Biologia Molecolare CDLM in CTF 2010-2011 – La Replicazione del DNA

  Prospettiva Storica

  La replicazione semidiscontinua

  Differenze tra procarioti ed eucarioti

E’ fondamentale che ad ogni divisione cellulare il DNA venga COPIATO in modo che ogni cellula figlia abbia un corredo genetico identico a quello della cellula progenitrice.

La conseguenza principale della scoperta della struttura del DNA ad opera di Watson e Crick è stata la comprensione dei maccanismi di replicazione del DNA, che può essere definita SEMICONSERVATIVA e SEMIDISCONTINUA

Modello conservativo Modello semi-conservativo Modello distributivo

Una delle cellule figlie eredita la doppia elica parentale, l’altra quella appena sintetizzata

Entrambe le le cellule figlie ereditano un filamento parentale “vecchio” ed uno neosintetizzato

Entrambe le le cellule figlie ereditano un parti di filamento parentale “vecchio” e parti neosintetizzati

J. Cairns 1963 Autoradiografia usando timina marcata con trizio

  Prospettiva Storica

  La replicazione semidiscontinua

  Differenze tra procarioti ed eucarioti

  Il filamento stampo stabilisce quanle dei 4 possibili dNTP viene aggiunto

  La catalisi avviene al gruppo 3’ libero del filamento nascente

  Processo irreversibile per la idrolisi del pirofosfato

La  replicazione  inizia  in  corrispondenza  di  una  specifica  sequenza  chiamata  origine  di  replicazione.  Alcune  proteine  si  legano  al  DNA  in  corrispondenza  dell’origine  e  cominciano  a  svolgerlo.  A  questo  punto  delle  proteine  iniziatrici  possono  accedere  ad  ognuno  dei  filamen<  per  iniziare  la  sintesi  del  nuovo  DNA.  

• La  proteina  deputata  alla  sintesi  del  DNA  complementare  ad  uno  stampo  è  la  DNA  POLIMERASI.  Questo  enzima  catalizza  l’aggiunta  di  nuovi  nucleo<di  ad  una  molecola  di  DNA  quindi  non  NON  è  in  grado  di  iniziare  dal  nulla  la  sintesi  di  una  nuova  molecola.  

• Prima  che  la  DNA  polimerasi  possa  iniziare  la  sintesi  un  nuovo  filamento  deve  intervenire  l’enima  PRIMASI,  un  enzima  che  sinte<zza  un  breve  segmento  di  RNA  sullo  stampo  del  DNA.  Su  questo  “innesco”  (in  inglese  primer)  la  DNA  polimerasi  può  aggiungere  nuovi  nucleo<di  e  con<nuora  la  sintesi.  

• Poiche  i  primi  nucleo<di,  sinte<zza<  dalla  primasi,  sono  ribonucleo<di  (RNA)  vengono  successivamente  rimossi  e  sos<tui<  con  desossiribonucleo<di  (DNA).  

I  procario<    possiedono  cinque  <pi  di  DNA  Polimerasi:  

 1)  DNA  Polimerasi  I:  implicata  nella  riparazione  del  DNA  e  nella  rimozione  degli  inneschi  dei  frammen<  di  Okazaki.  2)DNA  Polimerasi  II:  indoPa  da  danni  al  DNA  per  riparazione  del  danno  indoPo.  3)DNA  polimerasi  III:  l'enzima  principale  per  la  replicazione,  aRva  sia  nella  sintesi  del  filamento  leading,  sia  in  quella  dei  frammen<  di  Okazaki.  4)DNA  Polimerasi  IV-­‐V:  anch'esse  coinvolte  nella  riparazione  incline  all'errore  

Anche  negli  eucario<  ci  sono  5  DNA  polimerasi.  1)DNA  Polimerasi  α:  è  una  primasi  (enzima  che  sinte<zza  i  primer  di  RNA)  e  procede  inoltre  all'allungamento  dei  primer  con  alcune  cen<naia  di  deossiribonucleo<di.  2)DNA  Polimerasi  β:  coinvolta  nella  riparazione  del  DNA  3)DNA  Polimerasi  γ:  replica  il  DNA  mitocondriale  4)DNA  Polimerasi  δ:  l'enzima  principale  della  replicazione  eucario<ca.  Sinte<zza  sia  il  filamento  leading,  sia  il  filamento  lagging.  Riempie  inoltre  le  interruzioni  tra  i  frammen<  di  Okazaki.  5)DNA  Polimerasi  ε:  stessa  funzione  della  Polimerasi  δ.  

TuPe  le  DNA  polimerasi  conosciute  sinte<zzano  il  nuovo  filamento  in  direzione  5'-­‐  3'aggiungendo  deossiribonucleo<di  (dNTP)  al  gruppo  3'-­‐OH  del  [deossiribosio]  del  nucleo<de  precedente.  Su  un  filamento  la  replicazione  può  procedere  nello  stesso  verso  in  cui  si  sposta  la  DNA  polimerasi,  ed  il  processo  è  con<nuo.  Nell’altro  filamento  questo  non  è  possibile  e  deve  avvenire  in  modo  discon<nuo.  

Nel  filamento  LAGGING  si  generano  dei  frammen<  di  DNA  (frammen<  di  Okazaki)  che  vengono  succesivamente  “incolla<”  tra  loro  per  ricostruire  un  filamento  con<nuo.  

La  rimozione  degli  inneschi  è  un  processo  sequenziale  -­‐ Rimozione  del’innesco  di  RNA  (RNAsi  H)  -­‐ Rimozione  di  alcuni  nucleo<di  alle  estremità  (5’esonucleasi)  -­‐ Sintesi  del  frammento  mancante  (DNA  polimerasi)  -­‐ Saldatura  del  taglio  (ligasi)