Basse Dosi Di Cancerogeni

Gli indicatori biologici nello studio delle basse dosi dei cancerogeni

Antonio Mutti

Torino, 11 dicembre 2006: CONVEGNO NAZIONALEQuestioni aperte in tema di cancerogenesi ambientale: quali le possibili risposte.

Quanto devono essere basse le basse dosi per essere considerate basse?

Effetti delle basse dosi Cosa significa “BASSA DOSE”?

Mitridatismo (adattamento), Curve dose/risposta ad U (ormesi)

Importanza della via di assorbimento per gli elementi essenziali

Gli effetti di dosi elevate possono non avere alcuna relazione con ciò che si verifica a livelli parafisiologici Dosi diverse possono causare risposte differenti Curve dose/risposta non monotone possono riflettere

meccanismi multipli

“Think Lead“Think Lead“

Sampling

CrU

,g

/g c

reat

inin

e

1st 2nd 3rd 4th 5th 6th 7th 8th 9th0

5

10

15

20

25

30Geometric Mean + GSD

Biological Monitoring Based on Urinary Chromium in Chromeplating Plants

Malattia

Effettiirreversibili

Effetti critici

Effetti subcritici

Adattamento (?)VR

LEO

Dose, U.A.

Effetti

L’U.R. per il benzene è estrapolata su sei ordini di grandezza da 7 casi di leucemia osservati (coorte Plioform)

01

234

56

78

0.00

006

0.00

060.

006

0.06 0.

6 6 60 600

6000

?

Esposizione cumulativa a benzene, mg/m3 x anni

N.

Cas

i o

sser

vati Unità di

rischio

Stime dell’unità di rischio per il benzene (prima di 7 tabelle, con 8 stime su 21)

Unit risk estimate (ppm) Data set 95% lower

bound MLE 95% upper

bound 1. Rinsky (follow-up from 1950) 1.65•10-3 5.10•10-3 1.08•10-3 2. Rinsky (follow-up from 1940) 1.53•10-3 5.10•10-3 1.13•10-3 3. Rinsky (revised exposures) 1.78•10-3 6.43•10-3 1.44•10-3 4. Rinsky and Ott 7.78•10-4 2.89•10-3 6.87•10-2 5. Same as 4. (2 questionable cases added) 4.45•10-4 2.04•10-3 5.10•10-3 6. Wong SMR=50 assumed for unexposed 8.76•10-5 1.04•10-2 2.42•10-2 7. Rinsky, Ott and Wong 2.67•10-3 7.32•10-3 1.60•10-2 8. Same as 7. (SMR=100 assumed for unexposed) 1.56•10-3 3.55•10-3 6.43•10-3

Fonte: EPA (US)

Concentrations of airborne benzene associated with an excess lifetime risk of 1/10.000, 1/100.000 and 1/1.000.000 are, respectively, 17, 1.7 and 0.17 µg/m3

È il rapporto LOAEL/esposizione umana (LOAEL ricavato da studi nell’animale);

Si basa sull’interpolazione di dati sperimentali;Non richiede estrapolazioni tra specie né tra dosi; Non richiede scelta tra modelli;Evita l’uso di fattori di incertezza.

L’approccio ora prevalente (FDA, EFSA, EPA, etc.) è il “Margin of Exposure”

(MOE)

Interpretazione del MOE Non è una “linea netta”, intesa come indice

generale di rischio;

Valori elevati (> 1000) indicano una scarsa probabilità di effetti nocivi nell’uomo;

Valori vicino a 1 espongono a livelli a cui sono stati osservati effetti nocivi nell’animale;

Per valori tra 10 e 100, la gestione del rischio dipende da vari fattori (natura dell’effetto, numero e suscettibilità della popolazione esposta, possibilità di alternative, etc.).

Analisi Rischi/BeneficiAnalisi caso per caso:

Possibilità di esposizione a livelli associati con effetti tossici nell’animale;

Benefici associati con l’uso del prodotto che causa l’esposizione

Potenziali alternative e loro rapporto rischi/benefici

Esempio del MeHg e dell’apporto di

acidi grassi poli-insaturi 3 nel pesce

Rischio Cumulativo Esposizioni Multiple

Effetti combinati di miscele di compostiMeccanismi d’azione simili o diversi

Esposizioni concomitanti o sequenzialiL’ordine e la durata possono influenzare

eventuali interazioni Vie Multiple

Effetti diversi secondo la via di assorbimento (es. Mn per via gastroenterica o respiratoria)

Effetti combinati

EC(d1+d2)=Ed1 + Ed2 + Ed1• Ed2

Per Ed1• Ed2 > 0 sinergismo Per Ed1• Ed2 < 0 antagonismo (competitivo)

Per Ed1o Ed2 = 0 nessuna interazione Se entrambe le dosi sono subliminali, lo

svolgimento più frequente della formula è: EC(d1+d2)=0 + 0 + 0

Quali indicatori biologici usare alle basse dosi?

Indicatori validi (misure non valide sono comunque da evitare);

Indicatori facilmente interpretabili; Indicatori con il miglior rapporto

costi/qualità (proporzionati al quesito).

indicatore più sensibile (100 g/m3)

Interferenza acido sorbico

> 10.000 g/m3

aspecifico

Analisi difficile: instabile e aspecifico

Instabile e aspecifico, forte

influenza del polimorfismo

NQO1

Proposto (urine), ma controverso

Indicatori biologici di esposizione a BENZENE

LC-MS/MS

GC, HPLC,LC-MS/MS

Spettrofotometro colorimetro

HPLC, rivelatoreHPLC, rivelatore elettrochimico

GC-MS, SPME

Metodi (e costi delle attrezzature)

400.000 euro

4.000 euro

40.000 euro

80.000 euro

•No correlation between benzene exposure and urinary biomarkers. •All benzene biomarkers but EOS t,t-MA were correlated with U-cotinine.•GSTM1 polymorphism modulated S-PMA excretion

Environmental and biological monitoring of benzene exposure in a cohort of Italian taxi drivers

(Manini et al., 2006)

1000 2000 3000EOS U-Cotinine (g/l)

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Log

EO

S S

-PM

A (g

/l)

Log EOS S-PMA = 0.51 + 0.00 x EOS U-Cot

r = 0.673

0 0 1000 2000

EOS U-Cotinine (g/g creatinine)

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

Log

EO

S U

-B (g

/l)

r = 0.631

Log EOS U-B = -0.11 + 0.00 x EOS U-Cot

MA + PGA (mg/l)

40010010

M1

-R (g

/l)

5000

1000

500

100

50

10

GSTM1 PositiveR2 = 0.37 NullR2 = 0.33

- Conclusione 1:Due differenti BEI per i PHEMA (Haufroid et al.,

2001) 1330 g/g creat per i soggetti GSTM1null 2878 g/g creat per i soggetti GSTM1pos

- Conclusione 2:L’interferenza del genotipo GSTM1 limita l’uso

dei PHEMA come indicatori di esposizione a stirene (De Palma et al., 2001).

Il genotipo GSTM1 modifica la regressione tra i principali metaboliti dello stirene il principale PHEMA nelle urine di lavoratori esposti

Reference values for styrene metabolites in urine

0 0.43 0.86 1.29 1.71 2.14 2.57 3.00

Mandelic acid, mg/g creat.

0

3

6

9

12

No. of

subje

cts

0 0.20 0.40 0.60 0.80

Phenylglyoxylic acid, mg/g creat.

2

4

6

8

No. of

subje

cts

0.084-2.339 mg/g creat. 0.009-1.238 mg/g creat.

Potential sources: Smoking habits, air pollution (ethylbenzene), food packaging (?)Manini et al., Int. Arch. Occup. Environ. Health, 2004

Antonio MuttiUniversity of Parma

Interazioni Geni-Ambiente nei tumori

Solo Geni

Solo Ambiente

Genix

Ambiente

Contributo relativo dell’ambiente

N.

di ca

si

5 95

Epidemiologia molecolare e le interazioni Gene-Ambiente a basse dosi

Polimorfismi metabolici

Esposizione AttivazioneDetossificazione ad agenti chimici Alta

Bassa

Alta

Bassa

Bassa

AltaAlta

Bassa

RR

Altri fattori:

•Polimorfismo degli enzimi di riparazione del DNA

•Fenotipo (induzione, inibizione competitiva legata ad abitudini voluttuarie, stili di vita, co-esposizioni ecc.)

•Sistema immunitario

•Polimorfismo dei recettori di ormoni, fattori di crescita, neurotrasmettitori, ecc.

•….


Bassa

Alta

Bassa

Alta

Bassa

Alta

Genomica e proteomica sono promettenti per la diagnosi, ma non sembrano altrettanto utili per la prevenzione.

Le interazioni (gene-gene e gene-ambiente) sono complesse e instabili (l’espressione genica è spesso transitoria).

La corrispondenza tra genotipo e fenotipo può essere scarsa, il che può condurre a false conclusioni.

Valutazione (provvisoria) dell’epidemiologia

molecolare


Uca Pugnax

(Granchio violinista)

Stiamo puntando troppo sulla “genomica” per afferrare le interazioni gene-ambiente?

GENI

ambiente


Unlike the genome, the exposome… evolves throughout the lifetime of the individual... However, the challenge may not be more daunting than the one faced two decades ago of investigating an estimated 10 million SNIPs in the human genome.

Chris Wild, 2005

On the need for an “exposome”


Example of metallic elementsmeasured by ICP-MS in exhaled breath


A. Mutti et al. Chest, 2006

Università degli Studi di Parma (Antonio Mutti, P.I.) Università degli Studi di Brescia, Italia (Pietro Apostoli) University of Massachusetts at Lowell, USA (Donald Milton) Université Catholique de Louvain, Belgio (Alfred Bernard)

Metals in exhaled breath condensate as COPD biomarkers

Grant: R01 HL72323

Transition elements(Cr, Cu, Mn)

Heavy metals(Cd, Pb, Hg)

Strongoxidants

Oxidativestress

High affinityfor SH groups

GSH depletion

Disease (COPD)

HypoxiaRe-oxygenationinjury

Cell injury

Tissue injuryand remodelling

Inflammation

Perfusion/ventilationimbalance

Elements in tobacco smoke

A. Mutti. Grant NIH R01 HL72323

Antonio Mutti, Massimo Corradi, Matteo Goldoni, Maria Vittoria Vettori, Alfred Bernard and Pietro ApostoliExhaled Metallic Elements and Serum Pneumoproteins in AsymptomaticSmokers and Patients With COPD or Asthma

(CHEST 2006; 129:1288–1297)

0.00

0.05

0.10

0.15

0.201.00

1.25

1.50

1.75

Controls

*

*

*

Ex smokersSmokers

COPD patients

Cd

(

g/L

) in

EB

C

0.000

0.025

0.050

0.52

0.92

Controls Smokers Asthmatics COPD

*

**

*

1.25

1.50

1.75

Cd

in E

BC

(

g/L

)Antonio Mutti, Massimo Corradi, Matteo Goldoni, Maria Vittoria Vettori, Alfred Bernard and Pietro ApostoliExhaled Metallic Elements and Serum Pneumoproteins in AsymptomaticSmokers and Patients With COPD or Asthma

(CHEST 2006; 129:1288–1297)

NSCLC 2

NSCLC 4Control 1Control 2Control 3

VOCs in Alveolar Air from Patients with Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) and controls.

GC-MS profiles

Retention time Retention time

Rel

ativ

e in

ten

sity

(S

/IS

rat

io)


Conclusioni

Le tecniche moderne consentono di misurare l’esposizione della popolazione generale.

Il fattore limitante è il costo, che - per unità di rischio - è in crescita esponenziale.

Nello studio delle interazioni gene-ambiente dovrebbero essere dedicate più energie alla definizione di “esposomi” ed al monitoraggio biologico.

Non solo, ma soprattutto a basse dosi, è cruciale la scelta dei controlli e la verifica della loro appartenenza alla popolazione generale.


Importanza (e difficile scelta) dei controlli nello studio degli effetti di basse dosi: il ruolo dei valori di riferimento

Popolazione generale

Gruppo non esposto

Vicini con esposizione simile

Popolazione generale

Soggetti suscettibili

V.R.

V.R.

Trovare i controlli giusti può essere più difficile del previsto…

Grazie per la vostra attenzione!


Rex ha cercato di restare in equilibrio, ma è un cane vecchio e l’esercizio nuovo…

Recent developments in human biomonitoring: non-invasive assessment of target tissue dose and effects of pneumotoxic metals

Antonio Mutti

Cromo(VI) nel condensato dell’aria esalataEstratto da:

Exhaled biomarkers Exposure Effect(Target tissue dose) (NO, H2O2, mediators, etc.)

Kidney

Liver

Lung

G.I.Tract

SkinBlood

Urine

Systemic Markers of Internal Exposure/Dose

Target site

Adverse effects by air pollutants may be due to their strong reactivity or poor solubility.In either cases, retained dose (exposure) seems to be the main determinant of pneumotoxicity.

TURBO-DECCS: Transportable Unit for Research on Biomarkers Obtained with Disposable Exhaled Condensate Collection Systems

Exhaled Breath Condensate:How to collect it?

Transportable (3Kg), temperature control, disposable device

non invasive method; simple (disposable

device), suitable for

field studies; easy to repeat; applicable in all

subjects; simple matrix (water); analysis possible

without sample

manipulation.. Control over Control over

temperaturetemperature

EBC Collection in Practice

Owing to higher temperature, longer electrolitic process, and higher Cr(VI) concentrations, hard (thick) chromeplating is associated with higher exposure levels as compared to decorative (thin) plating.

Cr(VI)-exposed workers

From Guidetti, Thesis, University of Parma, 2004

Chrome plating

Chrome platingCr(VI)-exposed workers

Caglieri et al. EHP 2006

Pre-shift Fri. Post-shift Fri. Pre-shift Mon.

0.1

1

10

100

6.637.84

4.73

p<0.0001

p=0.025

Reference Interval

Cr-

U (

g/g

creat)

Caglieriet al.EHP 2006

ChromeplatingChromeplatingCr(VI)-exposedworkers

Pre-shift Fri. Post-shift Fri. Pre-shift Mon.

0.01

0.1

1

10

100

3.78 4.98

2.80

p=0.0272

p=0.0044

Reference Interval

Cr-

EB

C (

g/l)

Reference Interval


Chrome platingCr(VI)-exposed workers

Pre-shift Fri. Post-Shift Fri. Pre-shift Mon.

0.01

0.1

1

10

0.370.61

0.18

p=0.007

p=0.0092

p<0.0001

Reference interval

H2O

2-EB

C (

M)

Reference Interval

0.01 0.1 1 10 100

0.01

0.1

1

10

r=0.56;p<0.0001

Cr-EBC(g/l)

H2O

2-EB

C (

M)


Chrome platingEBC from Cr(VI)-exposed workers

Cr speciation in EBC

Next morningPost-shift

Goldoni et al. Anal Chim Acta 2006

Chrome plating

0.1

1

10

Cr(VI)Cr totCr(VI)

Cr-

EB

C (

g

/ l )

Cr tot

2.6 1.50.9 0.2*

*

Goldoni et al. Anal Chim Acta 2006

Cr speciation in EBC

Chrome plating

0.01

0.1

1 **

Cr(

VI)

/Cr T

OT

67.7% 33.5% 16.5%

***

* = p<0.05; ** = p<0.01

End-of-shift Next morningAirborne

Airborne Cr(VI) was reduced by 50% in airway lining fluid sampled at the end of exposure.

A further 50% reduction was observed after 15 h.

The persistence of Cr(VI) in EBC and its correlation with inflammation markers (H2O2) supports the use of EBC to assess target tissue levels of Cr(VI).

Conclusions

Cr in EBC Chrome plating

Acknowledgements University of Parma, Italy: Massimo

Corradi, Matteo Goldoni, Paola Manini, Olga Acampa, Rossella Alinovi, Roberta Andreoli, Andrea Caglieri, Giuseppe De Palma, Giuseppina Folesani, Paola Mozzoni, Diana Poli

University of Brescia, Italy: Pietro Apostoli UCL, Brussels, Belgium: Alfred Bernard University of Massachusetts at Lowell, MA: Donald Milton NIOSH, Morgantown, WV: Kay Kreiss, Nancy Sahakian ITALCHILL, Parma, Italy: Carlo Valesi

Basse Dosi Di Cancerogeni

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