Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale...

Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale

FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI

CORSO DI LAUREA IN FISICA

Anno Accademico 2013/14

Relatore: Prof. Tullio ScopignoCorrelatore: Dott.ssa Abigail Nunn

Candidato: Saltarelli Francesco

Roma, 26 Settembre 2014


Introduzione

Attraverso degli script in ambiente Matlab andremo ad analizzare la disposizione di tali goccioline seguendo le fasi indicate:

1. Acquisizione

2. Processing

• Threshold e Watershed

• Identificazione delle gocce in 3D

3. Calcolo funzione di distribuzione radiale

• Problema PBC

• Test su simulazione LJ

• Correzione /

4. Applicazione a immagini acquisite

Negli epatociti vi può essere un accumulo anomalo di lipidi sotto forma di goccioline:• dovuto a patologie (steatosi

epatica, cancro)• indotto esternamente (acido oleico,

entinostat)

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Healthy liver Fatty liver


Diffusione a singolo fotone da parte di una molecola:• Elastica → Rayleigh• Anelastica → Raman

Diffusione a più fotoni:• CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering):

Nei lipidi si sfrutta la riga vibrazionale di stretching del legame a:

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FASI DELL’ANALISI:

1. Acquisizione

2. Processing• Threshold e Watershed• Identificazione delle

gocce in 3D


• Problema PBC• Test su simulazione LJ• Correzione /



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Schema microscopio invertito CARSFASI DELL’ANALISI:

1. Acquisizione


gocce in 3D





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Stack di immagini associato ad una cellula(trattamento: acido oleico + entinostat)


1. Acquisizione


gocce in 3D





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Nella fase di processing otteniamo dallo stack di immagini acquisite al microscopio posizione e area di ogni goccia per ogni layer

Threshold: si fissano due soglie, i pixel con un'intensità al loro interno rappresentano il segnale, gli altri lo sfondo nero

Watershed: divide le gocce rimaste unite cercando il loro centro e dilatandolo finche’ incontra un’altra goccia o raggiunge il limite della goccia stessa a cui il centro appartiene


1. Acquisizione


gocce in 3D





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Algoritmo interno Fiji: si fissa una soglia di threshold uguale per l’intero stack e poi si esegue il watershed

3D Iterative Thresholding plugin: sceglie una soglia di threshold diversa per ogni goccia seguendola sull’intero stack di immagini e tiene quella che massimizza il volume


1. Acquisizione


gocce in 3D




Il plugin esterno ha prestazioni migliori in termini di capacità di distinguere le gocce e stimarne le dimensioni


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Inseguimento di una goccia:Dato un certo layer e su di esso una goccia si va a calcolare per ogni goccia sul layer seguente più interno la quantità:

Le gocce e sono identificate come la stessa su layer diversi se:


1. Acquisizione


gocce in 3D





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Mappa delle gocce di lipidi in una cellulaFASI DELL’ANALISI:

1. Acquisizione


gocce in 3D





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La funzione di distribuzione radiale in un sistema di particelle, descrive come varia la densità in funzione della distanza da una particella presa come riferimento


1. Acquisizione


gocce in 3D




→ con distanza fra i centri delle particelle

→ con distanza fra i bordi delle particelle


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Nel caso di volume finito possiamo:

• tenere conto del volume effettivo in cui cerchiamo vicini per le particelle al bordo;

• introdurre PBC (minimum image convention)

Ciò non è applicabile al caso delle cellule dove il bordo non è ben definito


1. Acquisizione


gocce in 3D





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per particelle puntiformi uniformemente distribuite:• con PBC → costante al valore 1• senza PBC → decadimento anomalo, previsto

analiticamente tenendo presente l’area effettiva dove vengono cercati vicini per le particelle al bordo


1. Acquisizione


gocce in 3D




𝑔𝑢𝑛𝑖𝑓2𝐷 (𝑟 )= 1

𝑙𝑥⋅𝑙 𝑦⋅¿


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Per particelle che evolvono in un certo volume potremo correggere la ottenuta senza PBC detta , calcolando la ossia la per particelle puntiformi disposte uniformemente nello stesso volume:


1. Acquisizione


gocce in 3D





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Nel caso delle cellule resta il problema di definire un’area effettiva, ossia una zona dove la distanza fra le gocce è paragonabile alle dimensioni stesse di queste ultime; lo facciamo dividendo l’immagine in rettangolini e stabilendo una densità di soglia


1. Acquisizione


gocce in 3D





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calcolata in 2DFASI DELL’ANALISI:

1. Acquisizione


gocce in 3D





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1. Acquisizione


gocce in 3D





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1. Acquisizione


gocce in 3D





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1. Acquisizione


gocce in 3D





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1. Acquisizione


gocce in 3D




Cellula trattata con acido oleico e entinostat


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1. Acquisizione


gocce in 3D




Cellula trattata con acido oleico


Prospettive future

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La funzione di distribuzione radiale ha delle caratteristiche peculiari che rispecchiano aspetti osservabili qualitativamente nelle immagini come:• presenza di picchi → ordine nella disposizione delle gocce• posizione dei picchi → disposizione più o meno compatta delle gocce• larghezza dei picchi → diversità nelle dimensioni delle gocce

L’idea, a lungo termine, è quella di costruire una banca dati con tali informazioni e confrontare la risposta delle cellule a diversi trattamenti, al fine di avere più chiaro il loro effetto

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