Modulo di Biologia Molecolare - omero.farm.unipi. · PDF fileacquisire un nuovo fenotipo in...

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  • Modulo di Biologia Molecolare

    Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia

    Canale A-K

    Anno Accademico 2013/2014

    Docente:

    Prof.ssa Maria R. Mazzoni

  • Testi consigliati

    Fondamenti di Biologia Molecolare. L.A. Allison, Zanichelli.

    Genetica Molecolare Umana. T. Strachan e A. Read,

    Zanichelli.

    Biologia Molecolare. B. Amaldi et al., Editrice Ambrosiana.

    Il Gene X. B. Lewin et al., Zanichelli.

    Introduzione alla Genomica. A. M. Lesk, Zanichelli.

    Lessenziale di Biologia Molecolare della Cellula. B. Alberts

    et al., Zanichelli.

  • La biologia molecolare una scienza di base nata

    dalla convergenza di biologia, chimica e fisica, che

    possiede intensa consapevolezza pratica e

    commerciale.

    La biologia molecolare lo studio di come il DNA,

    lRNA e le proteine sono intercorrelate (D.

    Baltimore, Nobel Lectures in Molecular Biology).

  • Cronistoria della genetica e della biologia molecolare

  • Un gene codifica un RNA che pu codificare una

    proteina

  • Tre linee di ricerca hanno

    portato alla scoperta che il

    DNA il materiale ereditario

  • Legge della combinazione di caratteri diversi

    (Mendel, 1866)

  • Il principio trasformante (Griffith, 1928)

  • Il DNA il materiale genetico dei batteri e dei virus

  • Lipotesi un gene-un enzima (Beadle e Tantum, 1941)

  • Il DNA il materiale genetico dei batteri e dei virus

    La trasformazione batterica ha fornito

    la prima evidenza del fatto che il

    DNA il materiale genetico dei

    batteri.

    Le propriet genetiche possono essere

    trasferite da un ceppo batterico ad un

    altro estraendo il DNA dal primo

    ceppo e somministrandolo al secondo

    (Avery, MacLeod, e McCarty

    1944).

  • Il DNA il materiale genetico del batteriofago T2

  • Il DNA il materiale genetico dei batteri e dei virus

    Linfezione fagica (fago T2) ha dimostrato

    che il DNA il materiale genetico dei virus.

    Se il DNA e le proteine del batteriofago

    sono marcati con isotopi radioattivi diversi,

    solamente il DNA trasmesso alla progenie

    fagica prodotta infettando i batteri (Hershey,

    e Chase 1952).

  • Il DNA il materiale genetico della cellula eucariotica

    Le cellule eucariotiche possono

    acquisire un nuovo fenotipo in seguito

    alla trasfezione con DNA..

    Il DNA costituisce il materiale

    genetico di tutte le cellule e di

    molti virus. Fanno eccezione

    alcuni virus che usano come

    materiale genetico lRNA.

  • Fotografia di diffrazione ai raggi X del DNA (Wilkins e Franklin,

    1952-53)

  • Modello della struttura del DNA (Watson e Crick, 1953)

  • Le catene polinucleotidiche hanno basi azotate unite ad

    uno scheletro di zuccheri e fosfati

  • Struttura generale dei nucleotidi

    Struttura chimica dello zucchero -

    pentoso

  • Struttura chimica

    delle basi azotate

  • Formazione delle catene degli acidi nucleici

  • Struttura secondaria del DNA - fra le basi si formano legami a

    idrogeno

  • Il DNA una doppia elica

    Modello della doppia

    elica del DNA (Watson

    e Crick, 1953).

  • Impilamento delle basi stabilit chimica della doppia elica

  • Il DNA una doppia elica

  • Il DNA una doppia elica

    Il DNA nella conformazione B una doppia elica formata da

    due catene polinucleotidiche che corrono antiparallele.

    Le basi azotate di ciascuna catena sono anelli piatti purinici o

    pirimidinici rivolti verso linterno ed appaiati tra di loro per

    mezzo di legami idrogeno che portano solamente alla

    formazione delle coppie A-T o G-C.

    La doppia elica ha un diametro di ~ 20 (2 nm) e forma un

    giro completo ogni 34 (3,4 nm), con dieci coppe di basi per

    giro delica.

    La doppia elica ha un solco maggiore (22 di diametro) ed

    uno minore (12 di diametro).

  • Il DNA una doppia elica

    DNA a doppia elica:

    forma B (idratata) > elica destrorsa;

    forma A (disidratata) > elica destrorsa,

    ma pi corta e spessa della forma B;

    forma Z > elica sinistrorsa e pi lunga e

    stretta della forma B.

  • Strutture alternative a doppia elica del DNA

  • Denaturazione, rinaturazione ed ibridizzazione del DNA a doppio

    filamento

  • Curva di denaturazione del DNA

  • Dependenza della denaturazione del DNA dal contenuto di G-C e

    dalla concentrazione salina

  • Strutture secondarie insolite del DNA

  • Struttura terziaria del DNA - superavvolgimento del DNA

  • Il DNA superavvolto

  • Il DNA superavvolto

    Il superavvolgimento si forma solo in molecole di DNA

    chiuse senza estremit libere.

    Il DNA chiuso dato da molecole circolari (cellule

    procariotiche) o da molecole lineari (cellule eucariotiche) in

    cui le estremit sono bloccate per interazioni con proteine cos

    da non poter ruotare liberamente.

    Una molecola di DNA chiusa ha proprio numero di legame

    (L), che dato dalla somma del numero di giri completi o twist

    (T) e di superavvolgimento writhe (W).

    Si pu cambiare il numero di legame solamente rompendo e

    riformando dei legami nellossatura del DNA.

  • Replicazione del DNA

    Lappaiamento delle basi fornisce

    il meccanismo per la replicazione

    del DNA

  • La replicazione del DNA semiconservativa (Meselson e Stahl,

    1958

  • Replicazione del DNA

  • Replicazione del DNA batterico

  • La forcella di replicazione

  • La sintesi di DNA

    avviene da 5 a 3

  • La replicazione del DNA semidiscontinua

  • Replicazione degli Ac. Nucleici a doppio e singolo filamento

  • La replicazione del DNA eseguita da un complesso di enzimi e proteine che separano i filamenti parentali e sintetizzano i filamenti figli.

    La forcella di replicazione il punto in cui i filamenti parentali vengono separati.

    Gli enzimi che sintetizzano il DNA si chiamano DNA polimerasi; catalizzano la sintesi del nuovo filamento solo in direzione 5 3 e necessitano di un innesco di RNA (20 nucleotidi) (primer) per poter iniziare la sintesi.

    Le nucleasi sono enzimi che degradano gli acidi nucleici, comprendono le DNasi e le RNasi e possono essere suddivise in endonucleasi ed esonucleasi. Le prime tagliano i legami fosfodiestere allinterno della catena nucleotidica, mentre le seconde rimuovono un nucleotide alla volta a partire dallestremit, tagliando il legame fosfodiestere.

  • Endonucleasi ed esonucleasi

  • Dogma centrale della biologia molecolare

  • Linformazione genetica pu essere contenuta nel DNA o

    nellRNA

    I geni cellulari sono costituiti da DNA, ma i genomi virali possono essere costituiti da RNA.

    Il DNA convertito in RNA dalla trascrizione mentre la trascrizione inversa pu convertire lRNA in DNA.

    La traduzione dellRNA in proteine unidirezionale.

  • Confronto fra vari genomi

  • Appaiamento delle basi nel DNA a doppio filamento e nellRNA

  • Landmarks in molecular biology and biotechnology

    1869- Friedrich Miescher discovered DNA.

    1941- Beadle and Tatum demonstrated that a gene codes for a single

    protein and one gene one protein theory was put forward.

    1944- Avery, McLeod and McCarty showed that DNA is the genetic

    material.

    1951- The helical conformation of a chain of aminoacids was proposed

    and the -helix and -sheet structures in proteins were deciphered.

    1952- Hershey and Chase proved that DNA is the carrier of genetic

    information.

    1953- Watson and Crick gave the double helical structure of DNA.

    1955- Method for determination of amino acid sequence of a protein

    was developed by Frederick Sanger and the sequence of insulin was

    determined.

  • Landmarks in molecular biology and biotechnology

    1957- Arthur Kornburg discovered the DNA polymerase I.

    1958- Meselson and Stahl showed that DNA replicates in a semi-

    conservative manner.

    1960- The detailed 3-D structure of proteins was described to very high

    resolution.

    1960- Polycistronic genes in bacteria were discovered. The one gene one

    protein theory became obsolete.

    1961- The triplet nature of codons was discovered and the genetic code was

    deciphered by Marshal Nirenberg and H.G. Khurana.

    1961- Messenger RNA was discovered.

    1961- Jacob and Monad proposed the `operon model for regulation of gene

    expression.

    1963- The circular nature of bacterial DNA was discovered by John Cairns.

    1967- Enzyme DNA ligase was discovered by Gilbert.

  • Landmarks in molecular biology and biotechnology

    1970- Temin and Baltimore reported the discovery of reverse

    transcriptase in retrovirus.

    1973- Type II restriction endonucleases were discovered.

    1974- Eukaryotic genes were cloned in bacterial plasmids.

    1975- The signal hypothesis was proposed by Gunter Blobel.

    1976- Retroviral oncogenes were