Bioanalitica - ELISA

8/13/2019 Bioanalitica - ELISA

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L immunologia lo studio della risposta immunitaria, cdel processo tramite il quale un animale si difen

dallinvasione di organismi estranei.

Le risposte immunitarie possono essere distinte in dgruppi:

1) immunitaria umorale (mediata da anticorpi);2) immunitaria cellulare (mediata da cellule).

Entrambi i tipi di risposta coinvolgono cellule del siste

reticolo-linfocitario.Le tecniche immunochimiche impiegano gli anticorpi partecipanoallimmunit umorale.

Immunochimica:il rapporto antigene-anticorpo


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Antigene qualsiasi sostanza capace, dopo ess penetrata nei tessuti di un vertebr

superiore, di indurre una specifirisposta di difesa immunitaria.

Propriet: immunogenicit importanti dal punto di vistaantigenicit immunochimico

Immunogenicit: capacit di indurre una rispostaimmunitaria e/o cellulare

Antigenicit: capacit di reagire in maniera specificacon i prodotti finali delle risposte immuni (anticorpe/o recettori di membrana)

Lantigenicit di una molecola non pu essere considerata come una propriet inerente alla molecola stessa, come lo sono le sucaratteristiche chimico-fisiche, bens come una propriet dipendendalle condizioni sperimentali in cui viene determinata.


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Da che cosa dipende limmunogenicitdi una sostanza?

1 - estraneit: il sistema immunitario in grado didiscriminare ilself dal non self, di conseguenza, lemolecole estranee ad un determinato organismo hanncapacit immunogena;

2 - peso molecolare: pi elevato il peso molecolare dellamolecola in esame e maggiore sar la possibilit di aveuna risposta immunogenica;

3 - complessit chimica e strutturale delle molecol leterogenicit chimica apporta immunogenicit. Adesempio omopolimeri anche adeguatamente grandi hanimmunogenicit bassa se confrontata con polimer

contenenti aminoacidi diversi, dello stesso peso molecolaDaltra parte, gli antigeni proteici risultano tanto piimmunogenici quanto pi sono complessi i loro livelli organizzazione molecolare (struttura terziaria quaternaria);

4 - specie animale: le propriet immunogene di un antigenvariano a seconda della specie animale utilizzata per produzione di anticorpi;

5 degradabilit: macromolecole insolubili sono piimmunogene di quelle pi piccole e solubili, poichvengono pi facilmente fagocitate ed elaborate dal sistemmacrofagico.


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Tutti gli antigeni si legano agli anticorpiutilizzando piccole zone superficiali e specifichedettedeterminati antigenici o epitopi .

Ma tutte le sostanze sono antigeniche?

No, infatti esistono piccole sostanze organiche,dette apteni , monovalenti (con un unicodeterminante antigenico), antigeniche, ma non

immunogeniche. possono venire legateartificialmente in modo covalente ad una proteinache prende il nome dicarrier e funzionare comeepitopi naturali .

Teoricamente ogni entit chimica pu di per scontenere un determinante antigenico se legato adun opportuno carrier immunogeno .


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Anticorpo

Gli anticorpi sono proteine che vengono prodottedai linfociti B. Questi linfociti sono cellule piccole,

rotonde, appartenenti alla categoria dei globuli

bianchi con il compito di difendere l'organismo da

agenti esterni tramite la risposta umorale. Esistonocinque classi di anticorpi che appartengono alla

categoria delle molecole proteiche dette

" Immunoglobuline ".

La loro produzione, da parte delle cellule plasmatiche, provocata dallintroduzione

nellorganismo di una sostanza estranea od antigene

(Ag) avente determinate caratteristiche fisico-

chimiche, che, riconosciuta poi per queste

particolarit dai siti di combinazionedellanticorpo,

viene da questo legata, neutralizzata e quindi

eliminata.


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Che struttura ha un anticorpo?

Essi hanno una struttura fondamentale composta quattro catene polipeptidiche: due catene leggeidentiche (a basso peso molecolare, definitoFc -

Fragment crystallisable ) e due pesanti ad alto pesomolecolare (chiamatiFab - Fragment antigen binding ).

Agli estremi delle catene c' o un gruppo carbossterminaleCOO- o il gruppo ammino-terminaleNH 3+ che ha il compito di legarsi all'antigene specifico.

Fab catena pesante o C

H, ovvero di peso

molecolare maggiore, responsabiledellattivit biologicadellanticorpo

Fc catena leggera o CL, ovvero a pesomolecolare minore, corrispondono alle regiondeputate al legame conlantigene (detteparatopi )

Queste catene sono legate tra loro da legami disolfuintercatena.


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Come si producono gli anticorpi?

Immunizzazione di animali, previa coniugazione deantigeni con molecole ad alto peso molecolare p

incrementare la risposta immunogenicaStimadelleffettiva presenza e determinazione del titole dellaffinit degli anticorpi prodotti mediante saggELISA spettrofotometrico

Purificazione e caratterizzazione degli anticorpiLa specificit del sito di legame conlantigene diciascuna immunoglobulina dipende dalla variazionealcuni residui amminoacidi nella porzione N-termindi ciascuna catena (regione variabile) e spiegalunicit

di ciascun anticorpo specifico.

Immunizzazione mediante

iniezionedi topi e/o conigli

Saggio ELISA spettrofotometrico(Enzyme Linked

Immunosorbent Assay)


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Interazione antigene-anticorpo

Lunione che si instaura tra un antigene ed ilcorrispondente anticorpo porta alla formazione diquello che viene definitoIMMUNOCOMPLESSO .Tale unione altamente specifica ed regolata daforze di tipo chimico-fisico (legami di natura noncovalente) che agiscono tra i determinantidellantigene e dellanticorpo .

La formazione degli immunocomplessi determina unserie di eventi effettori finalizzati alla definitivadistruzione o neutralizzazione dellantigene .

Sistema chiave-serraturaDi fronteallagente da riconoscere, che funzionada serratura, il sistema immunitario ricorre ad unmetodo apparentemente dispendioso, quello dicostruire a caso un elevato numero di chiavidifferenti tra le quali ci sar senza dubbio quella

giusta per aprire la serratura. Tali chiavi sono glianticorpi naturali che rappresentano il bagagliocognitivo del sistema immunitario ed i principalifautori della resistenza naturale di specie o diazza verso particolari agenti estranei.


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Un principio fondamentale su cui si basalinterazione antigene-anticorpo (Ab-Ag) per laformazione del complesso antigene-anticorpo (AgAb).

Lequilibrio fra antigene monovalente (aptene) elanticorpo viene espresso dalla legge di massa:

k 1 Ab + Ag Ab-Ag

k 2 e, ad equilibrio raggiunto, K= k 2/k 1 = [Ab-Ag]/[Ab][Ag].


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Quando, per una determinata concentrazione di Ag,

[Ag-Ab] = [Ab],

cio i siti antigenicidellanticorpo, sono saturati permet con lantigene, allora il valore del reciprocodella concentrazionedellantigene libero sar ugualealla

costante di aff ini t :

K = 1/[Ag].

La costante K (costante di associazione) definita

dalla concentrazione di epitopo libero necessarioperchvenga raggiunto il 50% di saturazione deisiti anticorpali ed una misura dellaffinit intr insecao della stabi li t del legame Ag-Ab.


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Il valore della costante di affinit di un anticorpo perun dato antigene determina negli esperimentiimmunochimici sia il limite di rilevabilit (chemigliora con laumentare dellaffinit ), sia laspecificit (che cresceallaumentare della differenzatra il valore della costante di affinit di un Ab versolAg specifico ed quello relativo ad un Ag non).

Le K aff possono variare da 109 10

10 M

-1nel caso di

anticorpi con elevata affinit perlantigene, a 104 105 M-1 nel caso invece di immunoglobuline con bassa affinit.


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Affinit : forza dellinterazione antigene-anticorpo(o aptene-anticorpo) misurata dalla costante diequilibrio della reazione di associazione

Reazione antigene-anticorpo : reazione dinamicae reversibile tra un anticorpo e un antigene per dareorigine al complesso antigene-anticorpo.E caratterizzata da una costante di equilibrio definita.

Immunogeno : sostanza antigenica (antigene,coniugato aptene-proteina) che in contatto con unospite immunocompetente capace di stimolare la produzione di anticorpi specifici.

Sito legante anticorpale (paratopo) : regione

della molecola anticorpale capace di combinarsicon il corrispondente determinante antigenico.

Determinante antigenico (epitopo) : elementostrutturale della molecola antigenica riconosciutodallanticorpo e capace di combinarsi con ilcorrispondente sito legante anticorpale.Marcatore : sostanza (radioisotopo, enzima,fuoroforo ecc) che introdotta nella struttura di unreagente (antigene, aptene, anticorpo) ne consentela rivelazione


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Tecniche immunoenzimatiche

La specificit delle reazioni antigene-anticorpo e lasensibilit di marcatori (isotopi, sostanzefluorescenti, radicali liberi, enzimi) possonoessere combinate insieme per compiere undosaggio immunologico , ossia quantificarecon precisione una sostanza antigenica.

La tecnica pi usata il dosaggioradioimmunologico (RIA), in cui il tracciante costituito da un isotopo.

Vantaggi :- elevata sensibilit, della facilit con cui si

ottengono le marcature isotopiche- invariabilit delle cinetiche di reazione a seguito

della marcatura stessa.

Svantaggi: - alti costi dei reattivi e delle apparecchiature,- deperibilit, pericolosit e difficolt di

smaltimento dei composti radioattivi,- necessit di personale specializzato.


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Quando il tracciante costituito da un enzima,si parla didosaggi immunoenzimatici (EI A).

In questo caso non viene misuratodirettamente il marcatore, ma la sua attivitnei confronti di un suo substrato specifico(ovvero la quantit di prodotto formato).

da tener presente chelattivit enzimatica,come purelaffinit fra Ab e Ag, pu variarea seguito della coniugazione fra enzima eanticorpo (o antigene).

Vantaggi:

- minor costo,- assenza di rischi derivatidallesposizione a

radiazioni,- maggior praticit e versatilit.


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Saggio ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Prevede luso di un enzima coniugato ad uno dei biocomponenti utilizzati nel test, susseguentemenladdizione di un substrato e la sua trasformazione in

un prodotto colorato, permetter di quantificare reagente legato indirettamenteallenzima tramitelettura con un opportuno spettrofotometro, e quindi, risalire alla stimadellanalita in esame.

Saggio competitivo : saggio immunochimico basatosulla competizione tra analita e tracciante peloccupazione di un numero limitato di siti legantianticorpali: consiste in pratica nella misura dei siti no

occupatidallanalita .

Tracciante : indicatore della reazione analitica nei saggiimmunochimici. Sostanza (antigene, anticorpo, aptene) resdirettamente rivelabile mediantelintroduzione di un opportunomarcatore.


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Procedura test ELISA


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Saggio competitivo diretto

uso del coniugato Antigene-Enzima

Una quantit fissa di antigene marcato e diluiziondecrescenti di antigene libero (come standard o necampione) vengono messe a reagire insieme neconfronti di un anticorpo in difetto. In questo modolantigene marcato e libero si troveranno a competere per un numero limitato di siti anticorpali. Dopo aver

lavato il complesso, si aggiunge il substrato perlenzima e si misura lattivit enzimaticaspettrofotometricamente, fluorimetricamente omediante chemioluminescenza. La concentrazione de prodotto enzimatico misurata risulterinversamente proporzionale alla concentrazionedellanalita .


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Saggio competitivo diretto

uso del coniugato Anticorpo-Enzima

Questo tipo di saggio competitivo coinvolgeluso delconiugato anticorpo-enzima, con lantigene immobilizzato sulla fase solida. La reazione dicompetizione avviene fralantigene immobilizzato equello libero in soluzione come standard o proveniente dal campione, nei confrontidellanticorpo marcato presente in concentrazionefissa e in difetto. La misura del prodotto dellareazione enzimatica sar indirettamente proporzionale alla concentrazione di antigene presente nel campione.


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Saggio competitivo indiretto

uso di un anticorpo secondario

La procedura implicaluso di un anticorpo secondariomarcato, in grado di riconoscere la regione costandellanticorpo primario, precedentemente incubato sfase solida.La reazione di competizione avviene fralantigene

immobilizzato e quello libero in soluzione come standardo proveniente dal campione,nei confrontidellanticorpo presente in concentrazione fissa.La misura del prodotto enzimatico sardirettamente proporzionale nel caso della misura del titolodellanticorpo da determinare, mentre inversament

proporzionale perlanalita .


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Saggio non competitivo

Saggio EL I SA a sandwich

Questa metodica pu essere utilizzataesclusivamente quandolanalita possiede almenodue determinanti antigenici.

Un eccesso di anticorpo verso il primo sitoantigenico viene immobilizzato sulla fase solida eincubato con diluizioni successive di antigene presente nel campione o in soluzioni standard. Dopil lavaggio, il complesso Ag-Ab immobilizzato vienincubato con una concentrazione fissa di anticorpomarcato che andr a legarsi al secondo sitoantigenico dellimmunocomplesso . La misura del prodotto della reazione enzimatica risulterdirettamente proporzionale alla concentrazione

dellantigene da stimare.


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Fattori che influenzano la scelta del metodo

Le tecniche ELISA non competitive offrono una

maggiore sensibilit rispetto alle competitive.La rilevabilit finale diunanalisi competitiva limitata dalla costante di affinitdellanticorpo usato.

La sensibilit finale dei saggi non competitivi determinata dal binding non specifico degliimmunoreagenti marcati.

Nei saggi competitivi diretti, dipende dal grado di purezza e dalla stabilit degli immunoreagenti, Ago Ab, marcati conlenzima .

Quando di lavora con campioni reali (sieri, urine,tessuti, ecc), possono essere presenti proteine ingrado di modificare i traccianti enzimatici

(proteasi), oppure di inibirnelattivit .Luso dellanticorpo secondario consenteunamplificazione della risposta del saggio, poich quando si lavora con il solo anticorpo primario la sensibilitdellanalisi fortementeinfluenzatadallaffinit del sistema Ag-Ab-E.


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Sensibilit

concentrazionedellanalita,

sensibilit del sistema di rivelazione,

affinitdellanticorpo da usare,

tempo di incubazione

tempo di sviluppo del prodotto enzimatico, precisione del saggio

volumi impiegati.

Sensibilit (analitica) : capacit di un metodo didistinguere piccole variazioni di concentrazione dianalita. Nella terminologia abituale immunochimica:capacit di un metodo di distinguere da zero piccoleconcentrazioni di analista, inversamente correlata al

limite di rivelazione o di misura, o alla minimaconcentrazione misurabile (rivelabilit).

Specificit (analitica) : capacit di un metodo dideterminare esclusivamentelanalita ; assenza direattivit nei confronti di sostanze interferenti


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Lenzima da utilizzare in un saggio ELISA deve

possedere i seguenti requisiti:1 - deve essere stabile in un intervallo di temperatura

compreso fra 25 e 37 C, con un tempo di vita dialmeno sei mesi a 4 C

2 - deve essere disponibile commercialmente e ad un prezzo ragionevole

3 - la sua attivit deve essere facilmente misurata conopportuni tests (colorimetrici, fluorimetrici, ecc.)

4 - deve essere facilmente dosabile e possedere unalto numero diturn-over e inoltre il suo prodottodi reazione deve avere un alto coefficiente diestinzione molare

5 - non deve risentire degli effetti negativi dellamatrice in cui eventualmente svolto il saggio

Gli enzimi normalmente pi usati sono la perossidasida rafano , la fosfatasi alcalina da intestino divitello, la -D-galattosidasi da Escherichia coli ,lacetilcolinesterasi da Electrophorus electricus .

Scelta dellenzima


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STUDIO DEI PARAMETRI DI UNIMMUNOSAGGIO

Coating: concentrazionedellAg (o Ab)forza ionica

tampone pH

tempo temperatura

Bloccaggio: natura del bloccante tampone tempo e temperatura

Competizione : modalit tempo e temperatura

Substrato delle reazioni enzimatiche etempo di reazione

Lavaggio : uso di tensioattivi modalit tempo


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[analita]

10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 10 0 10 1

% A/A0

0

20

40

60

80

100

ANALISI DEI DATI

Y = (a - d)/[1 + (x/c)b

] + d Modello logit-it logistico

a 4 parametri

a = valore asintotico del massimo (dose massima)b = pendenza del tratto rettilineo della sigmoidec = IC 50, ovvero concentrazione dellanalita

nel campione in grado di legare il 50% dellanticorpo

Curva di concentrazione/risposta (curva standard, di

calibrazione, di taratura) : espressione graficadellandamento della risposta del saggio al variare della concentrazidellanalita (standard) utilizzata come scala di calibrazione interpolare le risposte relative ai campioni incogniti.

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