Analisi microbiologica dei campioni Il numero delle cellule microbiche nel suolo può essere...

Analisi microbiologica dei campioniIl numero delle cellule microbiche nel

suolo può essere determinato:

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Sospensione di terreno

1

2

3

4

5

6

7

8

10-1

10-2

10-8

10-6

10-3

10-4

10-5

10-7

Conte dirette al microscopio ottico o all’epifluorescenza o elettronico a scansione

Metodo delle diluizioni di sospensioni di suolo

Tecnica del vetrino interratoSe la superficie del vetrino è pulita, non è selettiva, e agisce come le particelle minerali del suolo

Valori in difetto

Valori in eccesso

Metodi di rilevamento

44. . Ecologia delle popolazioni microbiche Ecologia delle popolazioni microbiche

del suolodel suolo

1

Il numero dei batteri calcolato con metodi colturali è di circa 106-108 batteri per grammo di terra secca, mentre quello ottenuto per microscopia diretta è di circa 10-100 volte superiore.

Colorazioni vitaliPermettono di distinguere le cellule ancora in grado di respirare da quelle

che non metabolizzano più.

Conte diretteI valori sono approssimati per eccesso in quanto vengono calcolate anche le cellule morte

2

http://www.microbes-edu.org/qcm/I/I01.jpg

Hemolysis

5

Subito dopo l’inoculo si depongono sulla superficie della piastra una serie di dischetti di carta assorbente sterili imbevuti di adatte concentrazioni degli antibiotici che si desidera testare.

• Si divide la piastra in spicchi, uno per ciascun antibiotico, e si deposita al centro di ogni spicchio il dischetto corrispondente, con l’aiuto di una pinzetta sterile.•Si pongono le piastre in incubatore a 37°C per 18-24 ore. •Si misura il diametro degli aloni di inibizione per ogni antibiotico.

6

Sospensione e serie delle diluizioni

c) Sterilizzare alcune provette vuote da 22mm per le diluizioni

a) Preparare 500 ml di soluzione fisiologica (NaCl 9‰ in

H2O

deionizzata). Distribuire come al punto b e versare il rimanente in una beuta da 1000 ml, sterilizzare

b) Preparare una beuta da 250 ml con 95 ml di soluzione fisiologica, alla quale si aggiungano circa 100 palline di vetro, sterilizzare

1) Preparazione del materiale

7

a) Prelevare 5 grammi dal campione mediato e metterli nella beuta sterile contenente la soluzione fisiologica e le palline di vetro. In questo modo si ottiene la diluizione 10-1

2) Sospensione del campione e diluizioni seriali

b) Mettere la beuta ad agitare per 15 minuti

d) Fare le diluizioni: prelevare 1 ml di soluzione dalla beuta di partenza (diluizione10-1) e metterlo in una provetta contenente 9 ml di soluzione fisiologica; procedere in successione fino ad ottenere la diluizione 10-6

1 ml 1 ml

9 ml

Diluizioni seriali

c) Distribuire sterilmente 9 ml di soluzione fisiologica in 5 provette sterili

9 ml

8

3) Conta su piastra

d) Incubare a 28°C per circa una settimana; procedere con la conta delle colonie cresciute sulle piastre inoculate e registrare i dati raccolti per la successiva elaborazione

a) Per i funghi, dalle diluizioni 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 prelevare sterilmente 0,1 ml, versarlo sulla piastra e spargere la coltura con un'ansa sterileb) Per i batteri, procedere allo stesso modo ma considerare le diluizioni 10-3, 10-4, 10-5; 10-6

c) Inoculare 3 piastre per ciascuna diluizione, sia per la conta dei funghi che per la conta dei batteri

N.B. Ricordarsi di indicare su ciascuna piastra il tipo di terreno utilizzato specifico per batteri o funghi, il campione, la diluizione e la data.

Aggiungere una o due piastre di controllo per ciascun terreno, inoculate con soluzione fisiologica sterile

9

Dosaggio di proteine in una coltura batterica Lowry et al. (1951)

Preparazione del materiale Soluzioni

NaOH 1 N

NaOH 0,1 N

Na2CO3 2% in NaOH 0,1 N

CuSO4•5H2O 1% in H2O distillata

Tartrato di sodio 2% in H2O

distillata

o potassio

Prima di procedere al dosaggio delle proteine

in una coltura batterica è necessario

disegnare su carta millimetrata la curva di

taratura utilizzando una soluzione a

concentrazione nota di Albumina

Assorb

an

za

g/ml proteine

5.5. Ciclo Ciclo

dell’azotodell’azotoAnalisi di attività batteriche

10

Idrolizzare i campioni nel modo seguente:

centrifugare per 20 minuti a 10000 giri/min 3 ml di coltura batterica

risospendere il pellet in 3 ml di soluzione NaOH 1N

prelevare (in doppio) 1 ml della sospensione ottenuta e metterlo in una provetta di vetro; chiudere ciascuna provetta con carta d’alluminio

mettere le provette a bollire per 10 minuti

11

preparare la miscela di reazione nella quantità

necessaria, mescolando con le seguenti proporzioni le

soluzioni:

Na2CO3 10 ml

CuSO4 5 H2O 0,1 ml

Tartrato di sodio o potassio 0,1 ml

prelevare dalle provette del campione bollito 0,8 ml e metterli in

un’altra provetta

aggiungere 4 ml della miscela di reazione

lasciare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti

aggiungere 0,4 ml di reagente Folin e mettere le provette al buio per 30 minuti

Proseguire con il metodo di Lowry per la determinazione delle proteine:

12

valutare la quantità di proteine dei

campioni

dalla curva di taratura

N.B. La lettura del campione allo spettrofotometro deve essere fatta

contro un bianco (H2O) sottoposto alle stesse reazioni del campione

leggere l’assorbanza allo spettrofotometro ad una

lunghezza d’onda di 500 nm

Assorb

an

za

g/ml proteine

13

Controllo dello sviluppo microbico

• Per controllo dello sviluppo microbicocontrollo dello sviluppo microbico si possono intendere diverse cose: si può volere inibire e non uccidere i microrganismi, oppure si vuole eliminare totalmente la popolazione microbica su soggetti inanimati o su superfici viventi.

• Si usano diversi metodi e diverse terminologie ne indicano le finalità.

15


• Sterilizzazione:Sterilizzazione: è il processo in cui vengono distrutte o rimosse tutte le cellule viventi (includendo le spore, i virus e i viroidi) da un determinato habitat o da oggetti inanimati;

• Disinfezione:Disinfezione: uccisione o inibizione di soli microrganismi patogeni e disinfettanti sono gli agenti chimici che vengono usati nei processi di disinfezione;

• Sanificazione:Sanificazione: la carica microbica viene ridotta entro limiti considerati sicuri per gli standard di sanità pubblica;

16


• Antisepsi:Antisepsi: è la pratica in grado di prevenire una infezione e si dicono antisettici i composti chimici utilizzati;

• Antibiotici e chemioterapici:Antibiotici e chemioterapici: rientrano nelle categorie dei composti in grado di controllare lo sviluppo microbico.

17

Il modello di morte microbica• La distruzione di una popolazione microbica non

avviene istantaneamente con l’esposizione ad un agente letale.

• Dopo che la popolazione ha subito una marcata riduzione, il tasso di mortalità rallenta e ciò consente la sopravvivenza di ceppi microbici più resistenti.

• E’ molto difficile stabilire il punto di morte dei microrganismi: quando avviene? Generalmente quando una cellula, inoculata in brodo fresco, non dà più origine ad una progenie.

18

….by manu!!!

26

MICROBIOLOGIA AMBIENTALEMICROBIOLOGIA AMBIENTALE

PANORAMA sulle TECNICHE PANORAMA sulle TECNICHE

““CLASSICHE E MOLECOLARICLASSICHE E MOLECOLARI”

27

Diversità morfologica dei microrganismi

MORFOLOGIA CELLULARE OSSERVABILE AL MICROSCOPIO28

Monotrico Anfitrico

Lofotrico Peritrico

Numero e disposizione dei flagelli in rapporto alla cellula

Flagello/i:

non visibile al microscopio!!!


MORFOLOGIA CELLULARE 29

Microscopia ottica ed elettronica

MICROSCOPIA = insieme delle tecniche legate all’osservazione di organismi microscopici

30


31


Fonte luminosa

Campione

Obiettivo

Oculare

Fascio di elettroni

Campione

Lente magnetica

Lente obiettivo

Lente proiettore

Immagine schermo fluorescente

Microscopia ottica

Microscopia elettronica a trasmissione(TEM)

32

Concetti chiave1. Ingrandimento.

2. Potere risolutivo: capacità di mostrare due punti adiacenti come distinti.- occhio umano 75-100 m;- microscopio ottico: 0.2 m (200 nm);- microscopio elettronico: 0.2-2 nm.

Il potere risolutivo dipende dalla caratteristiche fisiche del mezzo (luce-fascio di elettroni).


33

Schema: microscopio composto

Tubo metallico

OCULARE-

GENERALMENTE BINOCULARE !!

OBIETTIVO 10X

OBIETTIVO 40X

OBIETTIVO 100X

Ganci

CondensatoreDiaframma

Sorgente di luce

Braccio

TavolinoPorta campione

Vite macrometrica

Vite micrometrica

MESSA A FUOCO

Base microscopio

Ruota obiettivi

34

Principi di base: microscopio composto

Sistema di lenti convergenti:

1. Oculare ed 2. Obiettivo all’estremità di un tubo metallico (160 mm)

- Campione (oggetto) davanti l’ obiettivo → immagine reale-capovolta ed ingrandita

- Immagine reale, capovolta ed ingrandita davanti all’oculare →immagine virtuale, capovolta ed ingrandita

35

Principi di base: microscopio composto

OBIETTIVO ED OCULARELAVORANO INSIEME

PER RISOLVERE L’IMMAGINE

L’oculare “risolve” l’immagine “reale” risolta dall’obbiettivo

10X oculare

10X, 40X,100X obiettivi

INGRANDIMENTO

FISSO

Ingrandimento totale=

Ingr. oculare X Ingr. obiettivo

36

Microscopio composto: obiettivo 100X ad immersione

- L’obiettivo 100X è sempre ad immersione;

- L’obiettivo 100X è retrattatile;

- L’olio ha lo stesso indice di rifrazione del vetro dell’obiettivo .

37

Osservazione in vivo e le colorazioni1. Osservazione in vivo:

- vetrino + goccia campione+ coprioggetto;

- vetrino + goccia campione + inchiostro di china+ coprioggetto;

- vetrino + goccia campione+ coprioggetto.

2. Le colorazioni. I coloranti sono composti organici con differenti affinità

per specifiche componenti cellulari.

Distinguiamo :

A: Coloranti cationici (basici) [ strutture cellulari cariche negativamente, acidi nucleici e

polisaccaridi acidi, COO-] :• blu di metilene, safranina e cristal violetto.

B. Coloranti anionici: (acidi )[ strutture

cellulari citoplasmatiche].

Eosina, Rosso congo, Fucsina acida.

38

Esami in laboratorio

Esami colturaliEsami

colturaliColorazionedi Gram

Colorazionedi Gram

Biologia molecolar

e (?)

Biologia molecolar

e (?)

39

Colorazione di GramFasi della colorazione Struttura della parete

Gram-positivi

Gram-negativi

40

• agar McConkey (Enterobatteri)

• agar sangue (G. vaginalis)

• agar cioccolato (Gonococco)

• agar sale mannite (Stafilococchi)

• agar sangue (Streptococchi )

Esame colturale per batteri

Gram-positivi

Gram-negativi

41

http://dept.kent.edu/biosim/_vti_bin/shtml.dll/bacteria.htm/map

Colorazione di Gram

1884 Hans Christian Gram-Tecnica basata sulle proprietà fisiche della pareta cellulare

42

Gallerie API 20 EGallerie API 20 NEGallerie API NH

Prove biochimiche:TSI agar

Indolo e/oMobilità in SIM agar

Identificazione microbica

Batteri Gram-negativi

43

Gallerie API Staph (bioMérieux)

Identificazione microbica

Staphylococcus aureusMannite+ e Coagulasi+

Test coagulasi Test catalasi

44

(Incubazione a 37° per 2-5 gg)

Lieviti: esame colturale

Sabouraud dextrosio agar

45

Colorazione di Gram

Asciugare all’aria

Fissare alla fiamma

RISULTATO AL MICROSCOPIO?46

Colorazione di Gram

Quali sono Gram positivi e quali Gram negativi?

47

Colorazione di Gram

48

…“mama…”

La colorazione di GRAM è molto utilizzata

in microbiologia clinica, ma poco

sfruttabile in microbiologia ambientale

49

Microscopia ad epifluorescenza

DAPI

SYBR-GREEN

Labels double

DNA strain

A simple-to-use fluorescent stain, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), visualizes nuclear DNA in both living and fixed cells

Confocal microscope images of colonized glass beads. Diatoms (Navicula sp. 1) are seen by the red fluorescence of their chloroplast. Bacteria (P. haloplanktis) are stained with SYBR Green 1. (a) and (d) Diatoms alone; (b) and (e) P. haloplanktis added to the diatom(b) culture after 4 d; (c) and (f) P. haloplanktis added to diatom culture (c) at time zero. Upper panel magnification was 10006 × , lower panel(d) magnification was 23006 ×.

50

• COLTURE DI MICRORGANISMI

La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede

l'impiego dei cosiddetti "terreni" o "mezzi di coltura", con i

quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in

grado di soddisfare le esigenze metaboliche del microrganismo

che si desidera coltivare. Il terreno, prima della semina, deve

essere sterile e contenuto in recipienti sterili dotati di un

sistema di chiusura che garantisca la sterilità del contenuto.

Tutte le operazioni relative alla semina devono essere condotte

osservando precauzioni necessarie a evitare la contaminazione

del terreno ad opera dei batteri presenti nell'ambiente.

51

Colture di microrganismi

RIPRODUCENDO LE CARATTERISTICHE

DELL’AMBIENTE DI ORIGINE è POSSIBILE OTTENERE

DELLE COLTURE E MANTENERE I MICROOGANISMI IN

LABORATORIO PER STUDIARNE LE CARATTERISTICHE

FISIOLOGICHE, L’ATTIVITà ANCHE AL FINE PER

APPLICAZIONI BIOTECNOLOGICHE.

52

MEZZI (TERRENI) DI COLTURA

solido liquido

53

TERRENI DI COLTURA

Terreni sintetici o definiti :

COMPOSIZIONE ESATTA

Terreni complessi :

COMPOSIZIONE non nota, generalmente contengono

Peptoni, idrosilati di carne, caseina etc…

Estratti di carne: contenenti amminoacidi, proteini, peptidi,

nucleotidim vitamine

Estratti di lievito, ricchi di vitamine della famiglia B, essenziali

per il metabolismo cellulare.

Terreni selettivi

Terreni differenziali

Terreni di arricchimento

54

MEZZI (TERRENI) DI COLTURA

The Staphylococcus aureus ferments mannitol and turns the medium yellow. The Serratia marcescens does not grow because of the high salt content.

Streptococcus agalactiae does not grow on MSA because of the high salt content. Staphylococcus epidermidis grows but

does not ferment mannitol.

Esempio di Terreno selettivo:

MANNITOL SALT AGARSelettivo per Staphylococcus spp. e Micrococcaceae;

55

TERRENO DI COLTURA: differenziale

Escherichia coli Formazione di colonie su Acetate Differential Slant. Incubazione in aerobiosi.24 h at 35°C

Shigella flexneri Inibito dall’ acetato.Assenza di crescita Acetate Differential Slant. Incubazione in aerobiosi . 24h a 35 °C

Sodium Chloride 5.0gm

Sodium Acetate 2.0gm

Monoammonium Phosphate

1.0gm

Dipotassium Phosphate

1.0gm

Magnesium Sulfate 0.1gm

Bromothymol Blue 0.08gm

Agar 20.0gm

Final pH 6.7 +/- 0.2 at 25 °C.

56


DIVERSITA MORFOLOGICA DELLE COLONIE IMPORTANZA DEI PIGMENTIE DEI MARGINI DELLE COLONIE

57

PANORAMA SULLA DIVERSITA MORFOLOGICA: LE COLONIE

58

DIVERSITà METABOLICA

DALLA COLONIA

Test biochimici identificativi

59

DIVERSITà METABOLICA

60

LA COLONNA DI WINOGRADSKY

61

SCHEMA di una colonna

Dettaglio batteri sulfurei rossi e verdi, lungo un gradiente di luce

62

PAROLA CHIAVE: GRADIENTEGRADIENTE- DI OSSIGENO- DI LUCE- DI NUTRIENTI (per es ZOLFO)

63

CONTA DEI MICRORGANISMI

A demonstration of a decimal series of dilutions. The 100 sample is a concentrated solution of methylene blue. A 0.2 ml portion of this was added to 1.8 ml (1:9 ratio) of 0.85% saline to create the 1:10 dilution. After mixing, 0.2 ml of the 10-1 dilution was added to a second tube containing 1.8 ml to create the 10 -2 dilution.This was continued to generate the dilution series. (B) A series of pour plates demonstrating the appearance of a viable plate count. The 3 plates show a 10 -7, 10-8,

and 10-9 dilution of a natural sample. Note how the number of colony forming units decreases 10 fold between the plates.

64

CONTA DEI MICRORGANISMI

DAPI, syber green, arancio di acridiniSono colaranti utilizzati anchenella conta di microganismi medianteMicroscopia a fluorescenza

65

MISURA DELL’ATTIVITà DEI MICROORGANISMI

RESPIRAZIONE

Soil is incubated at the required temperature, moisture content, etc. in the main flask and air can be added

through the CO2 absorber in the tube on top of the main flask.

During incubation the CO2 produced by respiration is absorbed into the alkali in the side tube.

This is then titrated to discover the amount of alkali neutralized by the evolved CO2 More air can be added

and the alkali replaced to continue the process of analysis.

66

MISURA DELL’ATTIVITà DI MICROOGANISMI SPECIFICI

AMMONIO E NITRITO OSSIDANTI

67

METANO-OSSIDANTI = METANOTROFI E METILOTROFI

-Ricavano energia dall’ossidazione del metano e di altri composti inorganici del carbonio

CH4 + 2 O2 -----> CO2 + 2 H2O + energy

- enzima chiave metano-ossigenasi

68

Struttura primaria e

secondaria dell’ rRNA 16S di

E.coli

16S RNA RIBOSOMIALE

69

PANOROMA TECNICHE PER LO STUDIO DELLE COMUNITà MICROBICHE

CFU_ colony-forming unitUnità formante colonia

Biolog_example of commercial kit

PLFA: phospholipids fatty acid profile

FISH: Fuorescent in situ Hybridization technique

IS-PCR Intergenic Spacer-Polymerase Chain reaction

70

PLFA: phospholipids fatty acid profile

PLFA analysis is based on the extraction of "signature" lipid biomarkers from the cell membranes and walls of microorganisms. Organic solvents are used to extract the lipids from cells, then the lipids are concentrated and analyzed by GC/MS to identify individual lipids. Certain bacterial groups make "signature" fatty acids, so a profile of the PLFA in a sample can be used to characterize the microbial community according to which fatty acids are found and in what concentrations. Below is an example of the PLFA chromatogram from a typical soil sample and the signature fatty acids that indicate the presence of particular broad groups of organisms 71

reazione di polimerizzazione a catena

REAZIONE DI POLIMERIZZAZIONE A CATENTA (PCR)

Esempi di utilità della PCR :1. Fornisce una riposta sulla presenza-assenza di un determinato gene, specie,

genere,,etcc (microbiologia clinica)2. Aumenta la disponibilità di materiale genetico da studiare ( mare = ambiente

oligotrofico)72

COMPONENTI

TEMPERATURA


73


74

AGAROSIO

PERCENTUALE dipendente

dalla lunghezza del frammento

da caricare

EBOLLIZIONE (microonde)

PREPARAZIONE Cassetta

“versamento”del gel nella

cassetta

ELETTROFORESI

75

ELETTROFORESI

CARICAMENTO CAMPIONI (aggiunta di Loading Buffer)

CORSA TRA ELETTRODI

76

Risultati PCR su gel

1 2 3 4 5 6 7

77

NUOVE TECNICHE: CITOMETRIA DI FLUSSO

78

NUOVE TECNICHE: molecolari

79

Microscopio ad epifluorescenza

80

Microscopio ad epifluorescenza

Schema sorgente di luce1. Globo di quarzo2. e 3. Catodo e Anodo4. Camera di combustione (contenente Hg)5. Arco voltaico

365 nm404434546577613

“linee del mercurio”

81

colorazione fluorescente: DAPI attraversa la membrana cellulare lunghezza d’onda 358 nm visualizzazione cellule vive o fissate microscopia a fluorescenza

[4',6-diamidino-2-phenylindole ]

Campione DAPI+

Microscopio a fluorescenza

“le colorazioni in” Ecologia microbica

82

Microscopio ad epifluorescenza: immagini

DAPI SYBR-GREEN 83

Microscopio ad epifluorescenza e FISH (Fluorescence in situ Hybridization)

84

Microscopio ad epifluorescenza e FISH

85

MICROSCOPIO CONFOCALE

86


Osservazione ad alta risoluzione di un singolo piano del campione.

Intensità luminosa

Segnale elettrico

Digitalizzazione

1 punto = 1 pixel

Specchio dicroicoCoerenza-Alta intensità-Unica λ

87


Spostamento verticale della sezione ottica

Sovrapposizione singoli piani

Ricostruzione 3D

88

Microbiologia : analisi delle acque

- Solo implicazioni di tipo sanitario, ricerca di germi indicatori di inquinamento

89

- Parametri chimici, fisici e microbiologici (batteriologici)

- Tra i microganismi (batteri e protisti, es. Giardia

intestinalis)

- Dai risultati delle analisi → Punteggio → Livelli di

inquinamentoParametro Livello 1 Livello 2 Livello 3 Livello 4 Livello 5

100- OD( % sat)

>10 <20 <30 <50 >50

BOD5 (O2 mg/L)

< 2.5 <4 <8 <15 >15

COD (O2 mg/L)

<5 <10 <15 <25 >25

NH4 (N mg/L) <0.03 <0.10 <0.50 <1.5 >1.5

NO3 (N mg/L) <0.3 <1.5 <5.0 <10.0 > 10

P (mg/L) <0.07 <0.15 <0.3 <0.6 >0.6

Escherichia coli (UFC/100 ml)

<100 >1.000 < 5.000 <20.000 > 20.000

Punteggio 80 40 20 10 5


90


- Conta dei coliformi totali (UFC/ml)

- Conta dei coliformi fecali (UFC/ ml)

- Conta delgi Streptococchi fecali

TERRENO DI COLTURA

T° INC. TEMPO INC.

CONTA BATTERICA

TOTALE

PCA (Plate Agar

Count)

22°C36°C

72h48h

COLIFORMI TOTALI

Membrane endo agar less

36°C 24h

COLIFORMI FECALI

Membrane faecal coliform

44°C 24h

STREPTOCOCCHI FECALI

KF streptococcus

36°C 48h

91

Microbiologia : Coliformi total. Chi sono e come si “cercano”-“Coliforme”: simile ad Escerichia coli, fam. Enterobacteriaceae.- Aerobi o anaerobi facoltativi, G-, non sporigeni, lattosio-fermentanti-“Organismi indicatori" e in genere non sono patogeni- Generi : Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter spp.

-Colore rosso scuro, nel caso di riflesso metallico verdastro

- Escherichia coli….Escherichia coli….92

Microbiologia : Coliformi fecali

- Sinonimo di Coliformi termoresistenti

- Fermentano il lattosio a 44.5-45 °C

93

Microbiologia : Streptococchi fecali - Gram positivi

- Indicatori di inquinamento non recente (vita media>)

- Terreno KF

- Sodio azide (inibitore di altri microrganismi)

- Colonie rosse con alone chiaro attorno

94

Microbiologia : Streptococchi fecali

- Chi sono e come si “cercano”

Species Colonia rossa Alone giallo

Enterococcus faecalis+ +

Enterococcus hirae+ (poor) +

Enterococcus equinus+ (poor) +

Streptococcus pyogenes- -

Streptococcus agalactiae - -

Lactobacillus plantarum- -

Escherichia coli

Enterobacter cloacae

Pseudomonas aeruginosa

95

Microbiologia : metodo delle membrane filtranti

Metodo delle membrane filtranti

N Colonie /100 ml = N (colonie contate) / volume (campione filtrato) X100

96

Analisi microbiologica dei campioni Il numero delle cellule microbiche nel suolo può essere...

Documents

Transcript of Analisi microbiologica dei campioni Il numero delle cellule microbiche nel suolo può essere...