Inibizione Enzimatica i

Inibizione enzimaticaSi definisce INIBITORE una qualunque sostanza che hal’effetto di ridurre la velocità di reazione di un enzima.

1. Nella biochimica classica: per studiare la struttura del sito attivo di un enzima, ilmeccanismo della reazione e la specificità di catalisi.

Lo studio di inibitori è utile:

Può derivare da:• Formazione di complesso E-I• Interazione S-I.

3. Per scopi industriali, la presenza di inibitori specifici va accuratamente controllataed evitata.

1. La maggior parte dei farmaci attualmente utilizzati sono inibitori altamente specificidi reazioni enzimatiche (molto spesso sono inibitori irreversibili).2 nella diagnostica e nella ricerca di laboratorio si utilizzano inibitori competitivi perla progettazione di cromatografie di affinità

Utilizzo degli inibitori:

Inibizione

Reversibile Irreversibile

• Competitiva• Non competitiva• Acompetitiva• Mista• Da prodotto

In tutti i casi:

variano uno o entrambi i parametri cinetici

S

S

S

SS

E

S

I

I

8 molecole di substrato S

2 molecole di inibitore I

S S

INIBIZIONE COMPETITIVA

La probabilità che il substrato S venga in contatto con il sito attivo dell’enzima è dell’80%

S

S

S

SS

E

S

I

I



S S


La probabilità che il substrato S venga in contatto con il sito attivo dell’enzima è dell’80%

La probabilità che l’inibitore I venga in contatto con il sito attivo dell’enzima è del 20%

S

S

E

S

I

I



S


La probabilità che il substrato S venga in contatto con il sito attivo dell’enzima è del 50%

I

I

S

S

E

S

I

I



S


La probabilità che il substrato S venga in contatto con il sito attivo dell’enzima è del 50%

I

I

La probabilità che l’inibitore I venga in contatto con il sito attivo dell’enzima è del 50%

Inibizione competitivak1

k2

k3

KM aumenta

Vmax rimane inalterata

Inibizione competitiva

v = VMAX [S]

KM + [S]

[I]KI

= 1 +

KM

Come calcolare KM, Vmax, KI??

KM aumenta

Vmax rimane inalterata


[I]KI

= 1 +

KM

KI

KMapp = KM = KM + [I]

I1, mMKm app, microM

0,5 162 30

10 111

Vmax 47,587

0

20

40

60

80

100

-2 0 2 4 6 8 10 12

I, mM

Km app, microM

KM- KI

[I]

KMapp


Doppi reciproci


Conclusione:

• è facile calcolare Vmax

• KM è calcolabile solo da una curva in assenza di inibitore

• da curve con inibitore si ottiene una KMapp per ogni

concentrazione di inibitore, e il valore della Vmax

L’effetto dei due substrati è quello di rallentare la reazione globale, ma fadiminuire in maniera quasi esclusiva la velocità di catalisi del substrato menoabbondante

Due substrati in competizione

Questo esempio non è scelto a caso. Infatti, l’effetto di inibizionedovuto alla competizione tra due substrati per uno stesso enzima vieneutilizzato in medicina per curare soggetti che presentino i sintomi di unavvelenamento da metanolo.

CH3OH +

CH3CH2OH +

ADHHC-C

O

H

Formaldeide, tossica

CH3-C-C O

HEtanolo

Terapia dell’avvelenamento: infusione intravenosa di etanolo, per un tempo sufficiente ad eliminare il metanolo attraverso le urine senza danni (circa 3 ore). Poiché il metanolo è tossico anche a basse concentrazioni, è importante ripetere più volte l’inieziezione di etanolo, ed è fondamentale il tempestivo inizio della terapia.

Inibizione da prodotto

k1

k2

k3E + S ES E + P

k4

All’aumentare di [P], la reazione rallenta, fino al raggiungimento all’equilibrio

Inibizione da prodottoP

EPP

Inibizione acompetitiva

KM diminuisce

Vmax diminuisce

Conclusione:

• non si ottiene nessun parametro dai grafici lineari primari

• da curve con inibitore si ottiene una KMapp e una VMax

app

per ogni concentrazione di inibitore

Inibizione acompetitiva

Inibizione non competitiva

KM non varia

Vmax diminuisce

KS

KS

Riepilogo

Competitiva

Acompetitiva

Non competitiva

Irreversibile

KMapp = KM

Nessun inibitore KM VMax

VMax

KMapp =

KM

VM

app =VM

KM VMapp =

VM

KM VMapp =

VM

Inibizione irreversibile

Sono anche detti “inibitori suicidi”

• La VMax diminuisce (diminuisce la quantità di enzima attivo)

• La KM resta invariata (l’enzima che resta attivo non ha nessuna inibizione)

A differenza dell’inibizione competitiva questo equilibrio non è reversibile

Come per l’inibizione non competitiva!!!

Se [I] < Etot

Inibizione irreversibile o non competitiva??

• La VMax diminuisce

• La KM resta invariata

In entrambi i casi:

non U/ml

Fare 3-4 saggi con diverse quantità di enzima e substrato saturante

Nessuna inibizione Inibizione

reversibile

Inibizione irreversibile

Inibizione Enzimatica i

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