Caratteristiche fondamentali della catalisi enzimatica e ...

1

ENZIMI

Caratteristiche fondamentali della catalisi enzimatica e del meccanismo di azione degli

enzimiComponenti strutturali e funzionali degli enzimi

Nomenclatura e classificazione internazionale degli enzimi

2

Energia di attivazione

Y si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a X• Conversione XY termodinamicamente

favorevole

Ma la reazione non avviene se X non acquisisce sufficiente energia per superare la barriera dell’energia di attivazione

3

Num

ero

di m

olec

ole

Energia

Presenza di un catalizzatore

Aumento di temperatura

Distribuzione

delle

molecole

a vari

livelli

di

energia

Molecole con energia maggiore dell’energia di attivazione

Energia

di

attivazione

4

A

P

Energia

Stato iniziale

Stato finale

Energia di attivazionesenza catalizzatore

Energia di attivazione con catalizzatore

Energia liberata dalla reazione

Energia

di

attivazione

5

Enzimi: catalizzatori biologici

Si combinano transientemente

col substrato e ne abbassano l’energia di attivazioneNon modificano l’equilibrio della reazione, ma solo la

velocità

con la quale l’equilibrio viene raggiuntoNon vengono modificati nella reazione, e al termine della

reazione sono subito disponibili per catalizzare una nuova reazioneStabilizzano lo stato di transizione e riducono la barriera

dell’energia di attivazione inserendo stati di transizione di livello energetico più

basso

6

ENZIMAATTIVO

UbiquitinaLisosomidegradazione

Sito attivo

Effettoreallosterico

Sito allosterico

Zimogeno(precursore)

DNARNA

ribosomi

Apoenzima

Parte non-proteicaione metallico o

coenzima

Substrato Prodotto

Struttura generale degli enzimi

7

Nomenclatura degli enzimi

Denominazione classica costituita da 3 parti:• Nome del substrato• Nome del coenzima• Nome della reazione catalizzata + “asi”

Esempio: Lattico-NAD-deidrogenasi

International Enzyme

Commission, fondata nel 1956 da Prof. M. Florkin, International Union of Biochemistry:

• Classificazione degli enzimi secondo il sistema delle classi EC Esempi:

Creatin

kinasi: EC 2.7.3.2, adenosintrifosfato

: creatin

N-fosfo trasferasi

Lattato deidrogenasi: EC 1.1.1.27, lattato : NAD+ ossidoreduttasi• Ha funzionato bene fino agli anni ‘90 (circa 3200 enzimi)

Progetto genoma umano (HUGO):• Esistono circa 20,000 geni, di cui almeno 1/4-1/3 sono enzimi

8

Classificazione internazionale degli enzimi

1 -

ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione• 1.1 agisce sul gruppo CHOH del donatore • 1.2 agisce sul gruppo aldeidico o chetonico del donatore • 1.3 agisce sul gruppo CH-CH del donatore• 1.4 agisce sul gruppo CH-NH2

del donatore • 1.5 agisce sul gruppo C-NH del donatore• 1.6 agisce su NADH2

o NADPH2

• 1.7 agisce su altri composti azotati• 1.8 agisce su gruppi solforati• 1.9 agisce sui gruppi eme

9


1 -

ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione2 -

transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una

molecola ad un'altra• 2.1 gruppi ad una unità

di carbonio

• 2.2 gruppi chetonici o aldeidici• 2.3 gruppi acilici• 2.4 gruppi glicosidici• 2.5 gruppi alchilici• 2.6 gruppi azotati• 2.7 gruppi fosforici• 2.8 gruppi contenenti zolfo

10


1 -



molecola ad un'altra3 -

idrolasi: reazioni di idrolisi

• 3.1 legami esterei• 3.2 legami glicosidici• 3.3 altri legami• 3.4 legami peptidici• 3.5 legami C-N non peptidici• 3.6 legami anidridici• 3.7 legami C-C

11


1 -





4 -

liasi: reazioni di addizione a doppi legami• 4.1 legami C = C• 4.2 legami C = O• 4.3 legami C = N• 4.4 legami C = S

12


1 -





4 -

liasi: reazioni di addizione a doppi legami5 -

isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel

suo isomero• 5.1 racemasi• 5.2 cis-trans

isomerasi

13


1 -





4 -



suo isomero6 -

ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura

di ATP in AMP e pirofosfato

o ADP e Pi• 6.1 legami C-O • 6.2 legami C-S • 6.3 legami C-N • 6.4 legami C-C

14


1 -





4 -



suo isomero6 -

ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura

di ATP in AMP e pirofosfato

o ADP e Pi

15

Struttura primaria e mutazioni genetiche

Tutte le funzioni delle proteine necessitano del riconoscimento fra zone della proteina e altre molecole o parti di molecola:• Enzima-substrato, molecole di adesione-membrane, anticorpo-

antigene etcIl riconoscimento è

basato sulla distribuzione dei gruppi R e

quindi sulla sequenza degli aminoacidi• La zona di riconoscimento e la molecola da riconoscere devono

essere complementari in termini di struttura e di carica Ogni alterazione della struttura primaria può impedire il

riconoscimento o renderlo difficile, causando disfunzioni più o meno gravi

• Se ne deriva uno stato patologico, quella mutazione interessa la zona di riconoscimento

• Se la mutazione è

silente (non genera malattie o disfunzioni), è possibile che l'aminoacido mutato non è

nella zona di

riconoscimento

16

Modello Lock

and Key: l’enzima si combina chimicamente col substrato

Il sito attivo è

costituito dal “negativo”

del substrato

• Si formano legami ionici e elettrostatici esatti fra enzima e substrato

Riconoscimento spesso tridimensionale• Esempio: glicerol

kinasi

(lega

solo glicerolo in forma alfa) • Gli enzimi possono distinguere

gli stereoisomeri D-e L-

degli aminoacidi

17Il legame enzima-substrato avviene tramite l’interazione

delle cariche del substrato con alcuni aminoacidi del sito attivo

Esempio: proteasi

a serinaModifiche della struttura primaria di un enzima possono

mutarne l’attività

causando malattie genetiche

18

Il legame enzima-substrato induce un cambiamento conformazionale nell’enzima

Esempio: esochinasi

senza e con glucosio

19

Coenzimi

Piccole molecole organiche, spesso derivate da vitamineSi legano con forte affinità

a enzima e substrato

Spesso fungono da secondo substratoDeterminano la specificità

della reazione catalizzata

20

Adenosin

trifosfato

(ATP)

Coenzima delle chinasi, trasferisce un gruppo Pi al substratoEsempio: Glucosio + ATP Glucosio-6-fosfato + ADPIn molte chinasi, il substrato vero è

Mg-ATP

21

Nicotinamide

Adenina Dinucleotide

(NAD+)Coenzima di

deidrogenasiDerivato da niacinaTrasferisce un

protone da/a substrati: lattato + NAD+

piruvato + NADH + H+

Esiste una forma fosforilata NADP+

22

Flavina adenina dinucleotide

(FAD)Coenzima di

deidrogenasiDerivato da

riboflavina (vit. B6

)Trasferisce due

protoni da/a substratiEsempio: Succinato +

FAD Fumarato

+ FADH2

23

Coenzima ATrasportatore e

attivatore di gruppi acilici

(acidi grassi) e di acetato

24

Metalli di transizione (Fe, Zn, Cu, Mn…)

Cofattori più

che coenzimiPresenti in 2/3 degli enzimiAgiscono come stabilizzatori della proteina e come

donatori/accettori di elettroni (acidi di Lewis), per esempio i citocromi

25

Di tutte le reazioni possibili per un substrato, l’enzima ne favorisce una sola

Gli enzimi forzano le vie metaboliche attraverso reazioni selezionate (ad es: A > B > H > K > N > T > Z) favorendo il flusso unidirezionale di materiale

26

CINETICHE CHIMICHE E ENZIMATICHE

Studio della velocità

di trasformazione dei reagenti in prodotti

Effetto della concentrazione di reagenteOrdine di una reazione

27

Cinetiche chimiche (AP)

Equilibrio

V iniziale

Vt

Concentrazione di prodotto

Tempo

velocitàvd[A]

dt

d[P]dt

k[A]n

k=costante di velocitàn=numero intero 1-3

28

Cinetiche chimiche (A P)

Conc. di prodotto

Tempo Tempo

Velocità

V iniziale

V finale

Conc. di substrato

Tempo

29

[prodotto]

Tempo

A1

[A]

Velocità

iniziale

A2

A2A1

A3

A3

A4

A4

Effetto della concentrazione di A (A P) A4 > A3 > A2 > A1

30

Cinetiche chimiche vs cinetiche enzimatiche

Velocità

iniziale

[A]

Cinetica enzimatica

Cinetica chimica

31

Ordine di reazionePrimo ordine

A Pv=k[A]1, n=1

Secondo ordineA + B P

v=k[A]1[B]1, n=2Pseudo primo ordine

A + B Pv=k[A]1[B]1, n=2

ma se [B]»[A], v=k[A]1, n=1Ordine zero

v=k, n=0v dipende solo dalla concentrazione del catalizzatore

32

Ipotesi per l’azione degli enzimi N.B.: [S] >> [E]

L’enzima si lega col substrato per formare ES: reazione reversibile e relativamente lentaIl complesso ES subisce il cambiamento conformazionale che

induce la formazione di PL’enzima rilascia P e torna nello stato inizialeLa velocità

globale è

regolata dalla formazione di ES

E + S ES EP E + P

33

Interazione enzima-substratov0

[substrato]1° ordine

Ordine 0

Ordine misto

Vmax

Se [S] è

basso, v0

è controllata da [S]

Se [S] è

alto, v0

è controllata da [E]

Se [S] è

intermedio, v0

è controllata sia da [S], sia

da [E]

Se [S] è

molto alto, v0

non cambia all’aumentare di [S]

34

Raccomandazioni della Commission

on Enzyme Nomenclature of the International Union of Biochemistry

Attività

enzimatica: quantità

di substrato convertito per minuto in condizioni standard di temperatura, pH e forza ionica (moli/tempo)• 1 katal

= 1 mol/s

• 1 IU = 1 micromole/minCostante catalitica o numero di turnover: attività

enzimatica

per mole di enzima (moli/tempo/mole enzima)Attività

specifica di un enzima: attività

enzimatica per mg di

proteina (moli/tempo/mg proteina)• Espressione di purezza in una preparazione

35

Equazione di Michaelis-Menten

(1913)

Leonor

Michaelis

& Maud

Menten

v0 Vmax [S]KM [S]

36

Assunzioni di Michaelis-Menten

E + S ES E + P1 solo substrato Fattore limitante:

formazione di ESTutto E ES

• Non esiste E libero• E saturo di S

ES stazionario

37

Ipotesi v0

=Vmax

/2

KM

= [S] quando v0

=Vmax

/2E’

una concentrazione

(dimensioni moli/litro)E’

indipendente da [E]

v0 Vmax [S]KM [S ]

Vmax

2 Vmax [S ]

K M [S]12

[S]KM [S ]

KM [S ] 2 [S]KM [S]

38

Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche

Vmax

/2

KM

v0

[S]

Vmax

39

Trasformazione di Lineweaver-Burk

1v0

KM [S]Vmax [S]

1v0

KM

Vmax [S]

[S]Vmax [S]

1v0

KM

Vmax

1

[S]

1Vmax

v0 Vmax [S]KM [S]

Y

X

40


1/KM

1v0

KM

Vmax

1

[S]

1Vmax

1/[S]

1/v0

1/Vmax

41


1/[S]

1/V0

1/KM

1/Vmax

Vmax

[S]KM

Vmax

/2

Grafico di Lineweaver-BurkV0

42

REGOLAZIONE DELL’ATTIVITÀ

ENZIMATICA

Necessità

fisiologica della regolazione dell’attività enzimatica

Controllo del livello di enzima Modulazione dell’attività

dell’enzima

43

Il buon funzionamento della cellula richiede che le varie attività

enzimatiche siano regolate

In condizioni di stato stazionario, i processi cellulari non funzionano mai al massimo delle loro capacità, ma possono anche venire completamente disattivati in alcune condizioniCiò consente di:

• non produrre prodotti inutili• economizzare l’energia cellulare• aumentare rapidamente l’attività

quando necessario

44

Reversibilità

delle reazioni enzimatiche

L’enzima favorisce il raggiungimento dell’equilibrio, quindi in teoria catalizza anche la reazione inversa

A BMa, se B è

substrato di una reazione successiva, la prima reazione

diventa praticamente irreversibileA B C

Ciò vale per catene anche molto lunghe di reazioni (catene enzimatiche)

A B C D EAnche se le singole reazioni enzimatiche sono reversibili (specie

quelle con G≈0), in pratica il flusso è

unidirezionale perché

il prodotto di una reazione funge da substrato per la reazione successivaSpesso il prodotto terminale di una sequenza di reazioni (E) inibisce

il deflusso della stessa catena a livello della prima reazione A

B • L’accumulo di E “chiude il rubinetto”• La mancanza di E “riapre il rubinetto”

A B C D E

45

Caratteristiche generali delle reazioni regolatorie

G<<0 (maggior efficacia)Precoci nella catena enzimaticaInibizione o regolazione da parte del prodotto finaleGli enzimi coinvolti sono spesso multimerici

• Capacità

catalitica = (concentrazione di enzima) x (efficienza catalitica)

46

Controllo della concentrazione di enzima (regolazione lenta)

Regola generale: Tutte le strutture cellulari ed extracellulari (ad eccezione dell’eritrocita umano) sono sottoposte a ricambio

ed equilibrio dinamicoQuindi, ad ogni istante, il livello di un enzima dipende da:Velocità

di sintesi della proteina

Velocità

di trasformazione da zimogeno (o pro-enzima) in enzima attivoVelocità

di degradazione

47

Velocità

di sintesi

Può aumentare in seguito all’accumulo intracellulare del substrato (es: operon

del lattosio)

Può aumentare in presenza di induttori gratuiti senza relazione col substrato Può essere repressa dai prodotti terminali della catena

enzimatica (es: alcuni aminoacidi (His, Leu), effetto glucosio in E.coli)

48

Chimotripsinogeno

chimotripsina

49

Attivazione

degli

zimogeni

pancreatici

mediante

taglio proteolitico

50

Funzioni biologiche della proteolisi ubiquitina- dipendente

Regolazione del ciclo cellulare• Essenziale per uscire dalla fase mitotica e separare i cromosomi

durante mitosi e meiosi• Malfunzionamenti causano formazione di cellule con numero

anomalo di cromosomi (Down e tumori solidi)Riparazione del DNA, cancro e apoptosi

• Essenziale per mantenere il livello di p53 (il guardiano del genoma)

Risposte immunologiche e infiammatorie• Regolazione di NF-kB

(fattori di trascrizione) per attivare

l’espressione genica• Generazione di peptidi MHC (difesa contro le infezioni virali)

Fibrosi cistica• Coinvolta nella mutazione di CFTR (transmembrane

conductance

regulator)

51

Compartimentalizzazione

Si può ottenere un forte aumento di concentrazione di molecole compartimentalizzandole in una zona delimitata da una

membrana

52

Modulazione dell’attività

dell’enzima (regolazione veloce)

pH TemperaturaInibizione reversibile ed irreversibile:

• Competitiva• Non-competitiva• Uncompetitiva

Modificazioni allostericheModificazioni covalenti

53

pH

Attività

pH e attività

enzimatica

Ogni enzima ha il suo pH ottimaleIl pH ottimale può non

corrispondere col pH in cui si trova l’enzima

54

Temperatura e attività

enzimatica

Per ogni enzima, esiste una temperatura ottimaleLa temperatura ottimale può non corrispondere con la temperatura in

cui si trova l’enzima (37°C)

Aumento dovuto alla temperatura

(1.7-2.5 ogni 10°C)Diminuzione dovuta alla denaturazione della proteina

Risultato

0 10 20 30 40 50

Atti

vità

Temperatura

55

Inibizione competitiva e non-competitiva

Competitiva:S e I si legano al sito attivo,

EI è

inattivo

Non-competitiva:Quando E lega I, cambia la conformazione e diventa

inattivo

56

Inibizione competitiva

I simile a S, compete con S per il sito attivo di EInibizione reversibile all’aumentare di [S]Vmax

non cambia, KM

aumenta

Vmax

1/[S]

1/v0

1/KM

1/Vmax

[S]

v0

inibitore

inibitore

KM

Vmax

/2

57

Esempi di inibizione enzimatica competitiva

CH3

OH CH3

-CH2

OHMetanolo

Etanolo

58


Metotrexato

o antifolato, antileucemico che rallenta la biosintesi di purine

e pirimidine

59


Fluorouracile, analogo della mercaptopurina

60


Substrati suicidi o antimetaboliti, prevengono la reazione col substrato e/o disattivano l’enzima

Penicillina inibisce transpeptidasi

che stabilizza le membrane batteriche

61

Inibizione non competitiva

I reagisce su un sito diverso dal sito attivoTende a disattivare EInibizione non reversibile all’aumentare di [S]KM

non cambia, Vmax

diminuisce

1/KM 1/[S]

1/v0

1/Vmax

[S]

v0

inibitore

inibitoreVmax

KM

Vmax

/2

62

Esempi di inibizione non-competitiva

Degradazione proteica (temperatura, estremi di pH)Molti veleni e composti mercuriali (reagiscono con -SH dei

residui di Cys)Cianuro, reagisce con gli ioni metallici degli enzimi della

catena respiratoriaDiisopropil

fluorofosfato

(Sarin), gas nervino, inibisce gli

enzimi contenenti Ser

(acetilcolinesterasi)

63

Inibizione uncompetitiva

I si lega al complesso ES

64

Inibizione uncompetitiva

L’inibitore reagisce con il complesso ESCambiamenti simultanei di KM

e Vmax

1/KM

Vmax

[S]KM1/[S]

1/V0

1/Vmax

V0

+ inibitore

+ inibitore

65

Modificazioni covalenti degli enzimi

La fosforilazione AUMENTA l’attività

di alcuni enzimi• Glicogeno fosforilasi, citrato liasi, fosforilasi b chinasi, HMG-

CoA

reduttasi chinasi e altri...La fosforilazione DIMINUISCE l’attività

di altri enzimi

• Acetil-CoA

carbossilasi, glicogeno sintasi, piruvato deidrogenasi, HMG-CoA

reduttasi e altri...

Caratteristiche fondamentali della catalisi enzimatica e ...

Documents

Transcript of Caratteristiche fondamentali della catalisi enzimatica e ...