Modulo di Biologia Molecolare

Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia

Canale A-K

Anno Accademico 2013/2014

Docente:

Prof.ssa Maria R. Mazzoni

Testi consigliati

Fondamenti di Biologia Molecolare. L.A. Allison, Zanichelli.

Genetica Molecolare Umana. T. Strachan e A. Read,

Zanichelli.

Biologia Molecolare. B. Amaldi et al., Editrice Ambrosiana.

Il Gene X. B. Lewin et al., Zanichelli.

Introduzione alla Genomica. A. M. Lesk, Zanichelli.

Lessenziale di Biologia Molecolare della Cellula. B. Alberts

et al., Zanichelli.

La biologia molecolare una scienza di base nata

dalla convergenza di biologia, chimica e fisica, che

possiede intensa consapevolezza pratica e

commerciale.

La biologia molecolare lo studio di come il DNA,

lRNA e le proteine sono intercorrelate (D.

Baltimore, Nobel Lectures in Molecular Biology).

Cronistoria della genetica e della biologia molecolare

Un gene codifica un RNA che pu codificare una

proteina

Tre linee di ricerca hanno

portato alla scoperta che il

DNA il materiale ereditario

Legge della combinazione di caratteri diversi

(Mendel, 1866)

Il principio trasformante (Griffith, 1928)

Il DNA il materiale genetico dei batteri e dei virus

Lipotesi un gene-un enzima (Beadle e Tantum, 1941)

Il DNA il materiale genetico dei batteri e dei virus

La trasformazione batterica ha fornito

la prima evidenza del fatto che il

DNA il materiale genetico dei

batteri.

Le propriet genetiche possono essere

trasferite da un ceppo batterico ad un

altro estraendo il DNA dal primo

ceppo e somministrandolo al secondo

(Avery, MacLeod, e McCarty

1944).

Il DNA il materiale genetico del batteriofago T2

Il DNA il materiale genetico dei batteri e dei virus

Linfezione fagica (fago T2) ha dimostrato

che il DNA il materiale genetico dei virus.

Se il DNA e le proteine del batteriofago

sono marcati con isotopi radioattivi diversi,

solamente il DNA trasmesso alla progenie

fagica prodotta infettando i batteri (Hershey,

e Chase 1952).

Il DNA il materiale genetico della cellula eucariotica

Le cellule eucariotiche possono

acquisire un nuovo fenotipo in seguito

alla trasfezione con DNA..

Il DNA costituisce il materiale

genetico di tutte le cellule e di

molti virus. Fanno eccezione

alcuni virus che usano come

materiale genetico lRNA.

Fotografia di diffrazione ai raggi X del DNA (Wilkins e Franklin,

1952-53)

Modello della struttura del DNA (Watson e Crick, 1953)

Le catene polinucleotidiche hanno basi azotate unite ad

uno scheletro di zuccheri e fosfati

Struttura generale dei nucleotidi

Struttura chimica dello zucchero -

pentoso

Struttura chimica

delle basi azotate

Formazione delle catene degli acidi nucleici

Struttura secondaria del DNA - fra le basi si formano legami a

idrogeno

Il DNA una doppia elica

Modello della doppia

elica del DNA (Watson

e Crick, 1953).

Impilamento delle basi stabilit chimica della doppia elica

Il DNA una doppia elica

Il DNA una doppia elica

Il DNA nella conformazione B una doppia elica formata da

due catene polinucleotidiche che corrono antiparallele.

Le basi azotate di ciascuna catena sono anelli piatti purinici o

pirimidinici rivolti verso linterno ed appaiati tra di loro per

mezzo di legami idrogeno che portano solamente alla

formazione delle coppie A-T o G-C.

La doppia elica ha un diametro di ~ 20 (2 nm) e forma un

giro completo ogni 34 (3,4 nm), con dieci coppe di basi per

giro delica.

La doppia elica ha un solco maggiore (22 di diametro) ed

uno minore (12 di diametro).

Il DNA una doppia elica

DNA a doppia elica:

forma B (idratata) > elica destrorsa;

forma A (disidratata) > elica destrorsa,

ma pi corta e spessa della forma B;

forma Z > elica sinistrorsa e pi lunga e

stretta della forma B.

Strutture alternative a doppia elica del DNA

Denaturazione, rinaturazione ed ibridizzazione del DNA a doppio

filamento

Curva di denaturazione del DNA

Dependenza della denaturazione del DNA dal contenuto di G-C e

dalla concentrazione salina

Strutture secondarie insolite del DNA

Struttura terziaria del DNA - superavvolgimento del DNA

Il DNA superavvolto

Il DNA superavvolto

Il superavvolgimento si forma solo in molecole di DNA

chiuse senza estremit libere.

Il DNA chiuso dato da molecole circolari (cellule

procariotiche) o da molecole lineari (cellule eucariotiche) in

cui le estremit sono bloccate per interazioni con proteine cos

da non poter ruotare liberamente.

Una molecola di DNA chiusa ha proprio numero di legame

(L), che dato dalla somma del numero di giri completi o twist

(T) e di superavvolgimento writhe (W).

Si pu cambiare il numero di legame solamente rompendo e

riformando dei legami nellossatura del DNA.

Replicazione del DNA

Lappaiamento delle basi fornisce

il meccanismo per la replicazione

del DNA

La replicazione del DNA semiconservativa (Meselson e Stahl,

1958

Replicazione del DNA

Replicazione del DNA batterico

La forcella di replicazione

La sintesi di DNA

avviene da 5 a 3

La replicazione del DNA semidiscontinua

Replicazione degli Ac. Nucleici a doppio e singolo filamento

La replicazione del DNA eseguita da un complesso di enzimi e proteine che separano i filamenti parentali e sintetizzano i filamenti figli.

La forcella di replicazione il punto in cui i filamenti parentali vengono separati.

Gli enzimi che sintetizzano il DNA si chiamano DNA polimerasi; catalizzano la sintesi del nuovo filamento solo in direzione 5 3 e necessitano di un innesco di RNA (20 nucleotidi) (primer) per poter iniziare la sintesi.

Le nucleasi sono enzimi che degradano gli acidi nucleici, comprendono le DNasi e le RNasi e possono essere suddivise in endonucleasi ed esonucleasi. Le prime tagliano i legami fosfodiestere allinterno della catena nucleotidica, mentre le seconde rimuovono un nucleotide alla volta a partire dallestremit, tagliando il legame fosfodiestere.

Endonucleasi ed esonucleasi

Dogma centrale della biologia molecolare

Linformazione genetica pu essere contenuta nel DNA o

nellRNA

I geni cellulari sono costituiti da DNA, ma i genomi virali possono essere costituiti da RNA.

Il DNA convertito in RNA dalla trascrizione mentre la trascrizione inversa pu convertire lRNA in DNA.

La traduzione dellRNA in proteine unidirezionale.

Confronto fra vari genomi

Appaiamento delle basi nel DNA a doppio filamento e nellRNA

Landmarks in molecular biology and biotechnology

1869- Friedrich Miescher discovered DNA.

1941- Beadle and Tatum demonstrated that a gene codes for a single

protein and one gene one protein theory was put forward.

1944- Avery, McLeod and McCarty showed that DNA is the genetic

material.

1951- The helical conformation of a chain of aminoacids was proposed

and the -helix and -sheet structures in proteins were deciphered.

1952- Hershey and Chase proved that DNA is the carrier of genetic

information.

1953- Watson and Crick gave the double helical structure of DNA.

1955- Method for determination of amino acid sequence of a protein

was developed by Frederick Sanger and the sequence of insulin was

determined.

Landmarks in molecular biology and biotechnology

1957- Arthur Kornburg discovered the DNA polymerase I.

1958- Meselson and Stahl showed that DNA replicates in a semi-

conservative manner.

1960- The detailed 3-D structure of proteins was described to very high

resolution.

1960- Polycistronic genes in bacteria were discovered. The one gene one

protein theory became obsolete.

1961- The triplet nature of codons was discovered and the genetic code was

deciphered by Marshal Nirenberg and H.G. Khurana.

1961- Messenger RNA was discovered.

1961- Jacob and Monad proposed the `operon model for regulation of gene

expression.

1963- The circular nature of bacterial DNA was discovered by John Cairns.

1967- Enzyme DNA ligase was discovered by Gilbert.

Landmarks in molecular biology and biotechnology

1970- Temin and Baltimore reported the discovery of reverse

transcriptase in retrovirus.

1973- Type II restriction endonucleases were discovered.

1974- Eukaryotic genes were cloned in bacterial plasmids.

1975- The signal hypothesis was proposed by Gunter Blobel.

1976- Retroviral oncogenes were