Studio biochimico dell’attivazione dei recettori

Le molecole segnale idrofiliche non possono superare il doppio

strato lipidico della membrana cellulare. Il sito recettoriale

delle molecole idrosolubili è situato sulla parte

extracellulare di recettori transmembrana.

Molecole segnale lipofiliche attraversano facilmente la

membrana cellulare: i loro recettori sono quindi localizzati

all'interno della cellula.

Differenti tipi di recettori

- Legati a canali ionici

- Legati alla proteina G

- Recettori steroidei

- Recettori legati ad enzimi

Recettori legati a canali ionici con effetto di tipo:

eccitatorio acetilcolina, glutammato, serotonina(apertura dei canali Na+ con

conseguente depolarizzazione)

inibitorio Gaba, glicina(apertura dei canali Cl- con

conseguente iperpoplarizzazione)

Recettori steroidei

Gli steroidi sono molecole

con elevata lipofilia, in

grado di attraversare le

membrane plasmatiche e

a livello nucleare

legandosi a recettori

specifici (DNA-binding

protein) regolano la

trascrizione di un gene

adiacente al legame

Quando attivati funzionano direttamente come enzimi (RTK) o sono associati ad enzimi (PTK)

Recettori legati ad enzimi

Il ligando endogeno (1) lega specificamente il recettore (2). Viene attivato il sistema G-protein (3). Viene attivato l’adenilato ciclasi (4) che produce il secondo messaggero cAMP (5) a partire dall’ATP (6). Avvengono una serie di reazioni enzimatiche (7) e via fosforilazione (8) il glicogeno (9) viene trasformato in glucosio (10). La fosforilazione può interessare proteine di membrana come canali ionici (11).

Recettori legati alla G-protein

Attivazione della Proteine G

La G-protein è composta da tre subunità legata quando non attivata al GDP

L’interazione ligando recettore attiva la G-protein liberando GDP...

..legando GTP. Il trimero si suddivideIl GTP legato ad viene idrolizzato a GDP+ P. Le subunità si ricombinano.

Gq

R

GTP

GDP

+ -

GTP GDP

Gi RAC

ATP cAMP

R Gs

GTP GDP

PK-A+

Ca++ RS

+Ca++

Ca++

PL-C

PIP2 IP3 +

DAG PK-C+

Sfruttando il meccanismo di attivazione illustrato si può

determinare l’attività agonista, agonista inverso, agonista

parziale, antagonista.

Utilizzando GTPS35, analogo non idrolizzabile del GTP, si può

misurare l’attività di un ligando in base all’accumulo di

GTPS35.

Nel caso in cui il composto sia antagonista è necessario

realizzare la curva di attività in presenza di un agonista pieno e

verificare lo spostamento parallelo a destra a dosi crescenti di

antagonista.

CH2O P O P O P

O O 35S

OH

OHOHOHO

N

N N

N

O

H

NH2

OHOH

10 -11 10 -10 10 -9 10 -8 10 -7 10 -6 10 -5

0

50

100Agonista pieno

Agonista parziale

Agonista inverso

log dose

Bo

un

d

(GT

P

S35

)

cAMP

La reazione è basata sulla competizione per l’anti-anticorpo tra

cAMP legato alla fosfatasi alcalina e quello libero proveniente

dalla stimolazione recettoriale

Dosaggio del secondo messaggero

APAP

AP

AP+ S

S

S

S

cAMP coniugato alla fosfatasi alcalina

Anticorpo primario legato al pozzetto

cAMP indotto dall’attivazione

recettoriale

del ligando

Anticorpo secondario

La quantità di cAMP cellulare è inversamente proporzionale

alla quantità di colorazione gialla svolta.

AP

Attivazione di PK-A

Glucagone

Recettore

G-Protein(, , , subunità)

PK-A inattivaPK-A

Adenilato ciclasi(inattivo)

G-Protein (, subunità)

Fosforilazione di substrati

Substrato PK-A-R110 (bisammide Rhodamina 110 peptide)

PK-A R110non fluorescente

PK-A

PK-A R110fluorescente

PK-A R110non fluorescente fosforilato

proteasi proteasi

non fluorescente

Eccitazione 485 nm Emissione 530 nM

% peptide fosforilato

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

FLU

100,000

50,000

0

L’intensità di fluorescenza misurata nel saggio è inversamente correlata all’attività della PK-A

Dosaggio del Ca++ intracellulare

IP2

DAGIP3

Calmodulina-proteina Kinasi (inattivoa)

Calmodulina-proteina Kinasi

Proteina kinasi C

Proteina kinasi C inattiva

Gq-

REL

Saggio dell’Aequorina

L’Aequorina è una fotoproteina riscontrata nella medusa

Aequorea Victoria.

L’apoaequorina è una proteina di 21 KDalton e necessita di un

gruppo prostetico idrofobico coeletranzina per essere convertita

nella forma enzimatica attiva: aequorina.

Dosaggio del Ca++

In presenza di Ca++ aequorina ossida la coeletranzina in

coelentramide con produzione di CO2, ed emissione di luce.

Questi saggi vengono effettuati in linee cellulari stabili in grado

di esprimere il GPCR ed apo-aequorina

Sistemi di modulazione del segnale

Oltre a sistemi di attivazione recettoriale e di amplificazione del segnale sono presenti meccanismi di interruzione del segnale

•Autoregolazione del rilascio del neurotrasmettitore (feedback negativo)

Questo meccanismo si realizza mediante recettori

presinaptici che possono essere controllati dallo stesso

neurotrasmettitore (autorecettori) o da un

neurotrasmettitotre differente (eterorecettori)

•Sistemi enzimatici preposti alla degradazione

•Sistemi di recupero del neurotrasmettitore

•Desensitizzazione recettoriale (in recettori accoppiati alla G-protein)

La desensitizzazione può essere:

• omologa (specifica per un recettore) oppure eterologa (non specifica);• rapida (~ 20 minuti) oppure lenta (giorni);• perdita funzione recettoriale (uncoupling) o con diminuzione dei recettori (down-regulation)

• Uncoupling del recettore (desensitizzazione rapida)

La fosforilazione non altera la capacità del recettore di attivare la G-protein ma aumenta l’affinità del recettore fosforilato per la proteina -arrestina che inibisce l’interazione del recettore con la G-protein determinando il disaccoppiamento).

• Uncoupling del recettore (desensitizzazione lenta)

Molti sistemi recettoriali sono fosforilati dai loro stessi enzimi effettori PKA e PKC

Questo tipo di fosforilazione è un feedback diretto negativo che al tempo stesso sopprime l’attivazione dell’enzima effettore PKA.

Questo meccanismo di desensitizzazione è eterologo in quanto l’attivazione di PKA PKC è sufficiente a determinare la fosoforilazione del recettore.

La desensitizzazione da PKA è più lenta ma è molto più sensibile alla concentrazione di agonista.

Saggi funzionali su organo isolato

In questi esperimenti in seguito ad uno stimolo (farmacologico o

elettrico) deve essere apprezzabile e misurabile una risposta in

un preparato biologico

variazioni del volume del preparato biologico che viene

valutato mediante semplici registratori a galleggiante

variazione di lunghezza o di tensione del preparato biologico

L’effetto che si dovrà valutare può essere rappresentato da:

variazioni di pressione

La stimolazione del preparato biologico può essere effettuata

Elettricamente

Farmacologicamente

In alcuni esperimenti può essere necessario stimolare

elettricamente il preparato. La forma e la durata degli impulsi

sono parametri importanti soprattutto in preparati

neuromuscolari.

Le concentrazioni di farmaco necessarie in questo tipo di

esperimento sono molto basse anche perché quando impiegati

a dosaggi elevati sono dotati di vari effetti ed è quindi

importante scegliere quelle concentrazioni alle quali agiscono

in modo specifico.

Esperimenti farmacologici

Qualitativi

Quantitativi

Studio del meccanismo di azioneQuantizzazione

dell’attività caratterizzata

Agonistiproducono effetti attivi o diretti sui preparati biologici

Antagonisti

producono effetti negativi o indiretti e inibizione o alterazione

degli effetti degli agonisti

Curva dose-risposta di un agonista pieno

Eff

ett

o m

ass

imo

pe

rce

ntu

ale

Log dose

Effetto massimo

In rosso la curva dose-risposta dell’agonista.

In nero le curve dose risposta dell’antagonista in presenza

di dosi crescenti di antagonista.

dose dose

carbacolo 1 M carbacolo 1 M in presenza di 0.1 M di atropina

Risposta dell’ileo di cavia ad una dose di carbacolo

Impulso elettrico Contrazione

Attività pre- post- giunzionale

Agonista pre-

Un agonista pre- è in grado di ridurre il rilascio di mediatore chimico successivo alla stimolazione elettrica.Es: 8-OH-DPAT sui recettori serotoninergici 5-HT1A nella vescica

o ileo di cavia

Agonista post-

Un agonista post è in grado di attivare autonomamente l’effetto biologico

Es: carbacolo su recettori muscarinici nell’ ileo di cavia