FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ANALISI ENZIMATICA...

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ANALISI ENZIMATICAANALISI ENZIMATICA

L’analisi enzimatica comprende tre tipi principali di applicazioni:

• determinazione dell’ attività cataliticaattività catalitica di enzimi

• determinazione della concentrazioneconcentrazione di sostanze per mezzo di enzimi

• determinazione della concentrazioneconcentrazione di sostanze mediante reattivi

marcati con enzimi

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• Gli enzimi sono macromolecole biologiche di natura proteica, con

gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di

sostanze

• Svolgono una funzione di catalizzatori (biologici), cioè accelerano le

reazioni chimiche o fanno avvenire reazioni che altrimenti non

avrebbero luogo

• Sono caratterizzati da:

- elevato potere cataliticopotere catalitico

- altissima specificitàspecificità

ENZIMIENZIMI

E + S ES E + P

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ENZIMI

X

G

G Y

Reazione non catalizzata

G*

G*

Reazione catalizzata

• Gli Enzimi differiscono dai catalizzatori chimici per:

–Le velocità delle reazioni catalizzate da enzimi sono generalmente da 106 a 1012 più veloci di quelle non catalizzate.

–Gli Enzimi catalizzano reazioni in condizioni relativamente blande, condizioni fisiologiche

–Gli Enzimi spesso hanno un’elevata specificità verso substrati e prodotti.

–L’attività degli Enzimi può essere regolata da altri fattori oltre che da substrato e prodotti.

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COFATTORI ENZIMATICICOFATTORI ENZIMATICI

- OloproteineOloproteine

• l’attività dipende soltanto dalla struttura proteica

- Eteroproteine:Eteroproteine:

• l’attività richiede uno o più componenti non proteici, chiamati cofattori

• Il cofattore può essere:- un coenzima (NAD+, NADP+, ADP, ATP)- un gruppo prostetico (FMN, FAD)- uno ione metallico (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+)

APOENZIMA (Parte proteica)

OLOENZIMA

coenzima

ione metallico

gruppo prostetico (legato covalentemente)

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VITAMINE: precursori di coenzimi

COFATTORI

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CLASSIFICAZIONE DEGLI ENZIMICLASSIFICAZIONE DEGLI ENZIMI

1. ossidoreduttasi

2. transferasi

3. idrolasi

4. liasi

5. isomerasi

6. ligasi

•Gli enzimi sono suddivisi in sei classi principali a seconda della natura

generale delle reazioni catalizzate:

Ciascuna classe comprende delle sottoclassi, che a loro volta

comprendono delle sotto-sottoclassi

•Un enzima ha generalmente:

-un nome comune

-un nome sistematico

-un numero di classificazione

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NOMENCLATURANOMENCLATURA

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UNITÀ DI MISURAUNITÀ DI MISURA

• Un enzima può essere misurato in termini di concentrazione come

qualunque altra proteina

• Da un punto di vista analitico interessa invece la misura dell’attività attività

cataliticacatalitica (o attività enzimatica)

• L’attività enzimatica si esprime in Unità Internazionali (U.I.)(U.I.)

Una unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima in

grado di catalizzare la trasformazione di una micromole di substrato al

minuto in condizioni standardizzate

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G6125 Glucose Oxidase Aspergillus niger Type II 15,000-25,000 units/g solid (without added oxygen)

Synonyms -D-Glucose: oxygen 1-oxidoreductase

GOx

G.Od.

CAS Number 9001-37-0

Enzyme Commission (EC) Number

1.1.3.4

EG/EC Number EINECS

MDL number MFCD00131182

Analysis Note Protein determined by Biuret method.

Caution Some loss of activity may occur after more than 3 days at room temperature. This product may be shipped with or without dry ice.

Linkage This preparation is formulated from Type VII, G 2133, by addition of potassium gluconate.

Unit Definition One unit will oxidize 1.0µmole of -D-glucose to D-gluconolactone and H2O2per min at pH 5.1 at 35° C, equivalent to an O2uptake of 22.4µl per min. If the reaction mixture is saturated with oxygen, the activity may increase by up to 100%.

Propertiesstorage temp. 20°Cforeign activity Catalase2 Sigma units/mg solidforeign activity amylase, invertase and glycogenase, and maltase and galactose oxidase ~2 %

ReferencesMerck Merck13, 4473

Safety Information

Hazard Codes XnRisk Statements 42Safety Statements 22-45RTECS RQ8452000

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P6782 Peroxidase horseradish Type VI-A ~1000 units/mg solid (using ABTS) 250-330 units/mg solid (using pyrogallol) essentially salt-free, lyophilized powder

Synonyms Horseradish peroxidase

Donor: hydrogen-peroxide oxidoreductase



1.11.1.7

EG/EC Number 2326686


Analysis Note This product is assayed using ABTS for easy comparison to other suppliers'unit: approx. 1,000 units per mg solid

Linkage Similar to P8375

Packaging Packaged in mg solid

Unit Definition One ABTS unit will oxidize 1µmole of ABTS per minute at 25°C at pH 5.0

Analysis Note Using 2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) tablets (Prod. No. A 9941) as substrate, approx. four times the activity is observed.

Analysis Note The RZ ( Reinheitszahl) is the absorbance ratio A403/A275determined at 0.5-1.0 mg/ml in deionized water. It is a measure of hemin content, not enzymatic activity. Even preparations with high RZ may have low enzymatic activity.

Unit Definition One unit will form 1.0 mg purpurogallin from pyrogallol in 20 sec at pH 6.0 at 20°C, unless otherwise indicated in the listing. This purpurogallin (20 sec) unit is equivalent to approx. 18µM units per min at 25°C.

Description

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C5421 Cholesterol Oxidase from Cellulomonas sp. buffered aqueous solution 20-60 units/mg protein (biuret)

Synonyms Cholesterol: oxygen oxidoreductase



1.1.3.6


Unit Definition One unit will convert 1.0µmole of cholesterol to 4-cholesten-3-one per min at pH 7.5 at 25 °C. Note: 4-cholesten-3-one may undergo isomerization.

Physical form Solution in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0

storage temp. 20°C

Literature Smith, A.G. and Brooks, C.J.W.,Biochem. Soc. Trans. 5, 1088 (1977)

Identifiers

Description

Properties

References

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Glucose Dehydrogenase Bacillus megaterium BioChemika ~33 units/mg

Identifiers

Synonyms -D-Glucose: NAD[P]+1-oxidoreductase



1.1.1.47

EG/EC Number 2328369


Description

Miscellaneous NADH-regenerating enzyme. Valine manufacture from ketoisovalerate

Unit Definition 1 U corresponds to the amount of enzyme which will oxidize 1µmol-D-glucose to D-glucono--lactone per minute at pH 7.6 and 25°C

Properties

mol wt Mr~120000

storage temp. 20°C

References

Literature A. Honorat-Pascal et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, 236 (1990)

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ISOENZIMI

• Gli enzimi non hanno una struttura omogenea

Isoenzimi: proteine che catalizzano la stessa reazione e presentano diverse proprietà molecolari (diversa carica elettrica,

diversa solubilità, diversa resistenza ad agenti chimici e fisici) e/o diverseproprietà funzionali presentano differenze in termini di pH ottimale,

affinità per substrato e coenzima…..

Es.Isoenzimi della lattato deidrogenasi LDH: LDH1 4 subunità H LDH2 3 subunità H e da una M (H3M) (miocardio, eritrociti, rene e polmone)

LDH3 (H2M2) (milza, pancreas, tiroide, linfonodi) LDH4 (HM3) LDH5 (M4) (fegato e muscoli scheletrici)

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METODI DI STUDIO DI ISOENZIMI

•Metodi elettroforetici

•Metodi cromatografici

•Metodi di elettrofocalizzazione

METODI NON SELETTIVI

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METODI DI STUDIO DI ISOENZIMI

METODI SELETTIVI

•Inibizione chimica Ioni metallici, fluoruri, etanolo, solventi organici,…

•Inibizione fisica Determinazione degli isoenzimi della fosfatasi alcalina e lattato deidrogenasi

•Inibizione immunologica Anticorpi

•Reattività selettiva verso un substrato Determinazione di LDH1

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Infarto miocardico

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Diagnosi differenziale di infarto del miocardio e epatite acuta

ESEMPIO DI UTILIZZO DIAGNOSTICO DI ISOENZIMI

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ENERGIA LIBERA DI ATTIVAZIONEENERGIA LIBERA DI ATTIVAZIONE

• L’energia libera di attivazione G è la quantità di energia necessaria per portare tutte le molecole di 1 mole di una sostanza, ad una data temperatura, allo stato di transizione

stato iniziale

stato finale

statodi transizione

energia libera di attivazione della reazione in avanti (catalizzata)

energia libera di attivazione della reazione in avanti (non catalizzata)

energia libera di attivazione della reazione inversa (non catalizzata)

energia libera di attivazione della reazione inversa (catalizzata)

cambiamento totale di energia libera durante la reazione

direzione della reazione

ener

gia

liber

a

• Gli enzimi esercitano la loro attività catalitica abbassando l’energia libera di attivazione

• Di conseguenza, in presenza di enzima sarà maggiore la concentrazione della specie allo stato di transizione

• La velocità di reazione è proporzionale alla concentrazione della specie allo stato di transizione

• Quindi, gli enzimi esercitano la loro attività catalitica aumentando la velocità aumentando la velocità delle reazioni chimichedelle reazioni chimiche

E + S ES E + P

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ATTIVITÀ ENZIMATICAATTIVITÀ ENZIMATICA

• L’attività di un enzima’attività di un enzima viene misurata come velocità della reazione

da esso catalizzata

• La velocità di reazionevelocità di reazione viene misurata in termini di quantità di

substrato trasformato, o di prodotto che si forma, nell’unità di tempo

• La velocità delle reazioni chimiche è soggetta a leggi chimico-fisiche

ben definite che consentono di ricavare delle equazioni della velocità

diverse a seconda del tipo di reazione. Queste equazioni mettono in

relazione la velocità di reazione con la concentrazione dei reagenti

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CINETICA CHIMICACINETICA CHIMICA

• Le reazioni chimiche vengono classificate su base cinetica per mezzo dell’ordine di reazione che indica come la velocità di reazione dipende dalla concentrazione dei reagenti

• Reazioni di 1° ordine1° ordine]A[K

dt

]A[dv

A P

A + B P

2 A P

• Reazioni di 2° ordine2° ordine

]B][A[Kdt

]A[dv

2]A[Kdt

]A[dv

• Reazioni di ordine 0ordine 0 La velocità di reazione non dipende dalla concentrazione dei reagenti

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• In una reazione chimica non catalizzata la velocità di reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato e il grafico velocità-concentrazione è una linea retta

A P

EA P

• In una reazione enzimatica la dipendenza della velocità di reazione dalla concentrazione del substrato non è costante, ma varia al variare della concentrazione del substrato stesso

• Il grafico velocità-concentrazione è un’iperbole rettangolare, descritta da un’equazione del tipo

dove la velocità v e la concentrazione di substrato [s] sono le due variabili,

mentre V e Km sono due costanti

[substrato]

ve

loc

ità

][

][

sK

sVv

m

CINETICA ENZIMATICACINETICA ENZIMATICA

vmax

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EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN

• L’equazione vista in precedenza, che descrive la relazione velocità-concentrazione

di substrato in una reazione enzimatica, è l’equazione di Michaelis-Menten

• Come già detto, Vmax è la velocità dello stadio limitante della reazione enzimatica ad

alte concentrazioni di substrato, quindi Vmax = k2[ES]

• Ad alte concentrazioni di substrato l’enzima è saturato, perciò [ES] = [E], da cui

Vmax = k2[E]

• L’equazione può essere scritta in una forma diversa che evidenzia la dipendenza

della velocità, oltre che dalla concentrazione di substrato, dalla concentrazione di

enzima

]s[K

]s[Vv

m

max

]s[K

]s[]E[kv

m2

k1 k2

E + S ES E + P k-1

k1 k2

E + S ES E + P k-1

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• Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato

• Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni

][s Km>>

1° ordine

Regione 1

La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S]

Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato

][][2

KsE

kvm

][max

KsV

m

1

2

3

CINETICA ENZIMATICA

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Regione 2

Regione non utile dal punto di vista analitico

][s intermedie ordine misto

v maxVmax

2V

][s Km>> ordine 0

Regione 3

][2 Ekv maxV

Regione analitica per la determinazione della attività enzimatica

1

2

3

CINETICA ENZIMATICA

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DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: DETERMINAZIONE ATTIVITA’ ENZIMATICA: VELOCITÀ INIZIALEVELOCITÀ INIZIALE

tempo

[P]

• La misura di attivita’ enzimatica e’ una misura di velocita’ inizialevelocita’ iniziale della reazione (v0) o (vi)

Vantaggi:

Si misura sicuramente la Vmax

L’enzima è in buone condizioni

Non ci sono problemi di inibizione da prodotto

Possibilità di distinguere tra attività enzimatiche diverse

Metodi analitici rapidi

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(s/T) Approccio dispendioso in termini di tempo

Si utilizzano metodi ad un punto, a due punti, multipuntometodi ad un punto, a due punti, multipunto

tempo

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• Teoricamente sarebbe possibile misurare l’attività enzimatica

anche nella fase di plateau, quando la velocità di reazione è nulla

• Bisognerebbe misurare il tempo necessario per raggiungere il

plateau

• Maggiore è l’attività enzimatica, minore sarà il tempo necessario

per raggiungerlo

• Inconvenienti:

– difficoltà di effettuare una misura accurata del tempo (elevato

errore sulla misura)

– tempi lunghi di esecuzione del metodo, in particolare per la

misura di attività enzimatiche basse

tempo

[P]


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METODI AD UN PUNTOMETODI AD UN PUNTO

• Affinchè la misura sia accurata:

– il segnale al tempo 0 deve essere 0 oppure, se diverso da 0, deve essere costante e bisogna misurarlo (bianco della reazione) per poi sottrarlo

– ci deve essere linearità di risposta dal tempo 0 al tempo x al quale viene eseguita la misura

• Si effettua una sola misura di segnale (ad es. assorbanza) ad un tempo prestabilito dopo l’inizio della reazione

• Si risale all’attività enzimatica tramite una curva di calibrazione o un fattore di conversione

tempo

seg

na

le

tx

Sx

• La condizione di linearità si verifica se la misura viene effettuata il prima possibile dopo l’inizio della reazione. In questo caso si misura una piccola variazione di segnale, che sarà accompagnata da un maggiore errore relativo


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METODI AD UN PUNTOMETODI AD UN PUNTO

Ci sono due approcci per l’esecuzione di metodi ad un punto

• Metodi manuali e metodi automatizzati basati su analizzatori discreti analizzatori discreti automatici

- Per effettuare la misura ad un tempo prestabilito la reazione enzimatica viene bloccata (variazione di pH o temperatura, aggiunta di un inibitore)

• Metodi automatizzati basati su analizzatori a flussoanalizzatori a flusso continuo automatici

- Campione e reagenti fluiscono attraverso un sistema di tubi mentre avviene la reazione e passano di fronte o attraverso il sistema di rivelazione. Il tempo al quale raggiungono il rivelatore viene definito regolando il flusso e la posizione del rivelatore lungo il sistema

Approccio tecnico


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METODI A DUE PUNTIMETODI A DUE PUNTI

Affinchè la misura sia accurata:

• ci deve essere linearità di risposta tra i due tempi t1 e t2 ai quali viene eseguita la

misura

Si effettuano due misure di segnale (ad es. assorbanza) a due tempi prestabiliti dopo l’inizio della reazione

Si potrebbero anche misurare i tempi necessari per raggiungere due valori prestabiliti di segnale, ma sarebbe più difficile automatizzare il sistema

Questi metodi presentano il vantaggio di non richiedere la misura del bianco della reazione perché l’attività enzimatica viene calcolata come S / t

tempo

seg

na

let1

S1

t2

S2


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METODI A DUE PUNTIMETODI A DUE PUNTI

Ci sono due approcci per l’esecuzione di metodi a due punti

• Metodi automatizzati basati su analizzatori discretianalizzatori discreti automatici

- Ovviamente non si può bloccare la reazione al primo tempo di misura

- A tempi prestabiliti vengono prelevate due aliquote di miscela di reazione in cui la reazione viene bloccata e si misura il segnale

• Metodi automatizzati basati su analizzatori a flussoanalizzatori a flusso continuo automatici

- La miscela di reazione fluisce attraverso due rivelatori posti ad una certa distanza fissa

- Il flusso deve essere regolato accuratamente perché da esso dipendono i tempi ai quali vengono effettuate le misure

Approccio tecnico


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ENZIMI IN DIAGNOSTICA

Significato della presenza di enzimi intracellulari nel plasma–Aumento del turnover cellulare–Proliferazione cellulare (neoplasia)–Aumento di sintesi enzimatica (induzione)–Lesione di un tessuto–Ostruzione della secrezione–Diminuzione della eliminazione (clearance)

Concentrazione degli enzimi nel plasma dipende da:-sintesi dell’enzima-stato d’integrità delle membrane cellulari-fenomeni di distribuzione-velocità di eliminazione

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Alcuni enzimi del plasmaEnzima Organo Cause di aumento Note

Fosfatasi alcalina (ALP)

Fegato, osso, placenta, epitelio intestinale

Gravidanza, infanzia

Osteomalacia, cirrosi epatica,

Tumori ossei, iperparatiroidismo, fratture, infiammazione intestinale

Isoenzimi identificabili per elettroforesi

Fosfatasi acida

Prostata Tumore prostatico Enzima labile

Aspartato transami-nasi (AST o GOT)

Fegato e miocardio

Epatite/necrosi epatica,

Infarto, traumi, malattie muscolari, epatite cronica

Fisiologico in neonati

Normale: ALT<AST

Epatite: ALT>AST

Gamma glutamil transferasi (GGT)

Fegato, rene, pancreas

Colestasi epatica

Epatite, cirrosi, pancreatite

Ingestione di alcool o farmaci, insufficienza cardiaca

Marker di sindromi epatobiliari

Creatin chinasi (CK)

Distrofia muscolare, infarto del miocardio BB cervello

MB cuore

MM muscolo

Amilasi Ghiandole salivari, pancreas

Pancreatite, ulcera duodenale, ostruzione intestinale, chetoacidosi diabetica, calcoli o infiammazione delle ghiandole salivari

Lattato

Deidrogenasi

(LDH)

Isoenzimi danno indicazioni più

specifiche

Alanina Transaminasi

(ALT o GPT)

Fegato Aumenta in epatiti e cirrosi

Colineste-rasi Fegato Livello basso indica disfunzione epatica

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N –

CH

IMIC

A A

NA

LIT

ICA

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PP

LIC

AZ

ION

I C

LIN

ICH

E

EFFETTO DEL pHEFFETTO DEL pH

Il profilo a campana è il più comune

6 8 10

tripsina

6 8 10

colinesterasi

4 6 8

papaina

2 4 6

pepsina

pH

attiv

ità e

nzim

atic

a re

lativ

a

FA

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N –

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NA

LIT

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I C

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ICH

E

EFFETTO DELLA TEMPERATURAEFFETTO DELLA TEMPERATURA

• Gli enzimi hanno diversa stabilità termica

• La parte discendente della curva è dovuta alla denaturazione termica

T (°C)

attiv

ità e

nzim

atic

a re

lativ

a

20 40 60

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LIT

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LIN

ICH

E

MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICAMISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA

Reazioni enzimatiche semplici

Condizioni sperimentali

– Substrato ed eventuali Cofattori in eccesso

– pH e Temperatura controllati rigorosamente

– Attenzione alla inibizione da substrato

SE

P


FA

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N –

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NA

LIT

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E

MISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICAMISURA DI ATTIVITA’ ENZIMATICA

Reazioni enzimatiche accoppiate

Altre condizioni peculiari

– La reazione primaria deve essere l’unico fattore limitante– Le reazioni indicatrici ed ausiliarie devono essere molto più veloci della reazione

primaria, perché se P1 non viene rimosso rapidamente– può spostare il primo equilibrio verso sinistra e ritardare la reazione primaria– può seguire una via metabolica diversa

• Per misure di almeno il 96% dell’attività enzimatica primaria k2 / k1 ≥ 100

SEprim.

P1

Eind.

P3

Eaus.

P2

SEprim.

P1

Eind.

P2k1 k2


– Substrato, eventuali Cofattori ed Enzimi indicatori ed ausiliari in eccesso

– pH e Temperatura controllati rigorosamente

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DETERMINAZIONEDETERMINAZIONE ENZIMATICA DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI

• Gli enzimi non sono l’oggetto dell’analisi, ma vengono utilizzati come

“strumenti” analitici“strumenti” analitici per determinare la concentrazione degli analiti di

interesse con i seguenti vantaggi:

– L’elevata specificità degli enzimi per i loro substrati consente spesso l’analisi

diretta dei campioni biologici, senza o con poche e semplici fasi di estrazione

e purificazione

– L’elevato potere catalitico degli enzimi fa sì che i metodi enzimatici siano

caratterizzati da bassi limiti di rivelazione, il che rende sufficienti volumi molto

piccoli di campione

Maggiore rapidità Maggiore accuratezza

Risparmio di reagenti Prelievo di piccoli volumi di fluidi biologici

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• Una caratteristica particolare delle reazioni enzimatiche è il fenomeno della saturazione dei siti attivi enzimatici da parte del substrato

• Nella curva della velocità di reazione in funzione della concentrazione di substrato si individuano tre regioni

][s Km>>

1° ordine

Regione 1

La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S]

Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato

][][2

KsE

kvm

][max

KsV

m

1

2

3

CINETICA ENZIMATICA

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METODI A PUNTO FINALE SEMPLICIMETODI A PUNTO FINALE SEMPLICI

• Esempio: acido lattico

• Per spostare la reazione dall’equilibrio e spostarla verso destra è necessario rimuovere i prodotti di reazione man mano che si formano

– Accoppiamento con una seconda reazione enzimatica

– Aggiunta di un reagente chimico che si leghi ai prodotti di reazione (idrazina)

Acido latticoAcido lattico + NAD+ Acido piruvico + NADH + H+

LDH

SEind.

P– Le condizioni sperimentali (enzima indicatore in eccesso, pH e T

ottimali) non sono sufficienti per garantire che il substrato venga consumato completamente


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METODI A PUNTO FINALE ACCOPPIATIMETODI A PUNTO FINALE ACCOPPIATI

– La reazione indicatrice svolge anche la funzione di rimuovere

continuamente i prodotti di reazione man mano che si formano,

garantendo lo spostamento verso destra della reazione ed il

consumo completo del substrato


– Enzimi indicatore ed ausiliario in eccesso

– pH e Temperatura ottimali

SEaus.

P1

Eind.

P2


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METODI DI MISURAMETODI DI MISURA

• La possibilità di “vedere” una reazione enzimatica è legata al fatto che i substrati e i prodotti hanno proprietà chimico-fisiche diverse

• Tali proprietà devono poter essere misurabili

• I metodi di rivelazione più comuni in enzimologia sono:

– spettrofotometrici

– luminometrici

• Altri metodi sono:

– potenziometrici, conduttometrici, polarografici

• Ci sono, inoltre, metodi basati su enzimi immobilizzati

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METODI SPETTROFOTOMETRICIMETODI SPETTROFOTOMETRICI

I metodi spettrofotometrici sono quelli maggiormente utilizzati

e si basano su:

I. Misura diretta

II. Misura mediante derivati chimici

III. Misura mediante derivati generati enzimaticamente

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• Formazione di prodotti della reazione enzimatica che assorbono nel Vis (metodi colorimetrici)

– Esempio:

p-nitrofenilfosfato +H2O p-nitrofenolo + fosfato

fosfatasi alcalina rivelata mediante il substrato cromogenico p-nitrofenilfosfato, idrolizzato enzimaticamente a p-nitrofenolo che in ambiente basico assorbe a 405 nm (giallo)

• Formazione di prodotti della reazione enzimatica che assorbono nell’UV (gruppi ciclici e doppi legami)

– Esempio: uricasi rivelata mediante l’assorbimento a 293 nm dell’acido urico che viene trasformato dall’enzima in allantoina

• Inconvenienti della misura di assorbimento nell’UV:– lampada a idrogeno per generare 200-300 nm

– cuvette di quarzo costose

– proteine ed acidi nucleici nel campione che assorbono nell’UV

I. Misura diretta

AP

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• L’attività enzimatica delle

ossidoreduttasi che utilizzano

(consumano o producono) NAD(P)H

come cofattore può essere determinata

direttamente perché il NAD(P)H ha un

massimo di assorbimento caratteristico

a 340 nm che non si trova nel cofattore

in forma ossidata NAD(P)+

• Il NAD(P)H può essere misurato anche in fluorescenza, con un massimo di

eccitazione a 340 nm ed un massimo di emissione a 460 nm

– Vantaggi: più basso limite di rivelazione teorico

– Svantaggi: interferenze della matrice che producono un alto segnale di fondo

Lunghezza d’onda (nm)

Ass

orb

anz

a

I. Misura diretta

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• Sali di tetrazolio

Composti cromogenici che vengono ridotti a formazani caratterizzati da valori elevati del coefficiente di assorbività molare


N

R3C

NR2

N+R1

N

Cl-

N

CR3

R2N

+ N

N

N

R3C

NR2

N+

N

Rx Ry2Cl-

Sale monotetrazolico Sale ditetrazolico

R = gruppi aromatici

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• Sali di tetrazolio

Esempio: alcol deidrogenasi

• Il valore di dei formazani (m2/mol) è 2-4 volte più alto di quello del NAD(P)H

(m2/mol) , perciò si ottengono limiti di rivelazione 2-3 volte più bassi (A = bc)

Etanolo

Acetaldeide

NAD+

NADH + H+ PMS

PMSH

Prodotto di riduzione (formazano)

Sale di tetrazolio

PMS = fenazina metasolfato

Alcol deidrogenasiAlcol deidrogenasi


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•Accoppiamento con ossidoreduttasi

YH2 + NAD(P)+ Y + NAD(P)H + H+

X + NAD(P)H + H+ XH2 + NAD(P)+

Esempio: alanina aminotrasferasi (ALT) mediante lattato deidrogenasi (LDH)

2-Oxoglutarato

Glutammato

Alanina

Piruvato Piruvato

Lattato

NADH + H+

NAD+

ALTALT LDH

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•Accoppiamento con perossidasi

Esempio: glucosio ossidasi

Glucosio

Acido gluconico

H2O + O2

H2O2 Accettore cromogenico o luminogenico

Prodotto colorato o fotoni

Glucosio Glucosio ossidasiossidasi

Perossidasi


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Esempio: fosfolipasi

Fosfatidilcolina + 2H2O Acido fosfatidico + ColinaFosfolipasi

Colina + 2O2 Betaina + 2H2O2

Colina ossidasi

2H2O2 + Accettore Prodotto colorato + 2H2O + O2

Perossidasi

•Accoppiamento con perossidasi


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ASPETTI QUANTITATIVIASPETTI QUANTITATIVI

• interpolazione del valore di segnale su una curva di calibrazione

costruita con degli standard a concentrazione nota di analita

• confronto con un’unico standard, attraverso la relazione

derivante dalla legge di Lambert-BeerCsAs

AcCc

b

AcCc

b

AsCs

Cs

Asb Cs

As

AcCc

Nel caso della concentrazione dell’analitaconcentrazione dell’analita nel campione tramite

enzimi, nei metodi spettrofotometrici questa viene determinata

mediante:

• Quando non si dispone di uno standard puro, la

concentrazione dell’analita viene ricavata mediante il coefficiente

di estinzione molare del prodotto colorato, sfruttando la legge di

Lambert-Beer

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ASPETTI QUANTITATIVIASPETTI QUANTITATIVI

Perciò bisogna tenere conto del volume V della miscela di reazione

e del volume v del campione:

v

V

b

A)L/mmol(C

v

V

10b

.m.pA)dL/mg(C

Gli analizzatori automatici vengono programmati in modo da

applicare funzioni che tengono conto di questi fattori

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METODI NON SPETTROFOTOMETRICIMETODI NON SPETTROFOTOMETRICI

•Misure conduttimetriche

CO(NH2)2 + H2O 2NH4+ + CO3

2-UreasiUreasi

Esempio

Utilizzo di elettrodo specifico per NH4+

•Misure polarografiche

glucosio + O2 acido gluconico + H2O2

Glucosio ossidasiGlucosio ossidasiEsempio

Utilizzo di elettrodo selettivo per O2

È disponibile un analizzatore automatico commerciale per la determinazione del glucosio basato su questo principio

perossidasiperossidasi

accettore prodotto colorato

derivatizzazionechimica

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METODI NON SPETTROFOTOMETRICIMETODI NON SPETTROFOTOMETRICI

•Misure potenziometriche

triacilgliceroli + H2O diacilgliceroli + monoacilgliceroli + ac. grassi- + H+

LipasiLipasi

Esempio

Utilizzo di elettrodo per H+ (misura di pH)

•Misure microcalorimetriche

Utilizzo di un termistore che consente di misurare le microvariazioni di calore che accompagnano le reazioni enzimatiche

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ENZIMI IMMOBILIZZATIENZIMI IMMOBILIZZATI

Vantaggi

• Possibilità di recuperare e riutilizzare gli enzimi al termine della reazione (riduzione dei costi)

• Stabilità (risultati molto accurati e riproducibili)

• Possibilità di automazione, ad esempio immobilizzando gli enzimi su gel di poliacrilammide e formando con esso delle colonne

• Riproduzione più fedele della situazione che si verifica nelle cellule, specialmente per quegli enzimi che sono fissati su organuli cellulari

Nel caso della determinazione della concentrazione di analiti mediante enzimi, gli enzimi possono essere immobilizzati su supporti insolubili quali cellulosa, polipeptidi, polimeri sintetici

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ENZIMI IMMOBILIZZATI SU ELETTRODIENZIMI IMMOBILIZZATI SU ELETTRODI

• Un elettrodo specifico per gli ioni ammonio viene rivestito con un gel impregnato di ureasi

• L’urea permea il gel dove viene idrolizzata dall’enzima formando ioni ammonio

Gli enzimi possono essere immobilizzati su un elettrodo specifico per il composto che viene modificato o prodotto nel corso della reazione enzimatica, ottenendo così un biosensore enzimatico

CO(NHCO(NH22))22 + 2H2O + H+ 2NH4+ + HCO3

-Ureasi

Esempio

• In alternativa, un normale elettrodo per pH viene rivestito con un gel impregnato di ureasi e si misura il cambiamento di pH conseguente all’idrolisi enzimatica dell’urea

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PRINCIPI DI RIVELAZIONEPRINCIPI DI RIVELAZIONE

• Oltre ai principi di rivelazione convenzionali quali:

– spettrofotometria

– spettrofluorimetria

• un altro principio di rivelazione si è affermato, in particolare nel settore

dei metodi immunoenzimatici (utilizzo di reattivi marcati con enzimi):

– chemiluminescenza

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BIOLUMINESCENZA E CHEMILUMINESCENZABIOLUMINESCENZA E CHEMILUMINESCENZA

• La luminescenzaluminescenza è l’emissione di radiazione elettromagnetica

nell’UV, visibile o IR da parte di atomi o molecole come risultato della

transizione da uno stato elettronicamente eccitato ad un livello

energetico più basso, solitamente lo stato fondamentale

• La chemiluminescenza (CL)chemiluminescenza (CL) è un fenomeno di luminescenza in cui

l’energia per generare lo stato elettronicamente eccitato deriva da una

reazione chimica

• La bioluminescenza (BL)bioluminescenza (BL) è un fenomeno di chemiluminescenza nel

visibile che si verifica in organismi viventi

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SISTEMI CHEMILUMINESCENTISISTEMI CHEMILUMINESCENTI

• Sono stati definiti due tipi principali di reazioni CL: dirette ed indirette

• Le reazioni indirette sono dette CL a trasferimento di energia

Prodotto + [Accettore]*

Substrato CL

[Prodotto]*

Prodotto + h Accettore + h

+ Accettore

Diretta Indiretta

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luminolo

NHNH

NH2 O

O

aminoftalato

+ N2 + H2O + hperossidasi

H2O2/OH-

COO-

NH2

COO-

Luminolo/H2O2/Perossidasi

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1,2-Diossietani-fenil-fosfato/Fosfatasi alcalina

HPO42-

O

+

O-OOCH3

*+ F F + h

O OOCH3

OPO32-

AMPPD

O-OOCH3 *

+ F

fosfatasi alcalina

OCH3

O-AMP-D

O O

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1,2-Diossietani-fenil--D-galattopiranoside/-Galattosidasi

O O OCH3

O O

OH

HO OH OH

O

O O OCH3

o-

OOCH3

o-

Oh+

-galattosidasi

+

OCH3

o-

O*

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SISTEMI BIOLUMINESCENTISISTEMI BIOLUMINESCENTI

• Luciferina/luciferasi da lucciola, in particolare da Photinus pyralis

(lucciola nord-americana)

• L’efficienza quantica F di questa reazione è vicina a 1

luciferina + ATP + O2 ossiluciferina + CO2 + AMP + P~P + luceluciferasi

Mg2+

+ AMP + + luceN

S

S

NHO COOHH

N

S

S

NHO O

+ ATP

O2, Mg2+

luciferina

luciferasipirofosfato

BL/CL =n. fotoni emessi

n. molecole reagenti

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SISTEMI BIOLUMINESCENTISISTEMI BIOLUMINESCENTI

• Luciferina/luciferasi da diverse specie di batteri marini quali Vibrio

fischeri, V. harvei, Photobacterium phosphoreum

• Il sistema batterico luciferina/luciferasi in vivo è accoppiato ad una

ossidoreduttasi che produce FMNH2

O2

NAD(P)H + H+ + FMN NAD(P)+ + FMNH2

FMNH2 + R-CHO + O2 FMN + R-COOH + H2O + luce

ossidoreduttasi

luciferasi

CH3(CH2)12CHO + FMNH2 CH3(CH2)12COOH + FMN +

luciferina batterica

luciferasi batterica

luce

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ASPETTI QUANTITATIVI e CARATTERISTICHE ANALITICHEASPETTI QUANTITATIVI e CARATTERISTICHE ANALITICHE

Aspetti quantitativi:

• La maggior parte delle reazioni BL e CL coinvolge enzimi

• In presenza di un eccesso di substrato l’intensità del segnale luminoso è

proporzionale all’attività enzimatica

• Al contrario, in presenza di un eccesso di enzima l’intensità dell’emissione

luminosa è proporzionale alla concentrazione di substrato

• La bio- e chemiluminescenza rappresentano quindi un principio di rivelazione

adatto all’analisi quantitativa

Caratteristiche analitiche:

• Rivelabilità superiore a quella delle reazioni colorimetriche e comparabile a

quella dei radioisotopi

• Minimo segnale di fondo dovuto alla matrice biologica rispetto alla

fluorescenza

• Ampio intervallo dinamico

• Rapidità di risposta

• Costi ridotti e minori rischi rispetto all’uso di marcatori radioattivi

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APPLICAZIONI ANALITICHEAPPLICAZIONI ANALITICHE

• Determinazione dell’attività della perossidasi endogena in

fluidi biologici, omogenati di tessuto, ..

• Determinazione della concentrazione di metaboliti o

dell’attività di enzimi mediante reazioni enzimatiche

accoppiate che coinvolgono ossidasi ed il sistema H2O2/H2O

Luminolo/H2O2/Perossidasi

colesterolo ossidasicolesterolo colesterolo H2O2

fosfolipasi D colina ossidasi

fosfolipidifosfolipidi colina H2O2

perossidasiluminolo aminoftalato + N2 + H2O + h H2O2/OH-

FA

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Luciferina/Luciferasi da lucciola

• Determinazione della concentrazione di ATP ed altri nucleotidi

adeninici in campioni biologici

• Determinazione della concentrazione di metaboliti o dell’attività di

enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono

chinasi e la formazione o degradazione di ATP

creatininacreatinina creatina

creatina + ATP creatina-fosfato + ADP

ATP + luciferina + O2 AMP + P~P + CO2 + ossiluciferina + h

creatinina ammide idrolasi

creatina chinasicreatina chinasi

luciferasi

Mg++

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Luciferina/Luciferasi batterica

• Determinazione della concentrazione di NADH e NADPH, con

maggiore sensibilità per il NADH (fmoli)

• Determinazione della concentrazione di metaboliti o dell’attività di

enzimi mediante reazioni enzimatiche accoppiate che coinvolgono

deidrogenasi e la formazione o degradazione di NAD(P)H

R-OHR-OH + NAD+ R=O + NADH

NADH + H+ + FMN NAD+ + FMNH2

FMNH2 + R-CHO + O2 FMN + R-COOH + H2O + h

7-idrossisteroide-deidrogenasi

ossidoreduttasi

luciferasi

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N –

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APPLICAZIONI COMMERCIALIAPPLICAZIONI COMMERCIALI

Rapid Enzymatic Tests for Glucose Introduction:Reagent strips have been designed to perform rapid and semi-quantitative analysis for glucose. They are easy to use and require no addition laboratory equipment of reagents. Three reagent strips, Clinistix, Dextrostix and Diastix, will be used. The enzymatic reactions involved are as described below.Step 1:Glucose -----------Glucose Oxidase --------Glucose ----------------------- > Gluconic Acid + H2O2Step 2: Clinistix and Dextrostix: ----------H2O2 + chromogen orthotolidine- Peroxidase --------H2O2 + chromogen orthotolidine ------------- > oxidized orhotolidine--------Diastix: --------H2O2 + Potassium iodide ---Peroxidase --------H2O2 + Potassium iodide ------------------ > iodine complex The intensity of the color gives a semi-quantitative analysis of the level of glucose in the samples.

Materials: Please refer to class notes and p. 82-82b of the Laboratory Manual .

Bottles of Reagent Strips

Instead of blood and urine samples, Sample Solutions A, B, and C will be usedProcedure:Clinistix: · Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 10 seconds, compare to colour chart providedDextrostix:

· Add a drop of sample solution to the test strip · After exactly 60 seconds, wash with water for 2 second (water bottle) · Blot once gently · Compare to colour chart immediatelyDiastix: · Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 30 seconds, compare to colour chart

FACOOLTA DI SCIENZE MM FF NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE ANALISI ENZIMATICA...

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