Regolazione dell’espressione genica

I promotori batterici hanno due sequenza consenso

distinte

Trascrizione nei procarioti

Regolazione dell’espressione genica nei procarioti

Il modello dell’operone di Jacob-Monod per la regolazione dei geni:

Proposto nel 1959, questo modello introduceva il concetto di geni regolatori che codificano per prodotti (proteine) che controllano altri geni.

L’operone lac è un esempio di controllo negativo degli enzimi coinvolti nel metabolismo del lattosio. Tuttavia, questo operone viene anche regolato da un controllo positivo.

Il modello dell’operone ha portato alla scoperta degli mRNA.

Modello del’operone di Jacob e Monod

Esperimento (1966) di Gilbert e Müller-Hill che dimostra che il repressore lac, una proteina, si lega al DNA dell’operatore

Regolazione dell’operone del lattosio (lac)

Nei batteri i geni sono organizzati in operoni, che sono unità di espressione e di regolazione dei geni batterici, che comprendono geni strutturali ed elementi di controllo nel DNA che vengono riconosciuti dai prodotti dei geni regolatori.

I geni di un operone sono sotto il controllo di un solo promotore e si produce un singolo trascritto di mRNA o “mRNA policistronico”.

Le caratteristiche dell’operone lac illustrano i principi fondamentali universali della regolazione dei geni.

Regolazione dell’operone lac

da parte del glucosio e del

lattosio

Uso in biologia molecolare del promotore lac e del gene lac Z

Gene lac Z -galattosidasi X-gal prodotto colorato (blu): strategie di screening di colonie batteriche trasformate con DNA ricombinante (clonaggio); usato come gene reporter per lo studio della regolazione genica in animali transgenici o cellule in coltura.

Il meccanismo trascrizionale del promotore lac è usato in indurre l’espressione di proteine etererologhe in E. coli (uso di IPTG per indurre l’espressione della proteina ricombinate).

Meccanismi d’azione dei regolatori trascrizionali

Legame cooperativo delle proteine al DNA: importante sia nei procarioti che negli eucarioti; es. della proteina CAP che ha un dominio di legame al DNA ed un dominio detto “regione di attivazione” che entra in contatto con la RNA polimerasi che si lega al promotore.

Modificazioni allosteriche e legame al DNA: ci sono due esempi, 1) il legame del cAMP alla proteine CAP che induce un cambiamento allosterico in quest’ultima per cui si lega più saldamente al DNA; 2) il legame dell’allolattosio o dell’IPTG alla proteina repressore dell’operone lac che induce un cambiamento allosterico nel repressore che fa diminuire la sua capacità di legarsi al DNA.

Formazione di anse da parte del DNA: la formazione di anse di DNA permette a proteine, anche distanti, legate sul DNA di interagire con la DNA polimerasi legata al promotore.

Complesso CAP-DNA

L’operone del Triptofano (trp)

La regolazione dell’operone del trp nei batteri è un classico esempio di attenuazione trascrizionale.

Due meccanismi di attenuazione:

Controllo post-trascrizionale mediante ripiegamento differenziale dell’mRNA.

Controllo dell’inizio della trascrizione dell’operone trp mediante il legame di un repressore, attivato dal legame con il triptofano, a siti operatori, con conseguente blocco dell’accesso della RNA polimerasi al promotore trp.

Attenuazione trascrizionale dell’operone trp di E. coli

Regolazione della trascrizione negli eucarioti

Concetto di elementi cis-agenti and trans-agenti del DNA e fattori trans-agenti.

Fattori che intervengono nella regolazione della trascrizione negli eucarioti:

Interazioni DNA-proteina;

Interazioni proteina-proteina;

Struttura della cromatina;

Architettura del nucleo;

Compartimentazione cellulare.

Il controllo dell’espressione genica negli eucarioti può essere

esercitato a molti livelli oltre che a livello trascrizionale.

Regolazione della trascrizione negli eucarioti

La RNA polimerasi II è responsabile della trascrizione della grande maggioranza dei geni eucariotici:

Geni codificanti per mRNA;

Geni codificanti per snoRNA;

Geni codificanti per alcuni snRNA;

Geni codificanti per microRNA.

Negli eucarioti esistono altre due RNA polimerasi: RNA polimerasi I localizzata nel nucleolo responsabile della sintesi dell’rRNA grande; RNA polimerasi III si trova nel nucleoplasma ed è responsabile della sintesi dell’tRNA, dell’rRNA 5S e di alcuni snRNA.

Elementi regolatori dei geni codificanti proteine

Fattori di trascrizione (attivatori o repressori) CREB, CTCF, FOG-1, GATA-1, NF-E2, NF-B, Sp1.

Macchinario generale della trascrizione RNA pol II, TFIIB, TFIID (TBP + TAF), TFIIE, TFIIF, TFIIH, Mediatore.

Coattivatori e corepressori complessi di modificazione della cromatina (HAT, HDAC, CBP, HMT, LSD1), complessi di rimodellamento della cromatina (SWI/SNF, ISWI, SWR1).

Fattori di allungamento FACT, allungatore, TFIIS.

Le unità trascrizionali (RNA pol II) degli eucarioti

10 kb 2 – 3 kb

Le unità trascrizionali (RNA pol II) degli eucarioti

Elementi regolatori cis-agenti degli eucarioti multicellulari:

Elementi promotori (vicini al punto di inizio della trascrizione) nucleo del promotore + elementi prossimali del promotore (elementi a monte del promotore od elementi regolatori a monte);

Elementi regolatori a lungo raggio.

Il nucleo del promotore

Sequenza di 60 bp di DNA sovrapposta al sito +1;

E’ il sito di riconoscimento per la RNA pol II e per i fattori generali di trascrizione (TFII).

Motivi del nucleo del promotore della RNA pol II

Promotore Posizione Fattore di trascrizione Sequenza consenso

Elementi a monte del nucleo del promotore

BRE

TATA Box

Iniziatore

-37 a -32

-31 a -26

-2 a +4

TFIIB

TBP

TAF1 e TAF2

(G/C)(G/C)(G/A)CGCC

TATA(A/T)AA(G/A)

PyPyA+1N(T/A)PyPy

Elementi a valle del nucleo del promotore

MTE

DPE

+18 a + 27

+28 a + 32

TFIID

TAF9 e TAF6

C(G/A)A(A/G)C(G/C)

(C/A/G)AACG(G/C)

(A/G)G(A/T)(C/T)(G/A/

C)

Elementi prossimali del promotore

CAAT box

GC box

-200 a -70

-200 a -70

CBF, NF1, C/EBP

Sp1

CCAAT

GGGCGG

CBF: fattore che lega CAAT;

C/EBP: proteina che lega CAAT/enhancer

Elementi regolatori a lungo raggio

Questi elementi degli eucarioti multicellulari comprendo:

Enhancer;

Silenziatori;

Isolatori;

Regioni di controllo del locus (LCR);

Regioni di attacco alla matrice (MAR).

Alcuni enhancer che sono negli introni contribuiscono all’espressione tessuto-specifica enhancer nel secondo introne del gene dell’apolipoproteina B (apoB delle LDL).

Enhancer e silenziatori

Questi elementi sono di solito a 700 – 1000 o più bp di distanza dal sito di inizio della trascrizione.

Gli enhancer si possono trovare sia a monte che a valle del gene, o dentro un introne, e possono funzionare in entrambi gli orientamenti rispetto al promotore.

Un enhancer è lungo 500 bp e contiene 10 siti di legame per fattori di trascrizione diversi.

I silenziatori sono elementi simili agli enhancer, ma reprimono l’espressione del gene.

Enhancer e

Silenziatori

Isolatori

Un isolatore è una sequenza di DNA, di solito lunga 300 – 2000 bp, che ha la funzione di:

Marcatore di un confine di cromatina, tra regioni di eucromatina ed eterocromatina;

Attività di blocco di un enhancer o di un silenziatore.

Contiene un gruppo di siti di legame per proteine che legano sequenze specifiche di DNA.

Isolatori

Gli elementi isolatori sono riconosciuti da almeno 3 proteine diverse che legano il DNA: fattore che lega CCCTC (CTCF) ed i fattori stimolatori a monte (USF) 1 e 2. CTCF media l’attività di blocco dell’reclutano enzimi che modificano la cromatina.

Gli elementi isolatori sono riconosciuti da almeno 3 proteine diverse che legano il DNA: fattore che lega CCCTC (CTCF) ed i fattori stimolatori a monte (USF) 1 e 2. CTCF media l’attività di blocco dell’enhancer mentre USFs reclutano enzimi che modificano la cromatina.

Regioni di controllo del locus (LCR)

Le LCR sono sequenze di DNA che organizzano e mantengono un dominio funzionale di cromatina attiva e fanno aumentare la trascrizione dei geni a valle.

Siti ipersensibili (HS) alla DNasi a monte del gruppo dei geni della -globina.

Le LCR sono presenti in altri loci genici fra cui: i gruppi di geni che codificano le -globine, i pigmenti visivi, le proteine del complesso maggiore di istocompatibilità, gli ormoni della crescita umani, le serpine, le citochine delle cellule T helper di tipo 2.

Regioni di controllo del locus (LCR)

L’intero locus dei geni della -globina occupa 200 kb.

La LCR è necessaria per la trascrizione ad alto livello di tutti i geni della famiglia della -globina.

La regolazione della formazione di “anse” di cromatina è il meccanismo che controlla l’espressione durante lo sviluppo dei geni della -globina.

La LCR interagisce con un solo promotore genico alla volta, così da garantire l’espressione differenziale dei diversi geni durante lo sviluppo.

Regioni di attacco alla matrice (MAR)

L’organizzazione tridimensionale della cromatina ha anche un ruolo centrale nel controllo della trascrizione negli eucarioti.

Organizzazione in anse indipendenti della cromatina. La formazione di queste anse dipende da elementi specifici di sequenza del DNA che sono sparsi in tutto il genoma ad intervalli di 5 – 200 kb.

Queste sequenze di DNA sono chiamate regioni di attacco alla matrice (MAR).

Le MAR organizzano il genoma in 60000 anse di cromatina con una dimensione media di 70 kb.

Regioni di attacco alla matrice (MAR)

I geni attivi tendono a far parte di domini ad ansa piccoli, mentre quelli inattivi sono associati a domini più grandi.

Più del 70% delle MAR sono ricche di sequenze AT

Le MAR si trovano vicino agli enhancers. Conferiscono specificità tissutale e controllo durante lo sviluppo dell’espressione genica reclutando fattori di trascrizione e richiamando gli enzimi di rimodellamento della cromatina.

MAR strutturali servono come ancore; MAR funzionali sono dinamiche e aiutano a portare i geni sulla matrice nucleare.

Modello della regolazione trascrizionale da parte delle MAR

Macchinario generale (basale) della trascrizione

Componenti:

RNA polimerasi II (12 subunità) sintetizza RNA in 5’ 3’ ed esegue correzione delle bozze del trascritto nascente;

Fattori generali di trascrizione 5 fattori, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF e TFIIH, sono responsabili del riconoscimento del promotore e dell’apertura della doppia elica del DNA;

Mediatore complesso di 20 subunità; trasduce informazioni regolatrici da attivatori e repressori alla RNA pol II.

I fattori di trascrizione

La regolazione dell’attività trascrizionale dei geni avviene mediante cambiamenti della quantità o dell’attività dei fattori di trascrizione.

Questi fattori influenzano la velocità di trascrizione dei geni “target” positivamente o negativamente tramite interazioni specifiche con gli elementi regolatori del DNA e tramite interazioni con altre proteine.

Meccanismi di regolazione della quantità e dell’attività dei fattori di trascrizione

Meccanismi con cui agiscono fattori di trascrizione attivatori per aumentare l’attività trascrizionale

1) Stimolazione del reclutamento e del legame dei fattori generali di trascrizione e della RNA pol II sul nucleo del promotore per formare un complesso di preinizio.

2) Induzione di un cambiamento conformazionale od di una modificazione post-traduzionale che stimola l’attività enzimatica del macchinario generale di trascrizione.

3)Interazione con i complessi di rimodellamento e di modificazione della cromatina per permettere una migliore accessibilità dei fattori generali di trascrizione o di attivatori specifici al DNA.

Domini modulari dei fattori di trascrizione

Fattori di trascrizione: motivi del dominio che lega il DNA

Motivo elica-giro-elica (HTH) (es. repressore del trp, proteina CAP, repressore lac, ecc.) l’omeodominio (60 amminoacidi) è una variante del motivo HTH classico che è presente in molti fattori di trascrizione che regolano lo sviluppo (anche nei mammiferi).

Fattori di trascrizione: motivi del dominio che lega il DNA

L’omeodominio: un -elica contatta il solco maggiore del DNA riconoscendo una sequenza di 6 pb (come nel HTH), mentre un braccio flessibile interagisce specificamente con il solco minore del DNA.

Fattori di trascrizione: motivi del dominio che lega il DNA

Motivo a dita di zinco: deriva il nome dallo schema della sua struttura un atomo di Zn coordina dei residui di cisteine e di istidine, formando un ansa che ricorda la forma di un dito. Struttura diffusa in molte famiglie di attivatori trascrizionali (es. fattore Sp1, recettori degli ormoni steroidei).

Motivo a dita di Zn Dominio a dito di Zn del recettore dei glucocorticoidi (GR)

Fattori di trascrizione: motivi del dominio che lega il DNA

Domini a cerniera lampo (leucine zipper): due lunghe strutture ad -elica che contengono, contemporaneamente, il dominio di dimerizzazione ed il dominio di legame al DNA. Queste strutture possono formare sia omodimeri che eterodimeri.

Domini a cerniera di leucina

Questo motivo è stato descritto per la prima volta nella proteina C/EBP che lega CAAT box presente in molti enhancer.

Appartiene a questo gruppo di attivatori la proteina AP-1, un eterodimero formato dall’unione di due protooncogeni c-Jun e c-Fos, che regola l’espressione genica in risposta a vari stimoli, quali, stress, infezioni virali e batteriche, e l’attivazione da parte delle citochine.

Domini elica-ansa-elica basico (BHLH)

E’ una struttura caratterizzata da due -eliche connesse da un ansa. I fattori con questo motivo sono in genere eterodimeri, formati da un’elica più lunga che lega il DNA attraverso amminoacidi basici.

Appartengono a questa famiglia molti attivatori che hanno un ruolo nello sviluppo, come Myo-D che svolge una funzione fondamentale nel differenziamento delle cellule muscolari. Un altro esempio è la proteina c-Myc, che è coinvolta nella trasformazione tumorale (linfoma di Burkitt).

Controllo combinatoriale della trascrizione

Gli attivatori e gli inibitori sono coinvolti nella regolazione di numerosi geni.

E’ la combinazione tra diversi attivatori ed inibitori che rende molto specifico il meccanismo di regolazione.

Sequenze di importazione ed esportazione nucleare

Il traffico fra nucleo e citoplasma avviene attraverso i complessi dei posi nucleari (NPC).

I fattori di trascrizione, sintetizzati nel citoplasma, devono attraversare questi pori per giungere nel nucleo.

Le proteine sono indirizzate al nucleo da una sequenza amminoacidica specifica chiamata sequenza di localizzazione nucleare (NLS); ne esistono diverse, ma le più studiate sono le sequenze ricche di a.a basici (Arg e Lys).

Per l’uscita dal nucleo, le proteine devono anche avere una sequenza di esportazione nucleare (NES); le meglio caratterizzate sono le piccole sequenze idrofobiche ricche di Leu.

Per il passaggio attraverso i pori le proteine con sequenze di localizzazione e/o esportazione, si avvalgono di una famiglia di recettori solubili, importine od esportine (carioferine).

Importazione nucleare regolata

I recettori degli ormoni steroidei

Importazione nucleare regolata di NF-B

Risposta all’cAMP e fattore CREB

P-CREB si lega a siti sul DNA chiamati CRE (cAMP Response Element). CREB è strettamente correlato, sia per struttura che per funzione, a CREM (cAMP Response Element Modulator) ed a ATF-1 (Activating Transcription Factor-1).