APPROCCI GENETICI ALLA

CURA DELLE MALATTIE

Trattamento della malattia genetica vs

trattamento genetico della malattia

Trattamento medico convenzionale mira ad

alleviare i sintomi di una malattia sia genetica che

non.

I trattamenti esistenti per molte malattie genetiche

sono insoddisfacenti.

Per alcune malattie genetiche di cui riconosciamo in

dettaglio le basi molecolari e cellulari è stato

possibile individuare una cura (errori congeniti del

metabolismo).

Interventi per malattie genetiche del

metabolismo

Substrato limitante.Substrato limitante. Es. fenilchetonuria (deficienza genetica di

fenilalanina idrossilasi) limitare l’assunzione di fenilalanina con la

dieta.

Sostituzione di un prodotto difettoso. Sostituzione di un prodotto difettoso. Es. ipotiroidismo congenito

somministrazione di ormone tiroideo; enzimopatie congenite

trattamento sostitutivo con enzimi.

Uso di vie alternative per rimuovere metaboliti tossici. Uso di vie alternative per rimuovere metaboliti tossici. Es. emocromatosi

salasso per limitare il sovraccarico di Fe; disturbi del ciclo dell’urea

uso del benzoato per aumentare l’escrezione dell’azoto.

Uso di inibitori metabolici. Uso di inibitori metabolici. Es. tirosinemia di tipo I (difetto a livello

dell’enzima fumarilacetoacetato idrolasi) uso di un farmaco inibitore,

2-(2-nitro-4-trifluorometilbenzoil)-1,3-cicloexanedione (NTBC),

dell’enzima 4-idrossifenilpiruvato diossigenasi.

Trattamento genetico di una malattia:

intervento a più livelli

Definizione del genotipogenotipo del paziente per prevedere la risposta positiva o negativa ad un dato trattamento farmacologico.

Uso delle conoscenze di genetica e biologia cellulare per identificare possibili persagli possibili persagli contro cui sviluppare nuovi farmaci.

Uso di tecniche genetichetecniche genetiche per produrre farmaci e vaccini per uso terapeutico.

Cura di malattie mediante l’uso di proteine terapeutiche prodotte e/o modificate mediante l’ingegneria genetica (proteine ricombinanti)l’ingegneria genetica (proteine ricombinanti).

Uso della genetica in supporto di metodi di

trapianto cellulare per il trattamento delle malattie

la cui patogenesi comporta la perdita di tessuto o

cellule cellulecellule staminali.staminali.

Modificazione genetica diretta delle cellule del

paziente terapia genica. terapia genica. Es. inserimento di un

gene, alterazione dell’espressione di un gene.

Farmaci attualmente in uso

I farmaci attualmente in uso sono spesso piccole molecole chimiche estratte da sostanze naturali o sintetizzate chimicamente.

Sono stati generalmente sviluppati quando le informazioni sui possibili bersagli molecolari erano ancora scarse.

L’intera gamma dei farmaci attualmente commercializzati agisce su poche centinaia di molecole-bersaglio, che appartengono ad un numero limitato di classi di proteine come recettori (GPCRs), enzimi (protein chinasi e fosfatasi, proteasi) o proteine canale (canali voltaggio-dipendenti).

Farmacogenomica

Le industrie farmaceutiche hanno investito ingenti

somme di denaro nella genomica per cercare di

identificare nuove molecole-bersaglio.

Ricerca di farmaci genetici farmaci genetici indirizzati verso uno specifico

prodotto genico, come i composti che sopprimono in

generale i codoni di stop. Es. PTC124 o ataluren, che

permette di superare i codoni di stop prematuri

(mutazioni nonsenso), senza alterare il riconoscimento

dei codoni di stop corretti (terapia della fibrosi cistica,

della distrofia muscolare e di alte malattie genetiche).

Ataluren

Genomica e proteomica dei

microorganismi patogeni

Sviluppo di nuovi vaccini e trattamenti

farmacologici.

Sequenziamento dell’intero genoma del plasmodium

falciparum.

Analisi del genoma del plasmodio alla ricerca di

enzimi specifici o di enzimi assenti nel parassita.

Identificazione di proteine di superficie del

patogeno che possono essere il bersaglio di nuovi

vaccini.

Proteine ricombinanti ottenute attraverso il

clonaggio in vettori di espressione

Proteina ricombinante Per il trattamento di

Insulina (1982) Diabete mellito

Ormone della crescita Deficienza dell’ormone (nanismo ipofisario)

Fattore VIII di coagulazione Emofilia A

Fattore IX di coagulazione Emofilia B

Interferone Leucemia a cellule capellute; epatite cronica

Interferone Sclerosi multipla

Interferone Infezioni in pazienti con malattia

granulomatosa cronica

Attivatore tissutale del plasminogeno Disordini trombotici

GM-CSF, fattore di crescita dei granulociti e

dei macrofagi

Neutropenia in seguito a chemioterapia

Leptina Obesità

Eritropoietina Anemia

Espressione di proteine ricombinanti

EscherichiaEscherichia coli coli polipeptidi semplici bioreattori

SaccaromycesSaccaromyces cervisiaecervisiae polipeptidi semplici bioreattori

Cellule di mammifero Cellule di mammifero come la linea cellulare derivata da ovaio di criceto CHO per esprimere proteine complesse come anticorpi e citochine.

Animali transgenici Animali transgenici (capre, pecore o maiali): per la produzione di grandi quantità di proteine facilmente purificabili nel latte. Es. Atryn (2009 FDA, GTC Biotherapeutics), un antitrombina usata nelle terapie anticoagulanti.

Produzione di anticorpi per uso terapeutico

Anticorpi monoclonali (mAb): secreti da ibridomi linee cellulari

immortalizzate prodotti dalla fusione di linfociti B di un topo

immunizzato, che producono l’anticorpo d’interesse, con un linfocita B

tumorale (cellula di mieloma) di topo.

Produzione mediante l’ingegneria genetica di anticorpi monoclonali

modificati, in cui alcune parti o tutta la sequenza di roditore sono

sostituite con l’equivalente sequenza umana:

mAbmAb chimericichimerici: le sequenze delle regioni variabili originali di roditore

sono mantenute, ma la sequenza per la regione costante è sostituita

con la sequenza equivalente di origine umana;

mAbmAb umanizzatiumanizzati: contenenti solo come sequenze originali di roditore le

regioni CDR (complementary determining reions), mentre il resto della

molecola è costituita dalla sequenza di origine umana.

Anticorpi monoclonali

Produzione di anticorpi per uso terapeutico

o: mAb di topo; xi, mAb chimerico; zu, mAb umanizzato; xizu, mAb chimerico/umanizzato;

u, mAb completamente umano.

Produzione di anticorpi per uso terapeutico

SingleSingle--chainchain variablevariable fragmentfragment ((scFvscFv) ) antibodiesantibodies: hanno la stessa specificità di legame di un mAb, ma sono formati da una singola catena variabile non glicosilata. Questi anticorpi possono essere prodotti su larga scala in cellule batteriche, di lievito ed in cellule vegetali. Sono particolarmente adatti come anticorpi intracellulari (intracorpi): invece di essere secreti sono progettati in modo da legare specifici bersagli intracellulari e possono anche essere indirizzati verso specifici compartimenti subcellulari.

SingleSingle--chainchain variablevariable fragmentfragment ((scFvscFv) ) antibodiesantibodies

SingleSingle--chainchain variablevariable fragmentfragment ((scFvscFv) ) antibodiesantibodies

mAb parzialmente od interamente umani approvati dal FDA nel 2008

Malattia Bersaglio Nome generale e

commerciale del mAb

Tipo di mAb Malattia

trattata

Malattie

autoimmuni

immunologiche

CD11a

CD25 = IL2R

Complemento-5

IgE

Integrina 4

TNF-

Efalizumab (Raptiva)

Basiliximab (Simulect)

Daclizumab (Zenapax)

Eculizumab (Soliris)

Omalizumab (Xolair)

Natalizumab (Tysabri)

Infliximab (Remicade)

Certolizumab pegol

(Cimzia)

Adalimumab (Humira)

Umanizzato

Chimerico

Umanizzato

Umanizzato

Umanizzato

Umanizzato

Chimerico

Umanizzato

Completament

e umano

Psoriasi

Prev. del rigetto

nei trap. di rene

Emogl. paros. n.

Asma

Sclerosi multipla

Morbo di Crohn,

artrite

reumatoide

Cancro CD20

CD33

CD52

Rituximab (Rituxan,

MabThera)

Gentuzumab ozogamicin

(Mylotarg)

Alemtuzumab

(Campath)

Chimerico

Umanizzato

Umanizzato

Linfoma non-

Hodgkin

Leucemia

mieloide acuta

CD33+

leucemia

linfoide cronica

a cellule B

Malattia Bersaglio Nome generale e

commerciale del mAb

Tipo di mAb Malattia trattata

Cancro EGFR

HER2

VEGF

Cetuximab (Erbitux)

Panitumamab

(Vectibix)

Trastuzumab

(Herceptin)

Bevacizumab (Avastin)

Chimerico

Completamente

umano

Umanizzato

umanizzato

Cancro del

colon-retto

Cancro del seno

metastatico

Cancro del colon-retto,

rene, polmone

Altre

malattie

GPIIb/IIIa

RSV

VEGF

Abciximab (ReoPro)

Palivizumab (Synagis)

Ranibizumab (Lucentis)

Chimerico

Umanizzato

Umanizzato

Aggiunto

nell’angioplastica

coronarica

transluminale

percutanea

Profilassi contro il virus

respiratorio sinciziale

Degenerazione

maculare legata

all’età (iniezione

intravitreale)

Aptameri

Si possono selezionare corti oligonucleotidi (o peptidi) che si leghino a (e inibiscono) specifiche proteine bersaglio, con affinità simile a quella degli anticorpi.

Gli aptameriaptameri vengono ottenuti attraverso cicli successivi di selezione ed amplificazione, a partie da un ampio assortimento di oligonucleotidi a sequenza casuale sulla base del metodo SELEX (systematic evolution of ligands by esponential enrichment).

Aptameri

Potenziali applicazioni terapeutiche degli aptameri:

inibizione di molecole intracellulari, come fattori

trascrizionali;

inibizione di molecole extracellulari.

L’aptamero pegaptanib (Macugen) è stato

approvato dal FDA per il trattamento della

degenerazione maculare essudativa legata all’età.

Il pegaptanib si lega in maniera specifica al VEGF

e ne inibisce l’azione pro-angiogenica.

Ingegneria genetica e vaccini

L’ingegneria genetica è stata applicata in vari modi per produrre

nuovi tipi di vaccini.

Può essere utilizzata per disattivare un microorganismo patogeno

o oppure per produrre un antigene modificato del patogeno che

risulta più immunogenico (vaccino ricombinantevaccino ricombinante):

Antigene ricombinante del virus dell’epatite B;

Tossina della pertosse ricombinante.

Vaccini a DNA (induzione di risposta immunitaria sia umorale che

cellulare).

Vaccini antitumorali:

vaccini antitumorali preventivi;

vaccini antitumorali terapeutici.

Terapia genica

Modificazione genetica diretta delle cellule del

paziente a scopo terapeutico.

Terapia su cellule germinali (su gamete, zigote od

embrione precoce).

Terapia su cellule somatiche modificazione di

specifiche cellule o tessuti: cellule bersaglio quelle

direttamente coinvolte nella patologia o quelle del

sistema immunitario per indurre una potente

risposta immunitaria per esempio contro il tumore.

Terapia genica

Terapia di incremento genico (aggiunta di un gene): es. fibrosi cistica; rimpiazzare un gene oncosoppressore difettoso nei tumori.

Eliminazione di mutazioni patogeniche: ripristinare la funzione del gene mutato.

Inibizione mirata dell’espressione genica: patologie infettive, autoimmuni, silenziamento di un allele mutante in una malattia ereditaria.

Uccisione mirata di cellule bersaglio: terapia dei tumori 1) uccisione diretta mediante l’uso di geni codificanti endotossine; 2) uccisione indiretta mediante l’induzione di una risposta immunitaria molto forte.

Terapia genica

Trasferimento dei geni nelle cellule del paziente:

geni clonati (DNA), RNA od oligonucleotidi.

Uso di vettori virali (trasferimento del DNA nelle

cellule: trasduzione.

Metodi non basati su virus (DNA, RNA,

oligonucleotidi): trasfezione.

Terapia genica ex vivo.

Terapia genica in vivo.

Terapia genica: vettori virali

Retrovirus oncogeni (): ssRNA; 7-8 kb; integrazione; solo in

cellule in divisione; permanente; resa modesta di produzione

dei vettorie rischio di attivare oncogeni.

Lentivirus: ssRNA; fino a 8 kb; integrazione; cellule in

divisione e non , tropismo variabile; permanente ed alti livelli

di espressione; alta resa di produzione dei vettori ma rischio

di attivare oncogeni.

Adenovirus: dsDNA; 7,5 kb (fino a 35 kb nei vettori svuotati);

non integrazione; cellule in divisione e non; espressione

transiente, ma ad alti livelli; alta resa di produzione dei

vettori, immunogenecità.

Terapia genica: vettori virali

Virus adeno-associati: ssDNA; < 4,5 kb; non integrazione;

cellule in divisione e non; alti livelli di espressione a medio e

lungo termine (1 anno); alta resa di produzione dei vettori,

bassa capacità di clonaggio, ma immunogenicità ridotta.

Herpex simplex virus: dsDNA; > 30 kb; non integrazione;

sistema nervoso centrale; potenziale espressione permanente;

in gradi di instaurare infezioni latenti per tutta la vita.

Vaccina virus: dsDNA; 25 kb; non integrazione; cellule in

divisione e non; transiente.

Terapia genica

I sistemi di trasferimento genico non virale sono più sicuri, ma il

trasferimento genico è meno efficiente e spesso l’espressione

dei transgeni è debole.

Trasferimento dell’ac. nucleico per iniezione diretta o con

bombardamento di particelle.

Tasferimento genico mediato da lipidi.

Nanoparticelle compatte di DNA.

Terapia genica

RNA e oligonucleotidi terapeutici: per inattivare in

modo selettivo un allele mutante.

Ribozimi terapeutici.

siRNA terapeutici.

Gli oligonucleotidi antisenso possono indurre il salto

di un esone(exone skipping) per superare una

mutazione dannosa.