FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA BIOANALITICA La forte affinità e specificità di legame...
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FACOLTA’ DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA BIOANALITICA La forte affinità e specificità di legame tra antigeni ed anticorpi è sfruttata anche in tecniche di “blotting” di proteine per la rivelazione di proteine di interesse diagnostico e clinico. Western blots e dot blots sono le tecniche più comunemente usate. ANALISI PROTEICA
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La forte affinità e specificità di legame tra antigeni ed anticorpi è sfruttata anche in tecniche di “blotting” di proteine per la rivelazione di proteine di interesse diagnostico e clinico.
Western blots e dot blots sono le tecniche più comunemente usate.
ANALISI PROTEICA
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CL molecule product
enzyme
detectionantibody
protein
(a) (b)
secondanti-species
antibody
unlabeleddetectionantibody
(c)
biotin
streptavidin
Western Blot analisi:
Dot Blot analisi:La differenza con il western blot consiste nel fatto che le proteine non sono separate per via elettroforetica, ma sono depositate direttamente sulla membrana.
ANALISI PROTEICA
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ANALISI GENICHE
L’isolamento e la quantificazione di sequenze di acidi nucleici e lo studio della loro organizzazione, localizzazione, ed espressione è reso possibile da:
- marcatura di acidi nucleici per produrre DNA/RNA sonda
- fenomenmo di autoduplicazione; ibridazione
La ricerca di specifiche sequenze geniche ha una grande importanza in ambito clinico e diagnostico in quanto l’identificazione della sequenze genica associata ad un determinato effetto permette di individuarne le cause.
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Struttura secondaria del DNA: doppia elica con uno scheletro idrofilo zucchero-fosfato e basi idrofobiche impacchettate perpendicolarmente all'asse dell'elica. I due filamenti di DNA complementari si sviluppano in direzione opposta.
Struttura primaria del DNA: sequenza di basi nucleotidiche (adenina, guanina, citosina, timina) contenente l’informazione genetica, legate fra di loro attraverso i ponti della catena zucchero-fosfato.
DNA
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Stabilità del DNA: La doppia elica è stabilizzata dalla formazione di legami ad idrogeno tra le basi presenti sui filamenti opposti secondo lo schema A-T e G-C:
DNA
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IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI
• IN VIVO: alla base dei processi di riconoscimento molecolare
• IN VITRO: l’ibridazione di sequenze target con sonde oligonucleotidiche è l’approccio tipico per l’identificazione e l’isolamento di acidi nucleici
Denaturazione del DNA target con trattamento termico per rompere i legami H
Mix frammenti sonda + target per far avvenire l’appaiamento di sequenze complementari
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IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI
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• Tm = temperatura alla quale il 50% del DNA (o ibrido) è presente in forma denaturata; cioè come singolo filemanto
• È un indice della stabilità del legame chimico
• La denaturazione del Dna provoca una variazione delle proprietà spettroscopiche
STABILITA’ DELL’IBRIDO
Temperatura di melting Tm
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L’ENERGIA necessaria per separare due filamenti complementari di DNA dipende da:
• LUNGHEZZA dei filamenti (più sono lunghi più energia occorre)• COMPOSIZIONE di basi azotate (la coppia GC possiede un legame idrogeno in più rispetto alla coppia AT, quindi filamenti ricchi in GC richiedono maggiore energia per esser separati) COMPLEMENTARIETA’ delle catene di DNA: catene non perfettamente complementari fra di loro (con una o più basi “mismatched”) si legano ugualmente, ma con energia minore.
• AMBIENTE CHIMICO (la presenza di cationi monovalenti quali Na+ stabilizza la doppia elica, i denaturanti quali urea e formamide la destabilizzano)
IBRIDAZIONE
K = e-G(complementare/non complementare)/RT
G(complementare/non complementare)~4 kcal/mol K ~ 1/100-1/1000
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REAZIONI D’IBRIDAZIONE
La sensibilità delle reazioni di ibridazione è molto elevata(costante di associazione delle sonde = 1015 /mole)
La specificità delle reazioni di ibridazione è alta. La complementarietà tra la sequenza di basi della sonda e dell’acido nucleico bersaglio è necessaria.
Per la rivelazione delle reazioni d’ibridazione occorre marcareil DNA sonda.I metodi di marcatura degli acidi nucleici prevedono l’incoroporazione di nucleotidi marcati nel DNA, mediante reazioni enzimatiche o durante il processo di sintesi.
La reazione d’ibridazione procede con una cinetica del secondo ordine a due stadi.
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• Le sonde sono di diverse dimensioni: oligomeri (contenenti meno di 50 basi) o frammenti di alcune migliaia di nucleotidi.
• Può essere a singolo o a doppio filamento, anche se prima di esser usata viene convertita a singolo filamento
SONDE GENICHE
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• Marcatura di un filamento con DNA Polimerasi (nel corso della sintesi del DNA vengono incorporati nucleotidi marcati)
• NICK TRANSLATION
• RANDOM PRIMING
• Marcatura terminale (aggiunta di un gruppo marcato ad uno o più nucleotidi terminali)
• Marcatura di RNA
MARCATURA IN VITRO
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Le sonde radioattive, sonde “calde”, contengono nucleotidi in cui è inserito un radioisotopo (es. 32P, 35S, 3H) che viene individuato in soluzione o tramite autoradiografia
Radioisotopo Emivita Tipo di emissione/Energia
3H 12.4 anni - / 0.018 MeV
32P 14.3 giorni - / 1.71 MeV
35S 87.4 giorni - / 0.167 MeV
MARCATURA ISOTOPICA
Le sonde “calde” sono le più sensibili.
Attraverso la marcatura diretta, Il marcatore è legato covalentemente direttamente all’acido nucleico, o intercala con legami non covalenti
direttamente tra la doppia elica del DNA sonda.
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MARCATURA NON ISOTOPICA
• Composti chemiluminescenti: luminolo e derivati• Enzimi: fosfatasi alcalina, luciferasi batterica o da lucciola,
HRP, …• Inibitori enzimaticic: acido fosfonico• Composti fluorescenti: fluorescina, rodamina, chelati di
europio• Fotoproteine: acquorina
Le sonde non radioattive sono dette sonde “fredde”. La marcaturaNon radioattiva può essere diretta o indiretta.
I vari tipi di marcatori sono:
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MARCATURA NON ISOTOPICA
La marcatura enzimatica permette l’amplificazione del segnale, la luminescenza permette di sviluppare metodi sensibili per la rivelazione di quantità piccole di acidi nucleici.
Per metodi basati sull’utilizzo di sonde più lunghe di 300 basi, la marcatura diretta con AP o HRP è consigliata, in questo modo la formazione dell’ibrido è rivelata semplicemente aggiungendo il substrato chemiluminescente per l’enzima.
enzyme
CL molecule product
gene probe
target sequence
MARCATURA DIRETTA
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MARCATURA NON ISOTOPICA
MARCATURA INDIRETTA
Sebbena la marcatura diretta di sonde relativamente corte con enzimi sia stata presentata, la presenza di un enzima legato ad una sonda di piccole dimensioni può inficiare la cinetica e la specificità della reazione d’ibridazione.
La marcatura con apteni permette sempre lo sviluppo di sistemi amplificati (es. biotina-avidina, biotina-streptavidina)
Sonde geniche di piccole dimensioni sono spesso marcate indirettamente con apteni che sono poi immunorivelati attraverso anticorpi anti-aptene marcati con l’enzima
anti-haptenantibody
hapten
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Mediante marcatura indiretta: una opportuna specie chimica (di solito un aptene) viene legata covalentemente alla sonda genica, ed al
momento opportuno questa specie viene rivelata attraverso il suo legame con una adatta molecola di legame marcata con il tracciante.
MARCATURA NON ISOTOPICA
Aptene Proteina leganteMarcatore della
proteina
BiotinaAvidina
Streptavidina (Kaff 10 14)
Fosfatasi alcalina
b-galattosidasi fluorescina
HRP
Digossigenina Antidigossigenina Fosfatasi alcalina
IgG Antispecie IgGHorseradish peroxidase
Poly (dA) Poly (dT) HRP
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Una scoperta relativamente recente che permette la rivelazione di specifiche sequenze geniche è rappresentata dai “molecular beacons”. Esse sono sonde oligonucleotidiche che rivelano la presenza di una specifica sequenza target (DNA o RNA) attraverso l’emissione di un intenso segnale fluorescente a seguito della reazione di ibridizzazione.
I “molecular beacons” sono oligonucleotidi a filamento singolo con struttura “STEM-LOOP”,Alle estremità della porzione “STEM” sono legate rispettivamente una molecola fluorescente ed un “quencher”.
LOOP
STEM
fluoroforo “quencher”
sequenza target
MARCATURA NON ISOTOPICA
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Colorimetry. Colorimetric assays produce soluble colored products and are relatively insensitive compared to luminescent assays; simple visual read-out
Fluorescence and time-resolved fluorescence. Capable of detecting single molecules of fluorescein; High background signal due to nonspecific fluorescence present in biological samples Since the background fluorescence tends to be short-lived, it can be avoided by using a short lived fluorophore, e.g. europium chelate
Electrochemiluminescence. An electrochemical reaction produces excited-state species that decay to produce ground state product and light; need for specialized equipment that combines electrochemical-generation and light-detection capabilities
METODI DI RIVELAZIONE
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Chemiluminescence and Bioluminescence. Chemiluminescence is the emission of light that occurs in certain chemical reactions because of decay of electronic excited molecules to the ground state; bioluminescence is the chemiluminescence of nature (e.g. the firefly photinus pyralis) Both methods are very sensitive (zeptomole amounts, 10-21 moles) rapid and versatile (adaptable for hybridization in solution and on membranes and monitoring with Charge Coupled Device cameras).
Phosphorescence. Long-lived emission from triplet excited states (e.g. inorganic phosphor crystals); Irradiation with ultraviolet light results in a long-lived signal (milliseconds to microseconds); Signal acquisition using photographic film or a CCD camera
METODI DI RIVELAZIONE
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Aequorin (apoaequorin produced by recombinant DNA techniques is converted to aequorin (the photoprotein present in the jellyfish Aequora) by reaction with coelenterazine and light emission from aequorin is triggered by calcium ions, light is emitted as a flash (469 nm)
Alkaline Phosphatase
• Chemiluminescent: AMPPD (adamantyl 1,2-dioxetane aryl phosphate) is dephosphorylated to a phenoxide intermediate which decomposes to form adamantone and an exited-state aryl-ester, which emits light as a protracted glow
• Bioluminescent: firefly luciferin O-phosphate luciferin
• Colorimetric, time-resolved fluorescent
AP
RIVELAZIONE DEI MARCATORI NON ISOTOPICI
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Europium chelates: lanthanides, e.g. europium 3+ and terbium 3+ form highly fluorescent chelates with naphthoyltrifluoracetone. Long-lived fluorescence (100-1000 us)
Fluorescein: (quantum yield bigger than 0.85) used in nonseparation energy transfer probe assays
Glucose-6-phosphate dehydrogenase: used with marine bacterial luciferase NAD(P)H:FMN oxidoreducatse reaction
Horseradish peroxidase: catalyzes the chemiluminescent oxidation of luminol and, in the presence of small amounts of phenols and amines the analytical features of this reaction are enhanced. The light emission from this reaction is a long-lived glow (>30 min)
RIVELAZIONE DEI MARCATORI NON ISOTOPICI
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Luminol and Isoluminol: metal ions and peroxidases catalyze the chemiluminescent oxidation of luminol and isoluminol
Phosphors. protein A can be labeled with red-emitting yttriumoxisulfide or green-emitting zinc silicate phosphors (southern and dot blots). Phosphorescence signal is not influenced by the presence of water, pH or changes in temperature
Renilla Luciferase: catalyzes the bioluminescent oxidation of coelenterazione. Light is emitted as a glow
Xanthine oxidase: catalyzes the luminescent oxidation of luminol. Long-lived light emission (lasting for several days) is enhanced by an iron-EDTA complex via hydroxyl radical production
RIVELAZIONE DEI MARCATORI NON ISOTOPICI
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TECNICHE DI IBRIDAZIONE
Le reazioni d’ibridazione sono reazioni bimolecolari fra una molecola “target” ed una molecola “sonda” in cui catene complementari di acidi nucleici si associano a formare molecole a doppia catena sulla base della complementarietà di sequenza.
L’ibridazione può avvenire:
- in soluzione
- in fase mista (ibridazione su filtro)
- in situ
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IBRIDAZIONE IN SOLUZIONE
Questo tipo di reazione d’ibridazione è il più efficace:il bersaglio denaturato e la sonda marcata vengono miscelati in soluzione. I tempi d’ibridazione sono accelerati.
L’inconveniente è quello di dover separare l’ibrido formato dalla sonda che non ha reagito.
Sono state ideate tecniche che prevedono la cattura dell’ibrido formatosi in soluzione su un supporto solido; generalmente la sonda contiene un ligando, tipo biotina che permette la cattura su un supporto solido. Es: PCR-ELISA
Sondabiotinilata
+
Micropiastra streptavidinata
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Il metodo PCR-ELISA prevede che: Il DNA bersaglio viene marcato con un aptene appropriato tramite tecnica PCR.
Quindi l’ibridazione con un DNA sonda marcato con biotina avviene in soluzione, quindi l’ibrido è catturato su piastre ricoperte di streptavidina.
Quindi gli ibridi sono rivelati attraverso l’uso di un anticorpo anti-aptene coniugato con un enzima e l’aggiunta del substrato opportuno.
anti-haptenantibody
target DNA PCR
hapten
IBRIDAZIONE IN SOLUZIONE
La PCR-ELISA permette la rivelazione degli ibridi formati in soluzione grazie alla cattura su micropiastre.
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IBRIDAZIONE SU FILTRO
I filtri utilizzati possono essere di materiale diverso. Tra i più usati ci sono:-Nitrocellulosa-Nylon-Nylon carico positivamente
L’ibridazione su filtro prevede 5 passaggi:
1)fissaggio dell’acido nucleico denaturato su filtro;
2)preibridazione per bloccare i siti sulla membrana;
3)ibridazione, si fa incubare la membrana con la sonda marcata;
4)lavaggi, per rimuovere l’eccesso di sonda;
5)rivelazione dell’ibrido in base al tipo di sonda marcata usata.
Le principali tecniche d’ibridazione su filtro sono: - “southern Blotting” - “Dot-Blot” - “Reverse dot-blot”
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Per un’analisi di Southern Blotting:
Il DNA è isolato da cellule o tessuti e diviso in fgrammenti di diverse dimensioni con enzimi che tagliano il DNA a siti spoecifici.
I vari frammenti sono separati in base alla dimensioni mediante elettroforesi su gel.
I frammenti sono poi denaturati per ottenere I singoli filamenti che devono reagire con le sonde complementari.
I singoli frammenti sono trasferiti su una membrana di nitrocellulosa e analizzati per ibridazione con una sonda marcata
La sonda che non ha reagito è eliminata tramite lavaggi
•RNA – Northern Blotting
•Protein – Western Blotting
IBRIDAZIONE SU FILTRO
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IBRIDAZIONE SU FILTRO
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IBRIDAZIONE SU FILTRO
La tecnica Dot-Blot è simile alla Southern Blot in termini di utilizzo di una sonda genica marcata. La differenza consiste nel fatto che i differenti campioni di acidi nucleici (DNA o RNA) non vengonoi separati per via elettroforetica ma sono depositati direttamente su filtro per poi essere ibridati con una sonda marcata.
La tecnica Reverse-Blot è una modifica della Dot-Blot tradizionale: sul filtro, infatti, viene fissata la sonda non marcata che viene fatta ibridare con una soluzione d’ibridazione contenente il bersaglio precedentemente marcato.
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La tecnica Reverse Dot Blot sfrutta una sonda non marcata immobilizzata su una membrana. Il DNA bersaglio è prodotto in modo tale da essere marcato con uno specifico aptene (es biotina). Quindi viene ibridato con la sonda immobilizzata e rivelato con un enzima coniugato con streptavidina e un substrato, ad esempio CL, appropriato.
CL molecule product
immobilizedgene probe
streptavidin
enzyme
target DNA PCR
biotin
IBRIDAZIONE SU FILTRO
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IBRIDAZIONE IN SITU
Nella tecnica di ibridazione in situ, il campione è rappresentato da un tessuto o da cellule coltivate in vitro.Questi si mettono a contatto con la sonda: si procede alla denaturazione contemporanea del DNA contenuto nel tessuto eQuello della sonda e poi si lascia avvenire l’ibridazione.
DNA di Papillomavirus identificato mediante una sonda genica marcata con un tracciante fluorescente
DNA rivelato mediante un intercalante fluorescente
Struttura cellulare rivelata mediante un anticorpo anti-citocheratina marcato con un tracciante fluorescente
