BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE2008/09

LEZIONE 1

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO

Adriana Maggi

Adriana Maggi

Via Balzaretti 9

adriana.maggi@unimi.it

Telefono 02-50318375

ORARIO RICEVIMENTO STUDENTI: venerdì

mattina (9:00-12:00)

…IL MEDICO ADOPRERA’ BENE

LE MEDICINE QUANDO LUI CONOSCERA’

CHE COSA E’ OMO,

CHE COSA E’ VITA E COMPLESSIONE,

CHE COSA E’ SANITA’…

LA FARMACOLOGIA STUDIA I FARMACI ELE INTERAZIONI CHE HANNO LUOGO TRA QUESTI

E GLI ESSERI VIVENTI

PER FARMACO SI INTENDE OGNI SOSTANZA DI PROVOCARE IN UN ORGANISMO MODIFICAZIONI

FUNZIONALI MEDIANTE UNA AZIONE CHIMICA O FISICA

IL FARMACOLOGO DEVE POSSEDERE CONOSCENZE:

SUI PRINCIPI ATTIVI

SULLA PATO-FISIOLOGIA GLI ORGANISMI SUI QUALI I FARMACI AGISCONO

Biotecnologie Farmacologiche

proteine umane proteine modificate anticorpi umanizzati acidi nucleici cellule

applicazione delle conoscenze di biologia/biologia molecolare nel disegno di nuovi farmaci

Farmaci biotecnologici

La rilevanza dei processi di regolazione della espressione genica

nel disegno di nuovi farmaci

MECCANISMI DI REGOLAZIONE DELLA ESPRESSIONE GENICA

ESPRESSIONE GENICA IN PROCARIOTE

Nei procarioti lo stesso enzima (RNAP) catalizza la sintesi di tutti e tre gli RNAa RNA polimerasi di procariote è un enzima di relativamente grandi dimensioni ed è formata da 5 subunità (~400 kDa):     α2:le due subunità αalfa assemblano l’enzima e riconoscono i fattori di regolazione.

     β: catalizza la sintesi di RNA      β': lega il DNA in modo non specifico.      ω: funzione non ben descrittaPer legare sequenze specifiche di DNA nel promotore dei geni bersaglio, l’enzima necessita del fattore σ . La struttura della RNAP ha una cavità di 55 Å di lunghezza e 25 Å di diametro dove si adatta con precisione il DNA a doppio filamento (20 Å ): la lunghezza della cavità è sufficiente per riconoscere un numero di circa 16 nucleotidi.

RNA POLYMERASE IN EUKARIOTE

     RNA polimerasi I per la sintesi di pre-rRNA 45S, che matura a 28 S, 18S and 5,8S rRNA

     RNA polymerase II per la sintesi dei precursori di RNAm e la gran parte degli snRNA. Richiede i fattori di trascrizione per legare con specificità il DNA bersaglio      RNA polymerase III per lasintesi dei tRNA, rRNA 5S e altri piccoli RNA che

si trovano nel nucleo e citoplasma.

     Cloroplasti e mitocodri hanno altri tipo di RNA polimerasi.

La trascrizione in eucariota

Le dimensioni dei nucleosomi sono di circa 260 kDLa polimerasi di eucariota è un enzima con diverse subunità che raggiunge le dimensioni di circa 500 kD

La polimerasi determina una alterazione della struttura nucleosomi che non è permanente

Il promotore di geni di eucariota

Caratterizzato da alta variabilità

Promotori riconosciuti dalla Polimerasi II in genere si trovano a monte del gene, hanno struttura modulare e si contraddistinguono per variabilità e si estendono percirca 200 pb (ad eccezione degli enhancers)

La polimerasi II riconosce i siti di “attacco” tramite interazioni con altri “fattori” proteici

- fattori generali di trascrizione (ubiquitari)- fattori di trascrizione inducibili

Roger Kornberg Nobel Price for chemistry 2006

In the figure: the transcriptional process depicted in 2001. Pol II in white;DNA helix in blue and the growing RNA strand in red

L’inizio della trascrizione in eucariota richiede un considerevole numero di proteine che riconoscono elementi in cis: si intende per promotore tutta la regione che contiene questi moduli di riconoscimento dei attori di trascrizione indispensabili per consentire la trascrizione efficiente e propriamente controllata in termini di inizio

Generalmente la regolazione in eucariote è in positivo, esistono tuttavia repressori anche in eucariote

Generalmente una unità trascrizionale di eucariota è costituita da un singolo gene

Le polimerasi di eucariota sono enzimi composti da diverse subunità (8-14) e raggiungono le dimensioni di circa 500kD. La Pol II si caratterizza per un dominio carbossi-terminale con sequenze amminoacidiche ripetitive ricche di treonine e serine

Differenze significative tra promotore procariota e eucariota

TBP + 12 TAFs (TBP ass. factors)

TFIID recognizes TATA (Inr)

TFIIA; TFIIB; TFIIF

TFIIE; TFIIH

TFIIF pol II bindingTFII H helicase and kinase

commitment

Pol II entry

Promoter clearence

Bob RoederLasker Award 2003

TBP lega il solco minore del DNA

Poiché nei nucleosomi le sequenze ATnel solco minore si affacciano all’interno della molecola, la presenzadi nucleosomi è incompatibile conil legame di questo complessoproteico

COMPLESSITA’ DEI PROMOTORI DI EUCARIOTA

COMPLESSITA’ DEI PROMOTORI DI EUCARIOTA

Si tratta di una sequenza di DNA in cui sono presenti diversi moduli:

TATA box a circa -30 pb dal sito di inizio della trascrizone importantePer il corretto inizio della trascrizione

CAT box a circa –80 pb che determina l’efficienza del promotore(CAAT). Lega: proteine della famiglia CTF, CP1 eCP2 , C/EBP, ACF.

GC box a circa –90 pb (GGGcGG) anche presente in multiple copieE’ riconosciuto dal fattore SP1

Ottamero traget di proteine Oct

Enhancers es. SV40 due sequenze in tandem di 72 pb

Moduli specifici per fattori di trascrizione inducibili

UN ESEMPIO DI PROMOTORE DI EUCARIOTA COMPLESSO

Enhancer: - sequenza di DNA dove sono presenti diversi motivi strutturali riconosciuti da fattori che attivano la trascrizione che stimolano la trascrizione- funzionano anche a distanza dal gene trascritto- funzionano in ambedue gli orientamenti

Il meccanismo con cui agiscono rimane non ben chiarito:

Ipotesi iniziali cambiano l’intera struttura del templatopongono il promotore in una posizione conveniente (es. matrice nuclearefacilitano l’entrata dellla polimerasi

Aumentano la disponibilità di fattori di trascrizione nellavicinanza del promotore di cui influenzano la trascrizione

Meccanismi di metilazione del DNA e eredità epigenetica

Meccanismi di metilazione del DNA e eredità epigenetica

Circa il 2-7% delle citosine nel DNA animale subisce metilazione ad opera di

specifici enzimi che agiscono su sequenze palindromi:

5’ mCpG 3’3’ GpCm 5’

ESPRESSIONE GENICA E’ GENERALMENTE

ASSOCIATA CON DEMETILAZIONE

I GENI “HOUSEKEEPING” SONO ESPRESSI INMODO COSTITUTIVO E CONTENGONONEL LORO PROMOTORE MOLTE “ISOLE” CpGNON METILATE

CpG islands are genomic regions that contain a high frequency of CG nucleotides. In mammalian genomes, CpG islands are typically 300-3,000 base pairs in length. They are in and near approximately 40% of promoters of mammalian genes (about 70% in human promoters).

The "p" in CpG notation refers to the phosphodiester bond between the cytosine and the guanine.

The usual formal definition of a CpG island is a region with at least 200 bp and with a GC percentage that is greater than 50% and with an observed/expected CpG ratio that is greater than 60%.

Another recent study revised the rules of CpG island prediction in order to exclude other GC-rich genomic sequences such as Alu repeats. Based on an extensive search on the complete sequences of human chromosomes 21 and 22, DNA regions >500 bp with a GC content >55% and observed CpG/expected CpG of 0.65 were more likely to be the true CpG islands associated with the 5' regions of genes.

PROCESSI DI ACETILAZIONE E DEACETILAZIONE SONO IMPORTANTINELLA REGOLAZIONE DELLA ATTIVITA’ DELLA CROMATINA

ESPRESSIONE GENICA E’ GENERALMENTE

ASSOCIATA CON ACETILAZIONE

Acetylation of the lysine residues at the N terminus of histone proteins removes positive charges, thereby reducing the affinity between histones and DNA.  This makes RNA polymerase and transcription factors easier to access the promoter region.  Therefore, in most cases, histone acetylation enhances transcription while histone deacetylation represses trancription                                                            .

Acetylation and deacetylation of the lysine residue.

Histone acetylation is catalyzed by histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylation is catalyzed by histone deacetylases (denoted by HDs or HDACs).  Several different forms of HATs and HDs have been identified.  Among them, CBP/p300 is probably the most important, since it can interact with numerous transcription regulators

Acetilasi e deacetilasi sono associate a co-regolatori della espressione genica (attivatori e repressori, rispettivamente

(es. - p300/CBP che interagisce con diversi fattori di trascrizione Myo D e AP1 è una acetilasi che acetila N-terminus di H4: questo enzima è bersaglio di proteine virali - PCAF acetila H3, ecc

- Sin3, fa da proteina ponte tra SMART e HDAC per inibire recettori intracellulari, quali RAR)

I PROCESSI DI METILAZIONE GIOCANO UN RUOLONELLA PATOGENESI UMANA