6. Cinetica enzimatica

Cinetica Enzimatica

OBIETTIVO PRINCIPALE:

costruire un’equazione che potesse descriverein generale il comportamento cinetico deglienzimi e quindi di determinare parametricinetici più importanti (KM, Vmax, costante dispecificità, costante catalitica) che sono lacarta d’identità di ogni enzima, misurando laVELOCITA’ della reazione catalitica

Relazione tra Velocità econcentrazione del substrato

Km

Vmax


Km

Vmax

A (S) basse la reazione è lineare


Km

Vmax

A (S) alte, SATURAZIONE dell’enzima

La Formazione del complessoES è la CHIAVE per la

comprensione della Cinetica

ES ES Pk1

k-1

k2

dove i termini indicati con k rappresentano le costanti specifiche di velocità direazione.

ES è un intermedio di reazione il cui basso valore di energia di attivazionepermette di fare avvenire una specifica reazione catalizzata

Quando ES in seguito al raggiungimento di uno stato di equilibrio dinamicoassume un valore di concentrazione che si mantiene costante nel tempo, si diceche è stato raggiunto lo stato stazionario (steady state).

ES ES Pk1

k-1

k2




STEP 1

ES ES Pk1

k-1

k2




STEP 2

Perché è importante questa reazione?• E’ GENERALE• DA DUE GRANDEZZE MISURABILI SI OTTENGONOINFORMAZIONI CHE RIGUARDANO LA CINETICA DELL’ENZIMA

Ragionando su questo modello di reazione ad unsubstrato venne elaborata

L’EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN

0

Per ottenere l’equazione di M. M. sono state considerate leseguenti assunzioni teoriche:

• VELOCITA’ INIZIALE (V0), VIENE VALUTATA SOLO LAVELOCITA’ CATALITICA ALL’INIZIO DELLA REAZIONE

•Step limitante è ES E + P

•EQUILIBRIO RAPIDO DEL COMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATOe raggiungimento dello STATO STAZIONARIO DELCOMPLESSO ENZIMA-SUBSTRATO

ASSUNZIONI UTILIZZATE PER COSTRUIREL’EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN

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Michaelis-Menten Kinetics

Km

Vmax

VELOCITA’ INIZIALEUn problema è costituito dalla variazione di (S) nel tempo.Per questo viene considerata la velocità iniziale.In condizioni di (S)>>(E), se si misura la velocità iniziale(V0) la variazione di (S) è trascurabile.Inoltre la velocità iniziale viene misurata in in un periodo ditempo durante il quale la reazione inversa è fisicamentetrascurabile in quanto poco è il prodotto formatosi:la velocità iniziale che può così essere determinata sarà lamassima velocità ottenibile. (c’è molto substrato e la velocitàcontraria alla direzione della reazione è bassissima)

In condizioni di velocità iniziale la reazione è di fattoirreversibile (k-2=0) e deve essere scritta nel seguentemodo:






0

Limiting step, che determina la velocitàdella reazione

Quindi la Vmax si raggiunge quando tutto l’enzima è complessato in ESe la concentrazione di E libero diventa trascurabile.

Vo= K2 (S)






0

Il complesso ES si mantiene in uno statostazionario durante tutto il periodo di tempoin cui si possono misurare delle velocitàiniziali:[ES] rimane costante perchè lavelocità con cui il complesso ES si forma apartire da E+S è uguale alla somma dellevelocità con cui si scinde a dare E+P ed E+S.

STATO STAZIONARIO

L’approssimazione dello statostazionario G. E. Briggs and J. B. S.

Haldane (1925)

Allo stato stazionario levelocità di formazione erottura di ES sono uguali

L’ipotesi dello stato stazionario vale solo se:•Il sistema di reazione sia un sistema chiuso (reattore batch)•La concentrazione iniziale di substrato sia considerevolmentesuperiore alla concentrazione totale di enzima•si considera la velocià iniziale della reazione


Km

Vmax

E’ adatta alle osservazioni sperimentali??

A basse (S) allora Km >> (S) e quindi (S) Al denominatore trascurabile

A alte (S) allora (S) >> Km e quindi Km al denominatore trascurabile

Modo più pratico per descrivere lacinetica: Grafico degli inversi

• KM

• Kcat

• Kcat/KM

SIGNIFICATO DELLECOSTANTI CATALITICHE


Km

Vmax

La km è caratteristica di unenzima per un certo substrato

• Glucosio] plasma: circa 5mM• Glucosio + ATP Glucosio-6-P +ADP• Km glucosio per GK epatica=15mM• Km glucosio per HK cervello=0,01 mM

• Spesso la Km è similealle concentrazionicellulari fisiologichedei substrati (in rosa)

Costante catalitica (kcat)o Numero di turn-over

E’ rappresentata dalla k della reazione limitante

VMax = kcat [E0]• Massimo numero di molecole di

substrato convertite nella unità di tempoda una molecola (sito) di enzima

• È correlata alla velocità didecomposizione del complesso ES

Nel caso di reazioni complesse con molte tappecatalitiche, la costante catalitica è data dal contributodi tutte le costanti di velocità nei singoli step. Se unadi queste velocità è molto più lenta delle altre:

kcat sarà uguale alla K di quello step

• Ogni enzima ha valori di km e kcat che sonoottimali per le condizioni bilogiche in cui si trovaad operare.Dipendono quindi dal substrato, dalla suaconcentrazione e dalla chimica della reazioneda catalizzare.

Il confronto di km e kcat di enzimi diversi potrebbenon essere corretto

Rapporto kcat/Km(costante di specificità)

• Dà una idea della efficienza relativa con cuivengono trasformati substrati diversi(specificità)

• Tiene conto della velocità di catalisi (kcat) edell’affinità tra E e S (Km)

• Dà una idea della efficienza cataliticadell’enzima (enzimi “perfettamente” evolutihanno costanti cinetiche che siapprossimano alla diffusione)

Acetlicolinesterasi 9 x 10-5 1.4 x 104 1.6 x 108

Fumarasi 5 x 10-6 8 x 102 1.6 x 108

MOLTI ENZIMI CATALIZZANOREAZIONI A DUE O PIU’

SUBSTRATI

Meccanismo a ping-pong

GLI ENZIMI POSSONO ESSEREINIBITI

Inibizione Reversibile

Gli inibitori reversibilicompetitivi sono

molto simili al substrato(eccedono entrambi al sito

attivo dell’enzima)

substrato

inibitore

INIBIZIONE COMPETITIVA

Stessa VmaxAumento Km

INIBIZIONE INCOMPETITIVA

Calo VmaxCala Km

(ESI porta a un calo di ESe quindi altro ES deve formarsi)

INIBIZIONE MISTA

(sia Km che Vmax sono modificate)

INIBITORI IRREVERSIBILI

La Velocità di reazione èinfluenzata da numerose variabili:

– concentrazione disubstrato

– concentrazione dienzima

– Inibitori– Cofattori/coenzimi– attivatori– pH– temperatura

Effetti del pH sull’attivitàenzimatica

L’attività di molti enzimi varia con il pH nello stessomodo in cui semplici acidi e basi si ionizzano.

nel sito catalitico vi sono spessoresidui acidi e basici

Variazioni di pH modificano leinterazioni intra- ed inter-catena

Tutti gli amminoacidi liberi possiedono almeno due pK perché possiedonoalmeno il gruppo carbossilico (ACIDO) e il gruppo amminico (BASICO). Peresempio l’alanina che ha una catena laterale alifatica possiede solo questidue gruppi ionizzabili:

pK è il pH in cui la forma protonata ela deprotonata dell’amminoacido sitrovano alla stessa concentrazione:Henderson- Hasselbach: Per acido:AH A- + H +

pH = pKa + log A- / AH

Per base:BH + B + H +

pH = pKb + log B/ BH +

Dim

inui

sce

conc

entra

zion

e H

+

Enzima proteolitico digestivo che agisce nello stomaco ad un pH tra 1 e 2

Sperimentalmente, in vitro, si è rilevato che lavelocità di gran parte delle reazioni enzimatichein media raddoppia per ogni aumento di 10 °Cdi temperatura:

Temperatura ottimale:

• varia da un enzima all'altro;• dipende dal particolare sistema cellulare;

L’aumento della temperatura porta ad un aumento dell’energia cinetica del sistemaed ha un effetto importante sulla velocità di reazione

Quando le molecole collidono l’energia cinetica può essere convertita in energia chimica potenziale. Se questaforma di energia diventa grande abbastanza, può venire raggiunta la soglia dell’energia di attivazione di unareazione. Se tale reazione è esoergonica, può avvenire la trasformazione dei reagenti in prodotti.Così se la temperatura di un sistema aumenta, più molecole per unità di tempo possono raggiungere l’energia diattivazione, e la velocità di una reazione può aumentare.

Per convertire il substrato in prodotti, gli enzimi devono collidere e legare il substrato nel sito attivo. Aumentandola T aumenterà questo numero di collisioni. L’aumento della temperatura del sistema può anche rompere i legami deboli dell’enzima e denaturare così lasua struttura tridimensionale. QUINDI:

Il calore fino ad una certo punto aumenta l’attività enzimatica, poi, superata una certasoglia, può indurre la denaturazione dell’enzima e quindi la sua completa inattivazione.

EnzimiAndamento dell'attività enzimatica in funzione della temperatura.

(tratto AB), crescente, corrispondeall'aumento dell'attività dell'enzimafino a un massimo per effetto diuna contemporanea diminuzionedell'energia di attivazione dellareazione

(tratto BC), decrescente fino a un valore asintoticodella temperatura, è l'effetto combinatodell'aumento di attività enzimatica proporzionaleall'aumento di temperatura e della diminuzionebrusca di tale attività per sottrazione di enzimadenaturato

(tratto CD) asintoticaa un valore limite ditemperatura,corrisponde allatotale e irreversibileinattivazionedell'enzima perdenaturazione.

EFFETTO DELL TEMPERATURASULL’ATTIVITA’ ENZIMATICA

Gambero da ALASKA

Chimotripsina da maiale

Enzima di batterio che vivein acque calde

Struttura generale degli enzimiStruttura generale degli enzimi

APOENZIMA (Parte proteica)

OLOENZIMA

coenzima (vitamina)

ione metallicogruppo prostetico(legato covalentemente)

MECCANISMI DI AZIONE

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