Biotecnologie vegetali per l’industria e l’ambiente

Biochimica classica - atto I

Il Cavallo RossoE. Corti (Ed. ARES)

Come manipolare il metabolismo?

È necessaria la comprensione del sistema metabolico e di come venga modulato il flusso

Metà corso dedicato alla comprensione dei sistemi multienzimatici

Metà corso a discutere degli interventi di ingegneria metabolica

Il metabolismo: questo sconosciuto

Un centinaio di anni di studio degli enzimi e dei metaboliti ci ha permesso di costruire accurate mappe metaboliche:

E. Buchner: cell-free fermentation

"Alcoholic Fermentation Without Yeast Cells". (1897) Ber. Dt. Chem. Ges. 30:

117–124.

http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1907/buchner-lecture.pdf

Teoria generale capace di predire i flussi?

vie metaboliche enzimologia

Flux is phenotype! (H. Kacser)

E’ possibile descrivere il metabolismo a partire dalle proprietà (studiate di solito in vitro) dei suoi componenti?

SK

SVv

M

m

Cinetica di MM irreversibile

E + S = ES E + P

Derivazione della formula reperibile su tutti i testi (decenti) di biochimica. Formula e curva sono la stessa cosa detta in due modi diversi!!!

Breve ripasso di enzimologia

Colmate le lacune con attenzione (ad es. Voet & Voet, Biochemistry)

Curva v/S

Significato di KM e Vm; unità di misura

Molte rappresentazioni della cinetica sono sballate

http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/asympt.htm

Quando v raggiunge Vmax?

A [S] infinito, cioè mai!

Linearizzazionemm

M

VV

K

Sv

111

y = 0

x = 0

Esistono tipi diversi di linearizzazione (vedi Voet e Voet o Fell)

Inibizione competitiva

Il valore di Km viene aumentato: KMapp = KM(1+I/Ki)= KMα

L’inibizione si annulla aumentando la concentrazione del substrato

SKI

K

SVv

iM

m

)1(

E + S = ES E + P

EI + S = EIS no reaction

+

I

es. Succinato deidrogenasi: fumarato (S) e malonato (I)

Che faccià avrà la linearizzazione in presenza di inibitore?

Ki

COO

CH2

CH2

COO

succinate dehydrogenaseOOC H

H COO

SuccinateFumarate

COO

CH2succinate dehydrogenase

Malonate

COONo reaction

Inibizione incompetitiva

Il valore di Vm viene diminuito: Vmapp= Vm/(1+I/Ki)= Vm/α’

L’inibizione, inefficace a basse [S], non si annulla ad alte [S]

E + S = ES E + P

EIS no reaction

+

I

Che faccià avrà la linearizzazione in presenza di inibitore?

es. EPSP sintasi (con glifosate)

Ki

'

SK

SVv

M

m

Reazione della EPSP sintasi e sua inibizione da parte del glifosate

OH

OH

COO-

-2O

3PO

CH2

OH

O

COO-

COO--2

O3PO

-OOC NH PO

3

2-

Shikimato-3-fosfato

Fosfoenolpiruvato (PEP)

Glifosate

3-enolpiruvil-3-shikimato -fostato (EPSP)

EPSP sintasi

CH2

O-2 O3 P COO-

Nonostante assomigli molto a parte dello shikimato, il glifosate è un inibitore competitivo del PEP.

La reazione è sequenziale, con lo shikimato che entra per primo, per cui il glifosate risulta essere un inibitore incompetitivo di questo primo substrato.

Questo causa l’accumulo di Shikimato e la riduzione in Arogenato (che è un inibitore della DHAP sintasi che quindi esacerba l’accumulo di Shikimato) (vedi note)

http://plantandsoil.unl.edu/Image/siteImages/ShikimatePathway.gif

Inibizione mista

Sia Vm che Km cambiano: Vmapp = Vm/α′ e KM′ = α KM/α′

L’inibizione si sente sia a bassa che ad alta concentrazione di S

E + S = ES E + P

Che faccia avrà la linearizzazione in presenza di inibitore?

EIS no reactionEI

+

I

+

I

Ki K’i

'

SK

SVv

M

m

Le inibizioni dal punto di vista grafico

Equazione MM reversibile

Per una dimostrazione elegante:http://www.bioinformaticsservices.com/bis/resources/cybertext/chapter6.html

PS

PrSf

KPKS

KPVKSVv

//1

)/()/(

Due conseguenze importanti:

La v della reazione reversibile sarà minore di quella irreversibile per due motivi:

La presenza di prodotto rende più piccolo il numeratore

La presenza di prodotto rende più grande il denominatore

0)/()/( PrSf KPVKSV

La relazione di Haldane

All’equilibrio v = 0 per cui il numeratore sarà = 0

)/()/( PrSf KPVKSV

eq

eq

Sr

Pf

S

P

KV

KV

= Keq

Le costanti cinetiche non sono indipendenti!

Una formulazione alternativa dell’equazione si ottiene sfruttando la relazione di Haldane (sostituisco Vr)

Ricordatevi che il valore della Keq è indipendente dalla presenza dell’enzima

Seq

Pfr KK

KVV

PS

eqS

f

KPKS

KPSK

V

v//1

)/(

Quando la Keq >>1

L’effetto di P si fa sentire solo sul denominatore

(si parla di inibizione da prodotto)

(cioè una reazione molto spostata verso i prodotti)

PS

eqS

f

KPKS

KPSK

V

v//1

)/(

)

Che altro non è se non l’equazione per la reazione irreveversibile

Inoltre se [P]/KP è bassa ( 0 o comunque <<1)

PS

eqS

f

KPKS

KPSK

V

v//1

)/(

Importantissimo

L’equazione di MM irreversibile non descrive il comportamento in vivo perché la maggior parte degli enzimi catalizzano reazioni reversibili.

Quella reversibile è cruciale per descrivere i sistemi reali

Inoltre la maggior parte delle reazioni enzimatiche hanno più di un substrato o di un prodotto per cui si richiedono equazioni più complesse.

Enzimi a più substrati/prodotti

A + B C + D

Classificati secondo il meccanismo:

*Random order

* Compulsory order

* Ping Pong

Sequenziali

BABKAKKK

BAVv

ABBiA

m

Equaz. generale (irrev.)

Enzimi allosterici:

Molti enzimi non hanno curve iperboliche, ma sigmoidi, per cui sono stati introdotte teorie per spiegare questi comportamente (Hill, MWC e Koshland)

v =Vm*(x*(1+x)n-1+L*c*x*(1+c*x)n-1)/((1+x)n + L*(1+c*x)n) [MWC model]

Andate a rivederli sul testo di biochimica !

http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/transkinetics/ATCasekin.jpg

atto II(ovverosia la termodinamica)

Dopo le nozioni essenziali di enzimologia, ripassiamo alcuni concetti di termodinamica che

sono rilevanti per le vie metaboliche

Si raggiunge sempre uno stato stazionario (ss)?

La presenza di un flusso in una via metabolica cosa implica dal punto di vista termodinamico?

Un G ≠ 0 (<0)

G = G°' + RT lnQ Q = quoziente di reaz.

All’eq. G= 0 e G°' = –RT lnKeq

Che conseguenze avrebbe non raggiungere uno ss…

G°' = –RT lnKeq = –2.3RT Log10(Keq)

G°' è la variazione di energia libera in condizioni standard

Da Lehninger

Ordine di grandezza

ATP + H2O ADP + Pi Go' = -31 kJoules/molPi + glucose glucose-6-P + H2O Go' = +14 kJoules/mol

Values of Go and Keq for common reactions at 25oC

SO3(g)       2 SO2(g) + O2(g)     141.7   1.4 x 10-25

H2O(l)       H+(aq) + OH-(aq)     79.9   1.0 x 10-14

AgCl(s) + H2O       Ag+(aq) + Cl-(aq)     55.6   1.8 x 10-10

HOAc(aq) + H2O       H+(aq) + OAc-(aq)     27.1   1.8 x 10-5

N2(g) + 3 H2(g)       2 NH3(g)     -32.9   5.8 x 105

HCl(aq) + H2O       H+(aq) + Cl-(aq)     -34.2   1 x 106

Cu2+(aq) + 4 NH3(aq)       Cu(NH3)42+(aq)     -76.0   2.1 x 1013

Zn(s) + Cu2+(aq)       Zn2+(aq) + Cu(s)     -211.8   1.4 x 1037

Reaction Go(KJ/mol) Keq

R = 8.314472[15] J · K-1 · mol-1 Go (kJ/mol)

Quoziente di reazione e Keq

G = G°' + RT lnQ = –RT lnKeq+ RT lnQ =

= RT ln(Q/Keq) = RT ln ρ

(con ρ Disequilibrium ratio)

Che valori assume ρ? Ovviamente tra 0 e 1 per G <0

Quanto più ρ è vicino a 0 tanto più G < 0 (reaz. spontanea)

ρ (o G, che concettualmente è la stessa cosa) è considerato da molti un indice potenziale di regolazione: *se ρ è molto piccolo (0) si ritiene che l’enzima sia un potenziale

sito di regolazione (se ρ 1 c’è poca possibilità di regolazione)

eqK

Qρ

http://users.humboldt.edu/rpaselk/C431.F08/C431Notes/C431nLec31.htm

Il loro rapporto vale (=Q), da cui posso calcolarmi G

ΔG°' e ΔG in vivo nella glicolisi

Perché ρ è considerato un indice di potenziale regolazione?

I metaboliti devono essere a concentrazioni nel range μM- mM

A) Non possono essere a concentrazioni molto alte (es. 1M)

* perché ci sarebbero effetti osmotici pesanti

* perché le variazioni nel metabolismo sarebbero lente(ci sarebbe molto intermedio da smaltire)

* perché si investirebbe molto in intermedi (e non prodotti)

B) Non possono essere a concentrazioni molto basse (es. nM)

* perché gli enzimi avrebbero Km basse e quindi una bassa efficacia catalitica: Kcat / Km vale al max 108-109

* perché gli intermedi verrebbero esauriti velocemente (non ci sarebbero riserve efficaci di metaboliti)

Kcat = Vmax/Etot = turnover number

n. di reazioni catalizzate da ogni sito attivo ogni secondo; per un enzima MM vale K2.

Non può essere maggiore della frequenza con cui substrato ed enzima si incontrano. Se ogni incontro è produttivo, si avrà la perfezione catalitica

kcat is called the turnover number

kcat = moli di substrate trasformato / mole di enzima/secondo

http://www.aw-bc.com/mathews/ch11/c11kkkk.htm

SK

SVv

m

M

Quando [S] << KM (soluzioni diluite) ricaviamo

M

T

M

T

K

SEK

SK

SEK

22

ammettendo E= Etot := (k2/KM)[E][S] ~

(kcat/KM)[E][S]

Pendenza della retta

Rate constant per reaz. Bimolecolare

Non può essere maggiore della

velocità d’incontro

(kcat/KM) vale al massimo 108-109 cioè il valore massimo compatibile con la diffusione

Diffusion theory predicts that kcat/KM will attain a value of about 108-109 (mol/L)-1s-1. Carbonic anhydrase, Catalase, Fumarase and Triose phosphate isomerase actually approach this limit.

TIM accelerates isomerization by a factor of 1010 compared with the rate obtained with a simple base catalyst such as acetate ion. Indeed, the kcat/KM ratio for isomerization of glyceraldehyde 3-phosphate is 2 × 108 M-1 s-1.

Da Lehninger

The kcat and activation energy of Rubisco from a variety of C3 and C4 plants

Sage et al.

Se questi 2 ragionamenti sono veri, ne consegue che :

* quando G° ' <<0 la reazione deve rimanere lontana dell’eq.

* quando G° ' 0 (Keq 1) la reazione deve rimanere vicina all’eq.

Cosa significa (approssimativamente)? G <<0 G 0

Cosa succederebbe infatti se le reazioni con G° ' <<0 andassero all’equilibrio?

E cosa succederebbe se le reazioni con G° ' 0 fossero lontane dall’equilibrio…

[P] >> [S]

Con due reazioni di questo tipo in fila (come ad es. nella glicolisi GG6PF6PF1,6BP*), allora:

[S] << [P1] [P2] << [P3] e più precisamente:

([F1,6BP][ADP]2 / [G][ATP]2) = 106

[P] << [S]

Riassumendo:

Le concentrazioni dei metaboliti possono rimanere dentro ambiti sensati (μM-mM) se le reazioni con

* G° ' <<0 rimangono lontane dall’equilibrio (G <<0, vale a

dire ρ 0). Tali reazioni quindi devono essere ben regolate!

* G° ' 0 rimangono vicine all’equilibrio (G 0) Queste reazioni devono essere catalizzate da enzimi in eccesso (altrimenti rallentando rimarrebbero lontane dall’equilibrio)

Da Lehninger

TPI aumenta la velocità della

reazione 109 volte!!

ReferenzePer la cinetica enzimatica vedere

* Testo di biochimica (ad es. Voet and Voet, Biochemistry)

* Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 3

Per la parte di cinetica chimica vedere:

* Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 1.4.2 e 1.4.3

Effect of reversible inhibitors on the reaction rate: � no inhib. a)� mixed inhib. ([I] = Ki = 0.5 Ki'); lower Vmax

app (= 0.67 Vmax), higher Kmapp (= 2 Km). b)� competitive inhib.

([I] = Ki); Vmaxapp unchanged (= Vmax), higher Km

app (= 2 Km). c)� uncompetitive inhib. ([I]

= Ki'); lower Vmaxapp (= 0.5 Vmax) and Km

app (= 0.5 Km). d)� noncompetitive inhib. ([I] = Ki

= Ki'); lower Vmaxapp (= 0.5 Vmax), unchanged Km

app (= Km).

A special case of uncompetitive inhibition is substrate inhibition which occurs at high substrate concentrations in about 20% of all known enzymes (e.g. invertase is inhibited by sucrose). It is primarily caused by more than one substrate molecule binding to an active site meant for just one, often by different parts of the substrate molecules binding to different subsites within the substrate binding site. If the resultant complex is inactive this type of inhibition causes a reduction in the rate of reaction, at high substrate concentrations. It may be modelled by the following scheme:

http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/inhibition.html

Effect of substrate inhibition the reaction rate. A comparison is made between the inhibition caused by increasing KS relative to Km. � no inhibition, KS/Km >> 100; �

KS/Km = 100; � KS/Km = 10; � KS/Km = 1. By the nature of the binding causing this

inhibition, it is unlikely that KS/Km < 1.

Competitiva

Incompetitiva

Mista

Quando α = α‘ si parla di in. non-competitiva (la Km non cambia)

Effetto degli inibitori sui parametri cinetici