasi

LuminescenzaAMPPD

Fluorimetria4-metilumbelliferone-fosfato

Fotometria4-nitrofenilfosfatoFosfatasi alcalina

LuminescenzaH2O2/luminolo

FotometriaH2O2/cromogenoPerossidasi

METODOLOGIA ANALITICASISTEMA DI RIVELAZIONEENZIMA

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

ENZIMA

SUBSTRATO

PRODOTTO

L’enzima trasforma il substrato incolore in un prodotto colorato, cioè capace di assorbire la luce nel visibile.

L’enzima trasforma il substrato incolore in un prodotto colorato, cioè capace di assorbire la luce nel visibile.

I0 I

b

0I

IT bc

T

1logA

c

A

FOTOMETRIA (I)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA ENZIMA

SUBSTRATO

PRODOTTO

o-fenilendiammina 2,3-diamminofenazina (DAP)arancio max=492 nm

perossidasi

H2O2

FOTOMETRIA (II)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Il rendimento quantico di fluorescenza molecolare è il rapporto tra il

numero di molecole che emettono la fluorescenza ed il numero totale di

molecole eccitate (o il rapporto tra fotoni emessi e fotoni assorbiti):

dove Rf è la velocità di rilassamento fluorescente e Rr è la velocità di

rilassamento non-radiativo.

ENZIMA

SUBSTRATO

PRODOTTO

L’enzima trasforma il substrato non fluorescente in un prodotto fluorescente.

L’enzima trasforma il substrato non fluorescente in un prodotto fluorescente.

La fluorescenza è un processo di emissione in cui le molecole sono eccitate

dall’assorbimento di una radiazione elettromagnetica. Le specie eccitate,

successivamente, ritornano allo stato fondamentale emettendo l’energia in

eccesso sotto forma di fotoni.

RrRf

Rf

FLUORESCENZA (I)

FA

CO

LT

A’

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SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Assorbimentomolecolare

l1 l5

En

erg

ia

l1’ l5’

Conversioneinterna

Rilassamentovibrazionale

Fluorescenza

Diagramma energetico parziale di una specie molecolare ipotetica

(diagramma di Jablonski)

FLUORESCENZA (II)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Con il termine chemiluminescenza si indica il fenomeno di conversione

di energia chimica in radiazione luminosa, di lunghezza d'onda variabile

dall'ultravioletto all'infrarosso comprendendo tutto il campo del visibile.

La specie “Intermedio” deve essere molto ricca di energia, in modo da

potersi decomporre formando almeno un prodotto in uno stato eccitato.

Siccome le reazioni di ossidazione con l'ossigeno molecolare sono molto

esoergoniche, esse sono fra le reazioni chemiluminescenti più comuni.

CHEMILUMINESCENZA (I)

Reagenti Intermedio [ Prodotti ]* Prodotti + hstadio 1 stadio 2 stadio 3

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

L'efficienza di un processo di chemiluminescenza, CL, è definita dalla relazione:

CL = fotoni emessi

molecole reagenti

Se Int = resa dello stadio 1 (formazione dell'Intermedio),

SE = resa dello stadio 2 (formazione dei Prodotti nello stato eccitato)

Em = resa quantica dello stadio 3 (emissione di fotoni)

l' efficienza del processo di chemiluminescenza è: CL = IntSEEm

Poiché la resa di ciascuno stadio del processo é minore di 1, la resa quantica

dell'intero processo di chemiluminescenza é sicuramente minore di 1. I valori

di resa quantica dei più comuni processi di chemiluminescenza in genere non

superano il valore 0,1.

CHEMILUMINESCENZA (II)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Ossidazione del luminolo (3-aminoftalidrazide) in ambiente alcalino mediante perossido d’idrogeno o altri agenti ossidanti, quali i perossidi organici.

+ N2 + H2O + h

NH2

COOH

COO-catalizzatore

H2O2, OH-

NH2

NHNH

O

O

La reazione può essere catalizzata da enzimi quali la perossidasi, la

microperossidasi e le catalasi, nonché da altre sostanze quali emoglobina,

citocromo c, ione Fe3+ e vari complessi di metalli di transizione. Il prodotto di

ossidazione del luminolo é l'anione amminoftalato nello stato eccitato, che é

responsabile dell’emissione (max = 420 nm).

L'utilizzo di "enhancer" quali il p-iodofenolo ha permesso di aumentare

l’intensità del segnale di alcuni ordini di grandezza e di ottenere una cinetica

di emissione più lenta e stabile nel tempo.

CHEMILUMINESCENZA (III)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

La reazione del luminolo può essere utilizzata per la misura dell’attività del tracciante enzimatico perossidasi, operando in eccesso di substrato.

+ N2 + H2O + h

NH2

COOH

COO-catalizzatore

H2O2, OH-

NH2

NHNH

O

O

In alternativa, è possibile utilizzare il luminolo come tracciante. Sono stati sintetizzati derivati isoluminolo-antigene o isoluminolo-anticorpo.

NHNH

NH

O

O

CONH

NHHN

O

OHS

NNH

NH

O

O

(CH2)6CH2CONHOCH2NHCOProtein

Biotina-isoluminolo

Proteina-isoluminolo

Generalmente è preferibile utilizzare l’enzima come marcatore, ottenendo così:

• l’amplificazione del segnale• una cinetica di emissione

caratterizzata da uno stato stazionario.

CHEMILUMINESCENZA (IV)

FA

CO

LT

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SC

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ZE

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. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Decomposizione dell'adamantil-1,2-diossietano-fenil-fosfato (AMPPD) catalizzata dall'enzima fosfatasi alcalina (AP) in ambiente acquoso.

L'AMPPD, che contiene un anello di tipo diossietano, viene defosforilato in presenza dell'enzima. Il prodotto della reazione si scinde in due frammenti carbonilici, uno dei quali é in uno stato eccitato e può dare luogo a luminescenza.

+

O-

COOMeOO O

OMe

O-

AP

O OOMe

OPO3--- HPO4--

*

*

O-

COOMe

+ AE

O-

COOMe

+ AE* + AE + h

O-

COOMe

CHEMILUMINESCENZA (V)

FA

CO

LT

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SC

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ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

I metodi immunometrici possono essere classificati in:se

gnal

e

log concentrazione analita

Competitivi (a modulazione di attività, AM). Si basano sulla modulazione del

segnale analitico dovuta alla competizione tra le molecole di analita e quelle

del tracciante per un numero limitato di siti anticorpali. Il segnale analitico

diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita presente nel campione,

la curva dose-risposta ha forma sigmoidale.

segn

ale

concentrazione analita

Non competitivi (ad amplificazione di attività, AA), tutto l’analita presente nel

campione viene catturato dall’anticorpo in eccesso e rivelato. Il segnale analitico

è direttamente proporzionale alla concentrazione di analita nel campione, la

curva dose-risposta è lineare.

CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI (I)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

I metodi immunometrici possono essere distinti in:

Eterogenei (su fase solida). Il metodo di rivelazione non permette di

distinguere tra tracciante legato all’anticorpo e tracciante libero. Questi metodi

necessitano di una separazione della frazione libera da quella legata prima

della misura, quindi prevedono l’immobilizzazione di un componente (antigene

o anticorpo) su una fase solida; in alternativa si può procedere mediante

precipitazione del complesso antigene-anticorpo utilizzando glicole

polietilenico o un secondo anticorpo in eccesso.

Omogenei. Il legame del tracciante all’anticorpo ne modula (aumenta o

riduce) l’attività. Questi metodi non necessitano della separazione della

frazione libera da quella legata e quindi sono eseguiti in fase liquida.

CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI (II)

FA

CO

LT

A’

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ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

CARATTERISTICHE DEIMETODI OMOGENEI ED ETEROGENEI

CARATTERISTICHE DEIMETODI OMOGENEI ED ETEROGENEI

CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI (III)

Metodi eterogenei

Poco sensibile all’interferenza della matrice del campione

Molto sensibile all’interferenza della matrice del campione

Ampio ambito dinamico del metodo

Ambito dinamico del metodo inferiore

Bassi limiti di rivelazioneLimiti di rivelazione più elevati

Difficili da automatizzarePossono essere automatizzati facilmente

Esecuzione del metodo più complicata

Esecuzione semplice e rapida

Metodi omogenei

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (I)IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (I)

Fisica (adsorbimento)Chimica

Biotina-avidina Proteina A Anticorpo

IgG anti-coniglio (Fc specifico) da

capra

IgG anti-analita da coniglio

METODI ETEROGENEI (I)

FA

CO

LT

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SC

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ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (II) ADSORBIMENTO FISICO

IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (II) ADSORBIMENTO FISICO

Fisica (adsorbimento)

L’adsorbimento passivo dell’anticorpo sulla fase solida avviene mediante interazioni idrofobiche. Il processo è influenzato da: pH (deve essere vicino al punto isoelettrico dell’anticorpo, in modo che la carica elettrica della molecola

tenda a zero); forza ionica (la presenza di sali, che neutralizzano le cariche elettriche, favorisce le interazioni idrofobiche); temperatura (l’aumento della temperatura favorisce la diffusione, quindi rende il processo più rapido); tempo (in genere qualche ora è sufficiente, a temperatura ambiente); concentrazione proteica (se è troppo elevata si formano strati proteici multipli, con conseguente ridotta capacità legante e stabilità, se è troppo bassa si osservano interazioni aspecifiche dell’antigene con la fase solida, le quali tuttavia possono essere note-

volmente ridotte saturando la superficie libera del tubo con una proteina (BSA) o un polimero (PVP).

METODI ETEROGENEI (II)

FA

CO

LT

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SC

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ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

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NA

LIT

ICA

Proteine legate

g/sfera

Aspecifici

%

Riproducibilità

mediaDS

Capacità legante

%

polistirene 1.5 < 2 800 68 50-60

idrazide 2.6 14 700 150 25-30

alchilammina 2.8 15 860 165 28-38

METODI ETEROGENEI (III)

METODI DI IMMOBILIZZAZIONE DI UN ANTICORPO SU POLISTIRENE

METODI DI IMMOBILIZZAZIONE DI UN ANTICORPO SU POLISTIRENE

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (III) MEDIANTE ANTICORPO

IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (III) MEDIANTE ANTICORPO

Anticorpi di cattura Fc specifici

Gli anticorpi anti-analita sono orientati in maniera ottimale per

legare l’antigene

Anticorpi di cattura Fab specifici

Gli anticorpi anti-analita non sono in grado di legare l’antigene

METODI ETEROGENEI (III)

FA

CO

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ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Aggiunta del campione

Aggiunta del tracciante

Incubazione

Lavaggio

Aggiunta del substrato

Misura del segnale

Fase solida

Anticorpo immobilizzato

Antigene

Tracciante

Enzima

Substrato enzimatico

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTIELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTI

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (I)

FA

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IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA



Incubazione

Lavaggio


Misura del segnale

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (II)


FA

CO

LT

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SC

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ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA



Incubazione

Lavaggio


Misura del segnale

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (III)


FA

CO

LT

A’

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ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA



Incubazione

Lavaggio


Misura del segnale

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (IV)


FA

CO

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ZE

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. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA



Incubazione

Lavaggio


Misura del segnale

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (V)


FA

CO

LT

A’

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SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA



Incubazione

Lavaggio


Misura del segnale

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (VI)


FA

CO

LT

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IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA



Incubazione

Lavaggio


Misura del segnale

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (VII)


FA

CO

LT

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SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

1 2 3

aggiunta reattivi

reazione

separazione liberolegato

analita

tracciante

Conc. analita

Tracciante legato

0 4 162

41

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (VIII)

Metodo immunometrico competitivo eterogeneo: il legame dell’analita all’anticorpo viene rivelato indirettamente attraverso la misura del legame del tracciante all’anticorpo.

FA

CO

LT

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IEN

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FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Analita liberoAnalita

immobilizzatoAnticorpo anti-analita

EAnticorpoanti-IgG marcato

EE

Aggiunta antigene e anticorpo

E

E

Aggiunta dell’anticorpo marcato

E

E

E

Substrato Segnale

Competizione per il sito anticorpale

Separazione

Misura dell’attività enzimatica

E

E

E

E E

Separazione

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (VIII)

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) INDIRETTIELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) INDIRETTI

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Per sviluppare un metodo competitivo per un aptene occorre coniugare

l’aptene:

• ad una proteina carrier per la produzione dell’immunogeno

• ad un enzima per la produzione del tracciante.

Occorre quindi sintetizzare un derivato dell’aptene, in modo da:

• introdurre nell’aptene un gruppo reattivo in grado di reagire con le

proteine

• introdurre il gruppo reattivo sull’aptene al termine di un braccio

spaziatore, in modo che l’aptene venga poi inserito ad una certa

distanza dalla superficie della proteina e possa liberamente essere

riconosciuto e legato dall’anticorpo.

SISTEMI OMOLOGHI ED ETEROLOGHI (I)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

• Nei sistemi omologhi lo stesso derivato dell’aptene viene utilizzato

per la sintesi dell’immunogeno e del tracciante.

• Nei sistemi eterologhi immunogeno e tracciante sono sintetizzati

utilizzando:

due apteni simili ma non identici, con lo stesso ponte inserito

nella stessa posizione (eterologia di aptene);

lo stesso aptene, ma con un diverso ponte che unisce l’aptene

alla proteina (eterologia di ponte);

lo stesso aptene e lo stesso ponte, ma inserito in una posizione

differente dell’aptene (eterologia di posizione).

• I sistemi eterologhi permettono di ottenere anticorpi con affinità

maggiore per l’analita rispetto al tracciante, quindi di migliorare il

limite di rivelazione del metodo.

SISTEMI OMOLOGHI ED ETEROLOGHI (II)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

• Metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando traccianti

enzimatici che, in seguito al legame con l’anticorpo,

mostravano una variazione (aumento riduzione) della propria

attività catalitica.

• I primi metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando l’enzima

lisozima come tracciante, ma successivamente l’enzima

glucosio-6-fosfato deidrogenasi NAD dipendente (G6PD)

è stato ampiamente utilizzato, grazie alla sua maggior

capacità di modulare la propria attività catalitica in seguito

all’interazione con l’anticorpo.

METODI OMOGENEI COMPETITIVI (I)

EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (I)EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (I)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

S

S

P

• Il tracciante in soluzione è attivo• Diventa inattivo dopo legame con l’anticorpo• Il segnale aumenta all’aumentare della concentrazione di analita.

Sono stati proposti due sistemi.

conc. analita

attiv

ità e

nzim

atic

a


EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (II)EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (II)

1° sistema:

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

S

SP

conc. analita

attiv

ità e

nzim

atic

a


EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (III)EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (III)

• Il tracciante in soluzione è inattivo• Diventa attivo dopo legame con l’anticorpo• Il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita.

2° sistema:

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

• L’efficienza dell’assorbimento della luce da parte di un fluoroforo dipende dall’angolo tra il dipolo elettronico della luce eccitatrice e l’oscillatore nella molecola.

• Una luce polarizzata su un piano ecciterà in maniera efficiente solo quelle molecole che hanno i loro oscillatori orientati opportunamente (di solito parallelamente) rispetto al piano della luce eccitatrice. Se il fluoroforo è fermo, la luce emessa sarà parallela a quella assorbita.

luce assorbita luce emessa

fluoroforo

METODI OMOGENEI COMPETITIVI (II)

Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (I)Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (I)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

• Il grado di polarizzazione della radiazione emessa dipende dal tempo di emivita dello stato eccitato ( ) e dal movimento rotatorio della molecola.

• Se il tempo richiesto al fluoroforo per ruotare è confrontabile con , esso cambierà posizione prima di emettere fluorescenza e quindi la luce emessa perderà parzialmente o completamente la polarizzazione.

fluoroforo fisso fluoroforo libero di ruotare

La polarizzazione viene mantenuta La polarizzazione viene persa


Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (II)Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (II)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Per eseguire la misura, il campione viene eccitato alternativamente con luce polarizzata orizzontalmente e verticalmente.

Il grado di polarizzazione (P) viene calcolato come:

HVVV

HVVV

II

IIP

dove:

IVV = segnale quando si misura l’emissione sul piano parallelo a quello di

eccitazione (si eccita sul piano verticale, si misura sul piano verticale).

IHV = segnale quando si misura l’emissione sul piano perpendicolare a quello di

eccitazione (si eccita sul piano orizzontale, si misura sul piano verticale).


Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (III)Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (III)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA A valori costanti di (tempo di emivita dello stato eccitato) il grado di

polarizzazione della radiazione emessa dipende solo dal tempo di rilassamento

rotazionale della molecola ().

= 3vM / RT

dove è la viscosità del mezzo, v è il volume specifico parziale (mL/g) ed M è il

peso molecolare del fluoroforo, R è la costante dei gas e T è la temperatura.

Maggiore è il peso molecolare del fluoroforo, maggiore sarà il suo tempo di

rilassamento rotazionale (~ 4,3 nsec per la fluorescina e ~ 100 nsec per una

immunoglobulina).


Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (IV)Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (IV)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

La relazione che lega il grado di polarizzazione (P) al tempo di rilassamento

rotazionale della molecola () ed al tempo di emivita dello stato eccitato () è:

(1/P – 1/3) = (1/P0 – 1/3)(1 + 3/)

dove P0 è il valore di polarizzazione limitante, cioè il massimo grado di

polarizzazione che si ottiene quando tutte le molecole sono ferme nello spazio.

Combinando questa equazione con la precedente:

1/P = 1P0 + {1/P0 – 1/3} x RT/vM x

Il valore di polarizzazione misurato fornisce quindi una misura diretta delle

dimensioni del fluoroforo a temperatura e viscosità costanti.


Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (V)Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (V)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Una grossa molecola (anticorpo) ha un tempo di rotazione di circa 100 ns,

mentre una piccola molecola (farmaco) di circa 1 ns.

Metodi immunometrici competitivi omogenei sono stati sviluppati utilizzando

traccianti fluorescenti e sfruttando la possibilità di distinguere tra tracciante libero

in soluzione e tracciante legato all’anticorpo mediante misure di fluorescenza

polarizzata.

Il tracciante legato all’anticorpo

mantiene un grado di

polarizzazione maggiore rispetto

al tracciante libero. Si può quindi

ottenere una curva dose-risposta

senza la necessità di separare la

frazione di tracciante libero da

quello legato prima della misura.


Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (VI)Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (VI)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

S

S

P1

P1

P2

In presenza di piccole quantità di

analita, il tracciante interagisce

con l’enzima immobilizzato

sull’anticorpo, che trasforma P1

in un prodotto misurabile (P2).

S

S P1Q

P1

In presenza di elevate quantità di

analita, il tracciante, che non si lega

all’anticorpo, interagisce con un

enzima in soluzione che trasforma

P1 in un prodotto non misurabile (Q).

Questo riduce il segnale di fondo.

L’analita compete con il tracciante per i siti anticorpali. L’anticorpo è coniugato ad

un enzima.

METODI OMOGENEI COMPETITIVI (III)

ECIA (Enzyme Channeling Immuno Assay)ECIA (Enzyme Channeling Immuno Assay)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

La misura della quantità di analita An è basata sulla competizione con il tracciante

An* per un numero limitato di siti anticorpali (Ab). Riducendo la concentrazione

dell’anticorpo e del tracciante è possibile ottenere un limite di rivelazione più basso.

Tuttavia, per la legge di azione di massa, a basse concentrazioni di reagenti la

velocità di formazione del complesso si riduce, quindi l’accuratezza del metodo

sarà inferiore.

L’equilibrio che si instaura è:

An + Ab An-Ab

+An*

An*-Ab

KAn

KAn*

Le condizioni per l’esecuzione del metodo sono:

[An*]i = costante

[Ab]i = costante

[Ab]i < [An]i + [An*]i

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI (I)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

segn

ale


Per i metodi competitivi, il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita.

segn

ale


PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI (II)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Ab An+ An-AbKa

KdDove:

[Ab]eq = concentrazione di anticorpo libero all’equilibrio

[An]eq = concentrazione di analita libero all’equilibrio

[An-Ab]eq = concentrazione di complesso analita-anticorpo all’equilibrio

Si indica con:

Abt = concentrazione totale di anticorpo = [Ab]eq + [An-Ab]eq

T = concentrazione totale di analita = [An]eq + [An-Ab]eq ovvero = [An]i + [An*]i

(dove An è l’analita nel campione e An* è l’analita marcato)

R = [An-Ab]eq/T, cioè frazione di analita legato. Questa è la variabile che viene

di solito determinata nei metodi immunometrici.

PARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE DI UN METODO COMPETITIVO (I)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

che può essere risolta per R (frazione di analita legato) in funzione di [An]i,

[An*]i, Abt e K. Se tre di queste variabili sono costanti, è possibile osservare

l’effetto della quarta sull’andamento di R.

PARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE DI UN METODO COMPETITIVO (II)

si può scrivere come:

Keq =[An-Ab]eq

[An]eq[Ab]eq

Keq =[An-Ab]eq

(Abt-[An-Ab]eq) (T-[An-Ab]eq)

dividendo per T e sapendo che [An-Ab] = RT:

Keq =R

(Abt-RT) (1-R)

poiché T = [An]i+[An*]i

e riarrangiando:Keq (1<-R) (Abt-R[An]i-R[An*]i) = R

R2 - R + = 0([An]i+[An*]i+Abt+1/K)

([An]i+[An*]i)

Abt

([An]i+[An*]i)si ricava l’equazione:

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

EFFETTI DELLE CARATTERISTICHE DELL’ANTICORPOEFFETTI DELLE CARATTERISTICHE DELL’ANTICORPO

• Una riduzione di Abt sposta la curva a concentrazioni di analita più basse, ma a scapito della sensibilità (confronto tra curve verde e blu).

• Un aumento di K aumenta la sensibilità (confronto tra curve blu e rossa).

K=1010 L mol-1

Abt=10-10M

K=1010 L mol-1

Abt=10-9M

K=1010 L mol-1

Abt=10-10M

K=1010 L mol-1

Abt=10-9M

K=1011 L mol-1

Abt=10-10M

K=1011 L mol-1

Abt=10-10M

K=1010 L mol-1

Abt=10-10M

Concentrazione di antigene nel campione, [An] (M)

Curve teoriche di legame per un metodo

immunometrico competitivo

10-11 10-10 10-9 10-8 10-7

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

R,

fraz

ione

di a

ntig

ene

lega

toPARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE DI UN METODO COMPETITIVO (III)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

R,

fraz

ione

di a

ntig

ene

lega

to

Concentrazione di antigene nel campione, [An] (M)

An*=0

An*=10ng/mL

An*=30ng/mL

An*=100ng/mL

K=1010Lmol-1

Abt =3X10-10M

10-11 10-10 10-9 10-8

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

Una riduzione di An* aumenta la sensibilità del metodo.

EFFETTO DELLA VARIAZIONE DELLA CONC. DI TRACCIANTE An*EFFETTO DELLA VARIAZIONE DELLA CONC. DI TRACCIANTE An*

PARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE DI UN METODO COMPETITIVO (IV)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (I)

PROFILO DI IMPRECISIONE RELATIVO AD UNA CURVA DOSE-RISPOSTA SIGMOIDALE, OTTENUTO ASSUMENDO ASSENZA DI ERRORE DI INTERPOLAZIONE E COSTANZA DI ERRORE DI RISPOSTA (10%)

PROFILO DI IMPRECISIONE RELATIVO AD UNA CURVA DOSE-RISPOSTA SIGMOIDALE, OTTENUTO ASSUMENDO ASSENZA DI ERRORE DI INTERPOLAZIONE E COSTANZA DI ERRORE DI RISPOSTA (10%)

yA

yB

yC

xA xB xC

xA

xB

xC

xA xB xC

y = 10%

RIS

PO

ST

A

DOSE

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Le reazioni analita-anticorpo sono caratterizzate da elevata specificità,

definita come la capacità dell’anticorpo di legare selettivamente l’analita e non

altre specie (interferenti) simili.

La specificità dell’anticorpo non è sempre assoluta. Si definisce reattività

crociata la sua tendenza a legare gli interferenti. Tra i vari modi per

misurarla, quello più usato è la misura del rapporto percentuale tra la

concentrazione di analita che spiazza il 50% di tracciante dall’anticorpo e la

concentrazione di interferente che produce lo stesso effetto.

[An-

Ab]

/[A

n]

0

50

100

[An]a b

100xb

a%CR

SPECIFICITA’ DELL’INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPOSPECIFICITA’ DELL’INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (II)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

B/B

0


La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione

su una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard.

La curva viene prodotta rappresentando B/B0 (rapporto tra segnale dello

standard a concentrazione x e segnale ottenuto a dose zero di analita) in

funzione del logaritmo della concentrazione di analita.

B0 è il segnale ottenuto in assenza di

analita, cioè rappresenta il legame

massimo del tracciante alla fase

solida. B è il segnale a concentrazione

x di analita (solo una frazione di

tracciante è legato alla fase solida).

B/B0 rappresenta quindi la frazione di

tracciante che è stato spiazzato in

presenza della concentrazione x di

analita ed è compreso tra 0 e 1.

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (III)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

c

a

a/2

y

x

b = fattore di pendenza(*)

FUNZIONE LOGISTICA A TRE PARAMETRIFUNZIONE LOGISTICA A TRE PARAMETRI

b

cx

1

ay

x = dose y = B-N

a

c

a+d2

y

x

d

b = fattore di pendenza(*)

db

cx

1

day

x = dose y = B

L’introduzione del quarto parametro d (risposta a dose infinita) rende inutile la sottrazione del segnale di fondo N

FUNZIONE LOGISTICA A QUATTRO PARAMETRIFUNZIONE LOGISTICA A QUATTRO PARAMETRI

(*) il fattore di pendenza si riferisce alla linearizzazione logit-log

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (IV)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

LINEARIZZAZIONE DELLA CURVA DOSE-RISPOSTA DI UN METODO COMPETITIVO

LINEARIZZAZIONE DELLA CURVA DOSE-RISPOSTA DI UN METODO COMPETITIVO

TRASFORMAZIONE LOGIT/LOG

)B/B(1

B/Bln)B/B(itlog

0

0o

La trasformazione logit/log consiste nello “stiramento” della sigmoide che approssima la curva dose-risposta in uno spazio semilogaritmico e permette di linearizzare la porzione centrale della curva.

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (V)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Si utilizza un notevole eccesso di immunoreattivo in modo da

ottenere il massimo segnale dall’analita. Per la legge di massa la

velocità di formazione del complesso antigene-anticorpo è

proporzionale alla concentrazione dei reattivi. Ciò implica che anche

a bassissima concentrazione di analita un’alta frazione reagirà con

l’anticorpo in eccesso.

Seg

nale

Concentrazione analita

La curva dose-risposta ha un andamento lineare ed il segnale è direttamente proporzionale alla con-centrazione di analita.

METODI NON COMPETITIVI

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Reazione dell’analita (Ag) presente nel campione con un eccesso di anticorpo di cattura (Ab) e, successivamente, con un eccesso di tracciante (anticorpo di rivelazione marcato, Ab*)

[Ab] > [Ag] [Ab*] > [Ag]

L’analita deve essere una molecola relativamente grande, in grado di legare contemporaneamente due anticorpi

Eterogenei: separazione fisica tra Ab* e Ag-Ab* Omogenei: nessuna separazione tra Ab* e Ag-Ab*

Non Competitivi di Tipo “Sandwich”: rappresentano il tipo più diffuso di metodi non competitivi eterogenei

METODI NON COMPETITIVI

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA



Incubazione

Lavaggio


Misura del segnale

Fase solida

Anticorpo di cattura immobilizzato

Antigene

Tracciante

Enzima

Substrato enzimaticoAnticorpo dirivelazione

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA



Incubazione

Lavaggio


Misura del segnale


FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA


DIRETTI INDIRETTI

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA



Incubazione

Lavaggio


Misura del segnale

Fase solida

Antigene di cattura immobilizzato

Anticorpo

Tracciante

Enzima

Substrato enzimatico

Anticorpo specie-

specifico

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI

METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA



Incubazione

Lavaggio


Misura del segnale

METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

• Due anticorpi monoclonali diretti contro diversi epitopi dell’antigene vengono marcati con due enzimi scelti in modo che il prodotto della reazione catalizzata dal primo sia il substrato per il secondo (es. glucosio ossidasi e perossidasi).

• Solo quando i due anticorpi sono legati all’antigene gli enzimi sono

sufficientemente vicini per ottenere quantità misurabili del prodotto finale.

• In alternativa si possono marcare i due anticorpi con due subunità dello stesso

enzima, con un donatore ed un accettore di una coppia FRET (fluorescence

resonance energy trasfer), ecc...

substrato

prodotto intermedio prodotto

finale

METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI

SISTEMA INDICATORI

i1/i2

SUBSTRATI PRODOTTI

P1/ P1

Enzimi

vicinali

Esochinasi/

GPDasi

ATP/glucosio

NAD+

Glucosio 6-fpsfato

Gluconolattone-6-fosfato + NADH

Enzimi

vicinali

GOasi/

POasi

Glucosio/

Donatore H

ossidato

Perossido/

Donatore H

ossidato

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

METODI OMOGENEI NON COMPETITIVI

Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP)Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP)

Analita di grandi dimensioni: metodo non competitivo con tracciante=anticorpo marcato (meno utilizzato)

alta %P

anticorpo analitamarcato(in eccesso)

bassa %P

[analita]

%P

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione

su una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard.

La curva viene prodotta rappresentando il segnale ottenuto per ciascun standard

in funzione della concentrazione di analita nello standard. La curva ideale è

lineare.

In realtà la curva dose-risposta può presentare una curvatura a dosi basse di

analita a causa di un legame aspecifico ed una curvatura a dosi alte a causa

della saturazione dell’anticorpo di cattura o di rivelazione.

Seg

nale


Seg

nale


aspecifico

saturazione

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

Seg

nale


PARAMETRI QUANTITATIVI

Sensibilitàpendenza della curva

Intervallo dinamico

Limite di rivelazioneCalcolato in funzione della deviazione

standard del bianco

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

FF

. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

IOA

NA

LIT

ICA

EFFETTO DEI PARAMETRI SPERIMENTALI

Aumentare la costante di affinità dell’anticorpo

Migliorare la rivelabilità assoluta del tracciante (in questo caso il limite di rivelazione dipende direttamente da essa)

B/B

0


Riduzione del limite di rivelazione:

FA

CO

LT

A’

DI

SC

IEN

ZE

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. M

M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

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NA

LIT

ICA

CARATTERISTICHECARATTERISTICHE

Più rapidi, particolarmente a basse concentrazioni di analita.

L’utilizzo di anticorpi monoclonali migliora la specificità

Specificità intrinseca superiore

Limite di rivelazione più basso

Amplificazione di attività (AA)(Metodi non competitivi)

Modulazione di attività (MA)(Metodi competitivi)

METODI COMPETITIVI E NON COMPETITIVI (MA E AA)

FA

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M.

NN

. –

CH

IMIC

A B

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NA

LIT

ICA

I metodi immunometrici sono soggetti ad interferenze, soprattutto per

quanto riguarda la reazione immunologica e la rivelazione del segnale.

Le cause più comuni sono:

• la presenza nel campione di molecole che danno reazione

crociata con l’anticorpo o che interferiscono con la formazione del

complesso antigene-anticorpo o che competono con l’anticorpo

per il legame con l’antigene (es proteine del siero), ecc;

• la presenza nel campione di enzima endogeno (nel caso di EIA),

di molecole colorate o fluorescenti (nel caso di rivelazione

spettrofotometrica o fluorescente), ecc. Questo fenomeno può

essere notevolmente ridotto adottando un metodo eterogeneo,

grazie ai lavaggi effettuati prima della misura.

INTERFERENZE NEI METODI IMMUNOMETRICI

FA

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ICA

• Elevata specificità• Basso limite di rivelazione• Alta produttività analitica• Possibilità di automazione

Elevata specificità di riconoscimento tra Ag e Ab

Campioni fluidi (siero, urina, latte)

Campioni solidi (carne, matrici vegetali, tessuti)

VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI

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Impiego di traccianti, cioè reattivi biospecifici con elevato rapporto segnale/massa

Traccianti: Ag o Ab coniugati chimicamente con un marcatore (“label”)

Piccoli volumi di campione Piccoli volumi di reagenti (riduzione dei costi) Diagnosi precoce Determinazione di sostanze in tracce


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Impiego di piastre microtiter a 96 o 384 pozzetti

Analisi di numerosi campioni (ca. 40 o 200 in duplicato) nella stessa seduta analitica

Rapidità di esecuzione (poche ore)

Analisi di numerosi campioni per giorno


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Disponibilità di dispensatori, lavatori, lettori ed elaboratori del segnale automatici

Ottimizzazione delle fasi analitiche

- errori precisione e accuratezza

- tempi di esecuzione rapidità


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POSSIBILI FORMATI ANALITICIIn commercio sono disponibili numerosi kit su piastra microtiter a 96 pozzetti, spesso con traccianti enzimatici e rivelazione colorimetrica. Il kit contiene la piastra con l’anticorpo immobilizzato e tutti i reagenti pronti all’uso. E’ necessario disporre di pipette per la dispensazione e di alcune attrezzature (lettore di micropiastre per la misura del segnale ed eventualmente dispensatori, lavatori, ...)

Piastre microtiter

Analizzatori automatici

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Metodo Immunoenzimatico Competitivo per l’analisi del Cadmio (II) nell’acqua

Fase pre-analitica:

1 -diluire il campione d’acqua 1/10-1/100 v/v con tampone

2 –si aggiunge un eccesso di EDTA

Dosaggio immunoenzimatico

Si utilizza un anticorpo monoclonale che riconosce il complesso Cd-EDTA


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Curva di calibrazione

Incubazione: 60 min. at 37°C

Rivelazione Chemiluminescente del tracciante HRP: H2O2/luminolo/enhancer

CampioneTracciante:Cd(II)-EDTA-HRP

Anticorpo immobilizzato

Lavaggio

Microtiter96-384 pozzetti

[Cd(II)], μg/L

Sig

nal

e C

L

Metodo Immunoenzimatico Competitivo per l’analisi del Cadmio (II) nell’acqua

0.01 0.1 1 10 100


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SH

GS

HG

SH

campioneG

SH

GS

-Hg

GS

HG

S-H

g

GS

HG

S-H

gG

SH

GS

-Hg

GS-Hg anticorpo

Ү Ү

GS

HG

S-H

gG

SH

GS

-HgAdd

HRP-Ab anticorpo

Ү ҮҮ ҮHRPHRP

HRPsubstrato

Segnale

Determinazione di Hg(II) mediante metodo immunologico non competitivo: EPA metodo ufficiale

Campioni liquidi : Analisi diretta (solo diluizione)Campioni solidi : Estrazione di Hg(II) con HCl/HNO3 poi si tampona a pH=7

The extract is added to the microtiter wells where the BSA-GSH is immobilized: the Hg ions bind the glutathione

This complex is detected using an antibody anti-BSA-glutatione-Hg and with a secondary HRP labeled antibody


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:

Limite di rivelazione: 0.4 μg/l

Specificità: altamente specifico per Hg(II):

Quantità richiesta per dare un ‘interferenza (ppm)

Mercurio 0.36 Piombo >150,000 Arsenico >55,000 Nichel >43,000 Bario >100,000 Argento > 79,000 Cadmio >82,000 Sodio >17,000; Cromo > 38,000 Stronzio >64,000 Rame > 47,000 Tallio >150,000 Oro > 144,000 Zinco >48,000 Ferro >41,000

Caratteristiche analitiche


Determinazione di Hg(II) mediante metodo immunologico non competitivo: EPA metodo ufficiale

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DTERMINAZIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANODTERMINAZIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO

Ab monoclonali ani-ferritina Ferritina presente nel campion/stadards/controllo

Ab anti-ferritinamarcato con HRP

+ +

+

30 min25 °C

Lettura del segnale a 492 nmColorazione giallo-arancione

60 min37 °C

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DTERMINAIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANODTERMINAIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO

CARATTERISTICHE DEL METODO

• Limite di misura = la più piccola concentrazione in ferritina significativamente differente dal valore dello standard O con una probabilità del 95% = 2 ng/ml

• Specificità: ferritina di milza umana 100% di reazione crociata ferritina di fegato umano 112% di reazione crociata ferritina di cuore umano 62% di reazione crociata

Production Of Monoclonal AntibodiesImmunisation with antigen

Cell line –myeloma

P3– NSI/I – Ag4 – 1

X63 – Ag8 - 653

Ab1 Ab2 Abn Ab titre from serum

Spleen suspension

Fusion with P.E.G.

Selection with H.A.T.

Screen for Ab – secreting hybrids

Clone Ab secreting hybrids

Clone 1 Clone 2 Clone n

Serum/ascitic fluid containing Abn

In vivo

Ab1 Ab2 Abn

Production of Stable Antibody Secreting Hybrid

1st Cloning

Hybrid Ab Hybrid Abn Hybrid Non Secretor

Cell division

Hybrid Ab1

Hybrid Non-Secretor

2nd Cloning

Stable antibody secreting hybrid

FACOLTA’ DI SCIENZE FF. MM. NN. – CHIMICA BIOANALITICA I metodi immunometrici, sfruttando le...

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