Azione Biotech III SVILUPPO DI UN SISTEMA DI RIVELAZIONE...
Transcript of Azione Biotech III SVILUPPO DI UN SISTEMA DI RIVELAZIONE...
Il progetto ha permesso il conseguimento di una serie di risultati per la realizzazione di dispositivi diagnostici altamente innovativi sia dal punto di vista industriale che dal punto di vista scientifico
ARRAY ANTICORPALI
Messa a punto di array anticorpali da utilizzare in saggi di screening di SCCA-IgM nel siero di pazienti affetti dal cancro al fegato
ARRAY CELLULARI
L'analisi degli array cellulari ha dimostrato la presenza di SCCA in singole cellule, evidenziando come questa metodica possa divenire un utile ausilio diagnostico per l’epatocarcinoma
AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE
Sintetizzati e caratterizzati composti lantanidici con leganti ditiocarbammici e derivati cumarinici ed effettuate prove di stabilità in ambiente fisiologico e test di luminescenza in differenti solventi.
Studiato da un punto di vista biochimico l’esatta sequenza e struttura dell’anticorpo monoclonale CA19-9
Sintetizzati due peptidi immunomimeticiattualmente in fase di bioconiugazione con i complessi ottenuti
REALIZZAZIONE DEL DISPOSITIVO OPTOELETTRONICO
Realizzato un prototipo di rilevatore portatile di biochip optolettronici con microarrays anticorpali con caratteristiche di:
miniaturizzazione
buona sensibilità
risoluzione elevata
Risultati
Prospettive future
REALIZZAZIONE DEL DISPOSITIVO OPTOELETTRONICO
Ulteriore sviluppo della miniaturizzazione del lettore optoelettronico di biochip e
integrazione di un modulo wireless per la trasmissione in tempo reale dei dati
per una diffusione il più possibile capillare della diagnostica sul
territorio.
L’ottimizzazione del dispositivo dipenderà dall'intensità del segnale
luminescente proveniente dal biochip, obiettivo di ricerche future.
AMPLIFICAZIONE DEL SEGNALE
Bioconiugazione dei complessi all’anticorpo a 37°C (CHIA)
Studio dei cambiamenti nelle proprietà di luminescenza dopo la reazione di bindingtra CA 19-9 e antigene (CHIA)
Sintesi e caratterizzazione di nuovi complessi con vari leganti all’ossigeno macrociclici dei seguenti lantanidi: Sm, Pr, Dy, Tb e Eu e loro bioconiugazione (CHIA & LIA)
Caratterizzazione: studi di stabilità in ambiente fisiologico mediante spettrofotometria UV-Vis e luminescenza (CHIA& LIA)
ARRAY ANTICORPALI E CELLULARI
Sviluppo di biochip per l’analisi multimarcatore per la diagnosi precoce, per il monitoraggio dello sviluppo della neoplasia e per il controllo dell’efficacia del trattamento terapeutico dei pazienti
oncologici.
Integrazione degli array anticorpali e cellulari in piattaforme microfluidiche
per una gestione automatizzata ed integrata delle varie fasi di analisi
SVILUPPO DI UN SISTEMA DI RIVELAZIONE PER LA LETTURA DI MICROARRAY ANTICORPALI E CELLULARI PER LA DIAGNOSI IN ONCOLOGIA
(PRODESYS)
Azione Biotech III
• Sensibilità diagnostica per usi clinici;
• Linearità degli intervalli di misurazione;
• Riproducibilità tra lotti;
• Tempo di stabilità;
• Facilità d’uso;
• Dispositivo di tipo usa e getta;
• Richiede piccoli volumi del campione da analizzare;
• Permette di implementare la rilevazione con fluorescenza o chemiluminescenza;
• Permette di realizzare il point of care per i dispositivi diagnostici;
• Riduzione dei costi di produzione;
• Riduzione dei costi per analisi
Vantaggi del Vantaggi del biochipbiochip
Array anticorpaliXeptagen S.p.A.
Test del BIOCHIP con siero HCC e siero di controlloTest del BIOCHIP con siero HCC e siero di controllo
Vetrino Anti-SCCAAnti-SCCAAnti-IgM
Campione
HCC
Campione di controllo
anti-S
CCA
anti-S
CCA
anti-IgM
anti-SCCA
anti-SCCA
anti-IgM
Problematiche: prestazioni dei vari componenti e difficoltà tecnologiche di realizzazione
Tipo di rivelatore: CCD o CMOS
Ottiche: pinhole, lenti asferiche, bundle di fibre ottiche
Elettronica di gestione e di visualizzazione delle immagini
Raffreddamento del sensore per aumentarne la sensibilità Sensore CMOS con risoluzione 2592 x 1944
Sensore ad alta risoluzione con lente asferica
Schema dell’elettronica realizzata per pilotare uno dei sensori
Il sensore a diretto contatto con una cella Peltier per il
raffreddamento
Sviluppo del dispositivo optoelettronicoPhoenix – Ricerca e Tecnologie Ottiche srl
Obiettivi del progetto
Sviluppare array di tipo cellulare e di tipo anticorpale (BIOCHIP) per la rilevazione di marker tumorali, associati alla realizzazione di lettori optoeletronici portatili di biochip per la diffusione il più possibile
capillare sul territorio della diagnostica di epatocarcinoma.
I partner coinvolti hanno perseguito l’obiettivo tramite tre strategie di ricerca strettamente connesse:
a)
messa a punto di kit diagnostici
basati su array anticorpali e/o
cellulari per la valutazione di
biomarcatori tumorali
b)
sviluppo di un sistema di
amplificazione e di lettura del
segnale luminescente per
potenziarne la sensibilità
c)
sviluppo di un prototipo di rivelatore
optolettronico portatile di biochip che
utilizzando i risultati delle precedenti due
strategie
consenta di eseguire test di screening
direttamente on site negli ambulatori di
medicina generale e/o specialistica
I Partner
Phoenix - Ricerca e Tecnologie Ottiche S.r.l. - Padova
Dr. Leonardo Placentino
Xeptagen S.p.A. - Marghera Venezia
Dr. Luca Beneduce
Dipartimento di Scienze Chimiche - Università di Padova
Prof. Dolores Fregona, Dr. Chiara Nardon
Dipartimento di Istologia, Microbiologia e Biotecnologie Mediche - Università di Padova
Prof. Ignazio Castagliuolo
Dipartimento di Farmacologia ed Anestesiologia - Università di Padova
Dr. Maria Cecilia Giron
Dipartimento di Principi e Impianti di Ingegneria Chimica - Università di Padova
Prof. Nicola Elvassore
Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale - Università di Padova
Dr. Patrizia Pontisso
CellsCellsCellsCells
Produzione di array cellulari mediantemicro-contact printing
Array cellulariDipartimento di Principi e Impianti di Ingegneria Chimica
Dipartimento di Medicina Clinica e SperimentaleAmplificazione del segnale di rilevazione di biomarcatori
Dipartimento di Scienze Chimiche Dipartimento di Istologia, Microbiologia e Biotecnologie Mediche
Dipartimento di Farmacologia ed Anestesiologia
esterasi
= Complesso lantanidico bioconiugato con legame estereo
C O SA D EVE AVVEN IRE?
Un cambiamento delle proprietà di luminescenza in seguito al bindingtra antigene e anticorpo per la
variazione dell’interazione tra Ln3+
e il partner amminoacidicodonatore nell’ET.
Da un punto di vista chimico-fisico questa interazione può
avvenire tramite due meccanismi (Förster o
Dexter) in base alla distanzatra D e A e alla mutua
orientazione dei momenti di dipolo di transizione.
Fa s i d e l l a r i c e r c a :
� Sintesi e caratterizzazione (IR, NMR, termogravimetrica, elementare) di nuovicomplessi con vari leganti sfruttando i seguenti lantanidi: Sm, Pr, Dy, Tb e Eu
� Studi UV-Vis e luminescenza
� Studio approfondito della stuttura e sequenza dell’anticorpo CA 19-9 a livellobiochimico
� Sintesi di un tetrapeptide e un decapeptide con una ben determinatasequenza riproducenti delle regioni specifiche dell’anticorpo CA 19-9
� Bioconiugazione dei complessi all’anticorpo a 37°C
� Studio dei cambiamenti nelle proprietà di luminescenza dopo la reazione di binding tra CA 19-9 e il corrispondente antigene
Conclusioni
Ci aspettiamo che o il primo approccio (LIA) o il secondo(CHIA) sia caratterizzato da:
�limite di rilevabilità inferiore a 1 U/mL
oppure
�limite di rilevabilità comunque basso ma ottenibiletramite una metodica più veloce che sfrutti un biosensore meno costoso e più facile da utilizzarerispetto a quelli attualmente in uso.
Perché i Lantanidi (Ln3+)?
Molti vantaggi rispetto alle sonde organiche fluorescenti
normalmente utilizzate:
•Grandi Stokes’ shift
•Tempi di decadimento della luminescenza lunghi (τ ~ms-µs)
Time-resolved immunoassays